我々は、免疫担当マウスにおける慢性創傷感染を発生させる遅延接種プロトコルを記述する。
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この記事について
サマリー
要約
緑膿菌(P.エルギノーサ)は、特に糖尿病患者および入院患者における慢性創傷感染の設定において、ヒトの健康および疾患に対する関連性を高める主要な院内感染体である。創傷病因の調査とこの病原体に対する新しい治療法の開発を支援するために、慢性感染モデルが緊急に必要とされている。ここでは、完全厚切除傷の24時間後に遅延接種を使用するプロトコルについて説明する。この時点で存在する暫定的な創傷マトリックスの感染は、迅速なクリアランスまたは感染の普及のいずれか、代わりに異物の移植や免疫抑制を必要とせずに7-10日間持続する慢性感染症を確立します。このプロトコルは、ヒトにおける術後感染の典型的な一時的な経過を模倣する。発光P.アルギノーサ株(PAO1:lux)の使用は、P.アルギノーザ創傷感染に対する細菌負担の定量的な毎日の評価を可能にする。この新しいモデルは、細菌病原体の調査および慢性P.緑菌創傷感染に対する新しい治療法の開発に有用なツールである可能性がある。
概要
緑膿菌(P.エルギノーサ)は、ヒトの健康と病気との関連性が高まるグラム陰性の棒状の細菌である。これは、特に免疫不全患者1、2における創傷感染を伴う、無ソコミアル設定における広範な罹患率および死亡率を担う。この病原体の多剤耐性株の出現は、P.アルギノーサ病原性、P.アルギノーサ系抗生物質耐性のメカニズム、およびこの致命的な感染症の予防と治療のための新しい方法に寄与する要因の調査のためのさらなる刺激を提供している3。したがって、これらの研究問題を調査するためのツールとしての慢性創傷感染の動物モデルの必要性はかつてないほど高まっています。
残念なことに、P. エルギノーザ感染の多くの動物モデルは、敗血症による感染症の急速な分解能または急速な減少をシミュレートする傾向があります4,5,これは、これらの感染症のしばしば慢性的な性質を適切にシミュレートしません。この欠点に対処するために、一部のモデルは、寒天ビーズ、シリコーンインプラント、またはアルギン酸ゲル6、7....
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プロトコル
ここに記載されているすべての方法は、スタンフォード大学の機関動物ケアおよび使用委員会(IACUC)によって承認されています。
1. 細菌の作製と増殖
- 研究者の機関的なバイオセーフティ委員会および動物使用委員会のガイドラインに従って、BSL-2の予防措置を講じ、P.エルギノーサおよび動物とすべての作業を行う。P. eeruginosa(マウス接種を含む) に関するすべての手順をバイオセーフティキャビネットで行います。
- P. アルギノーザの発光PAO1:lux株は、要求によって私たちの研究室から入手可能です。ストリークPAO1は、凍結グリセロールストックとして保存され、リソゲニーブロス(LB)寒天上に。発光性PAO1:lux株の場合、LB寒天には選択的抗生物質(100 μg/mLカルベニシリンおよび12.5 μg/mLカナマイシン)が含まれている必要があります。細菌インキュベーターで一晩37°Cで成長する。
- 単離されたコロニーを選び、3ml LB培地、pH 7.4で37°Cで一晩成長する。発光株の場合、ブロスには100 μg/mLカルベニシリンが含まれている必要があります。揺れ、有酸素条件下で成長します。
2. 手順準備
- 手術を行うすべての人員に、清潔なガウン/ラボコート、フェイス....
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結果
luxABCDEレポーターシステム(PAO1:lux)をコードするプラスミドを有するPAO1の発光株を用いて、マウスに切除創を行い、これらの創傷をプランクトンP.エルギノーサ24時間経過後に接種し、経時の細菌負担を測定した(図1および図2)。撮像光学系を用いて得られた代表的な画像は、このモデルが検出可能な発光をもたらすことを示している(図3A)。感染は接種後3日目にピークを迎え、生物発光とコロニー数の両方に基づいて接種後7日間持続した(図3B-C)。このモデルを使用して、我々は確実に細菌の株とマウスの背景に応じて7-10 ays持続する創傷を生成することができます。創傷から分離された細菌の培養は、検出された発光と相関するCFU/創傷を定量することを示し.......
