Summary
我々は、免疫担当マウスにおける慢性創傷感染を発生させる遅延接種プロトコルを記述する。
Abstract
緑膿菌(P.エルギノーサ)は、特に糖尿病患者および入院患者における慢性創傷感染の設定において、ヒトの健康および疾患に対する関連性を高める主要な院内感染体である。創傷病因の調査とこの病原体に対する新しい治療法の開発を支援するために、慢性感染モデルが緊急に必要とされている。ここでは、完全厚切除傷の24時間後に遅延接種を使用するプロトコルについて説明する。この時点で存在する暫定的な創傷マトリックスの感染は、迅速なクリアランスまたは感染の普及のいずれか、代わりに異物の移植や免疫抑制を必要とせずに7-10日間持続する慢性感染症を確立します。このプロトコルは、ヒトにおける術後感染の典型的な一時的な経過を模倣する。発光P.アルギノーサ株(PAO1:lux)の使用は、P.アルギノーザ創傷感染に対する細菌負担の定量的な毎日の評価を可能にする。この新しいモデルは、細菌病原体の調査および慢性P.緑菌創傷感染に対する新しい治療法の開発に有用なツールである可能性がある。
Introduction
緑膿菌(P.エルギノーサ)は、ヒトの健康と病気との関連性が高まるグラム陰性の棒状の細菌である。これは、特に免疫不全患者1、2における創傷感染を伴う、無ソコミアル設定における広範な罹患率および死亡率を担う。この病原体の多剤耐性株の出現は、P.アルギノーサ病原性、P.アルギノーサ系抗生物質耐性のメカニズム、およびこの致命的な感染症の予防と治療のための新しい方法に寄与する要因の調査のためのさらなる刺激を提供している3。したがって、これらの研究問題を調査するためのツールとしての慢性創傷感染の動物モデルの必要性はかつてないほど高まっています。
残念なことに、P. エルギノーザ感染の多くの動物モデルは、敗血症による感染症の急速な分解能または急速な減少をシミュレートする傾向があります4,5,これは、これらの感染症のしばしば慢性的な性質を適切にシミュレートしません。この欠点に対処するために、一部のモデルは、寒天ビーズ、シリコーンインプラント、またはアルギン酸ゲル6、7、8などの異物の移植を利用する。他のモデルは、高度な年齢、肥満、または糖尿病のために免疫不全であるマウスを使用し、またはシクロホスファミド誘発性好中球減少症9、10、11、12などの薬理学的手段を介して使用する。しかし、異物や免疫が損なわれた宿主の使用は、局所的な炎症過程を変化させる可能性が高く、それ以外の場合は正常な免疫系を有する宿主における慢性創傷感染に関与する病態生理学の理解を得ることは困難である。
切除後の細菌による接種の遅延を伴うマウスにおけるP.アルギノーザ創傷感染の慢性モデルを開発した。接種の遅れにより、細菌の負担を少なくとも7日間まで評価する実験が可能になります。このモデルは、P.緑菌慢性感染症の病因と新しい治療法の両方を調査するための新しい機会を開きます。
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Protocol
ここに記載されているすべての方法は、スタンフォード大学の機関動物ケアおよび使用委員会(IACUC)によって承認されています。
1. 細菌の作製と増殖
- 研究者の機関的なバイオセーフティ委員会および動物使用委員会のガイドラインに従って、BSL-2の予防措置を講じ、P.エルギノーサおよび動物とすべての作業を行う。P. eeruginosa(マウス接種を含む) に関するすべての手順をバイオセーフティキャビネットで行います。
- P. アルギノーザの発光PAO1:lux株は、要求によって私たちの研究室から入手可能です。ストリークPAO1は、凍結グリセロールストックとして保存され、リソゲニーブロス(LB)寒天上に。発光性PAO1:lux株の場合、LB寒天には選択的抗生物質(100 μg/mLカルベニシリンおよび12.5 μg/mLカナマイシン)が含まれている必要があります。細菌インキュベーターで一晩37°Cで成長する。
- 単離されたコロニーを選び、3ml LB培地、pH 7.4で37°Cで一晩成長する。発光株の場合、ブロスには100 μg/mLカルベニシリンが含まれている必要があります。揺れ、有酸素条件下で成長します。
2. 手順準備
- 手術を行うすべての人員に、清潔なガウン/ラボコート、フェイスマスク、ヘアネット、手袋を着用してもらいます。
- はさみや鉗子を含むすべての外科用具をオートクレーブ。無菌技術を使用して、動物間のツールを殺菌します。
- エタノールで外科テーブルをきれいにし、きれいな外科分野を準備しなさい。
3.脱毛
- 1%~3%のイゾフルランを用いて8~12週齢のC57BL/6Jマウスを麻酔する。調査官は、イソフルランを使用する場合、麻酔のための彼らの機関の獣医スタッフのガイドラインに従う必要があります。
- 麻酔を開始するには、1%~3%のイソファフルランを送り、酸素の流量を1.5L/分に調整します。
- マウスのつま先をつまんで麻酔の深さを評価します。マウスが刺激に反応しなくなったら、誘導室から取り出し、鼻をイソファフルランのノーズコーンに入れた状態で外科用ベンチに置きます。
- 両眼に眼潤滑剤を塗布します。
- マウスを秤量して、ベースラインプリプロシージャ重量を得る。
- マウスを起こりやすい位置に置きます。あらかじめ温めた無菌の0.9%の塩化ナトリウム、各脇腹に250μL、合計500μLのマウスを皮下に注入します。
- 電動の剃り子を使ってマウスの後ろを剃ります。傷の毛髪汚染を防ぐために、シェービングは外科の場所とは異なる場所で起こるべきである。
- 脱毛ローションの薄い層を適用します。ローションを20~60sに座らせ、ガーゼをぬるま湯で髪と余分なローションを取り除きます。脱毛後、切除創術に進む。
4. 完全な厚さ切除傷手術
- マウスの中間の部分に25G針を使用して、皮下0.6~1mg/kgの徐放性ブプレノルフィンを注射します。遅い放出ブプレノルフィンは48-72時間の上に痛みの軽減を提供する。
- 手術部位を消毒する。滅菌ベタジン綿棒で後面を拭きます。余分なベタジンを滅菌アルコール綿棒で拭きます。これは、3回(ベタジンとアルコールの間で交互に)、円形の方法で中心から端に移動することによってスワッピングを行う必要があります。その地域を空気