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ディスカッション
我々は、新しい遅延接種P.アルギノーザ創傷感染モデルを開発した。切除傷後24時間まで細菌による接種を遅らせるという戦略は、1週間の時間枠にわたって創傷感染の評価を可能にする。P. eeruginosaの発光株を用いることによって、感染経過過程を通して感染進行を追跡することが可能である。他のP.緑口症感染モデルと比較して感染の長いコースは、宿主と病原体の相互作用とP.緑口創傷感染症を標的とする新しい治療法を研究するための新しい機会を可能にする。例えば、我々はすでにこのモデルを使用して、P.アルギノーサが宿主免疫系を回避することを可能にする抗ウイルス免疫応答を刺激する際のPfバクテリオファージの役割を実証した14。
切除創手術と細菌接種の間に24時間の回復時間を含めることは、この創傷感染モデルにおいて重要なステップである。これは、動物が感染する前に創傷手術から回復することを可能にし、少なくとも7日間生き残る能力に役割を果たす可能性が高い。さらに、接種.......
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開示事項
著者らは、開示する競合する財政的利益を持っていません。
謝辞
pUT-Tn5-EM7-lux-Km1発光構築ベクトルは、J.ハーディからの優雅な贈り物でした。回路図はBioRender.comで作成されました。私たちは、創傷感染モデルに関する彼らのアドバイスのためにG.ガートナーの研究室に感謝します。また、スタンフォード・イン・ビボ・イメージングイノベーションセンターのT・ドイルの技術的専門知識に感謝します。この作品は、R21AI133370、R21AI133240、R01AI12492093の助成金によってサポートされ、スタンフォードSPARK、フォーク医学研究信託、嚢胞性線維症財団(CFF)からP.L.B.C.R.Dへの助成金はT32AI007520によってサポートされました。ガビラン・スタンフォード大学大学院理工学研究科とルベール・ストリアー・バイオ-Xスタンフォード学際大学院フェローシップがJ.M.S.を支援しました。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 0.9%塩化ナトリウム注射 | ホスピーラ | 2484457 | |
| 18 G x 1 滅菌針 | BD | 305195 | |
| 25 G x 1 1/5 滅菌針 | BD | 305127 | |
| アルコール スワブ | BD | 326895 | |
| オーラ イメージング ソフトウェア | スペクトル機器 イメージング | n/a | |
| ベタジン | パデュー フレデリック カンパニー | 19-065534 | |
| Buprenorphine SR LAB | Zoopharm | n/a | |
| C57BL/6J 雄マウス | ジャクソン研究所 | 000664 | |
| 使い捨て生検パンチ、6mm | Integra | 33-36 | |
| 細かいはさみ - 炭化 | ファイン サイエンス ツール | 14568-09 | |
| ガラス ビーズ乾燥滅菌器 | ハーバード デバイス | 61-0183 | |
| 粒状寒天 | ッシャーバイオ試薬 | BP9744 | |
| 加熱パッド | ミリヤード | 804879481218 | |
| インスリン注射器 28 G ニードル付き | BD | 329461 | |
| Lago X イメージングシステム | スペクトル機器 イメージング | n/a | |
| LB ブロス | フィッシャーバイオ試薬 | BP1426 | |
| Leur-Lok 1 mL シリンジ | BD | 309628 | |
| ミニ アルコ アニマル トリマー | ウォール プロフェッショナル | 919152 | |
| ネア ヘア リムーバル ローション ベビー オイル | 教会とドワイト | n/a | どの薬局でも入手可能 |
| 八角形 鉗子 | ファイン サイエンス ツール | 11041-08 | |
| ペトリ皿 | ファルコン | 351029 | |
| リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) 1x | コーニング | 21-040-CV | |
| プレス&シールラップ | れしい | n / aSafetyGlide | |
| インスリンシリンジ、30G針付き | BD | 305934 | |
| Safetyglideインスリンシリンジ、1/2 mL、30 G x 5/16 TW | BD | 305934 | |
| スケール | オーハウススカウトプロ | SP202 | |
| 補助食品 | ヘンリーシャインアニマルヘルス | 29908 | |
| ガダーム、6 cm x 7 cm | 3M | 1624W |
参考文献
- Sen, C. K., et al. Human skin wounds: a major and snowballing threat to public health and the economy. Wound Repair and Regeneration. 17 (6), 763-771 (2009).
- Serra, R., et al. Chronic....
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再版と許可
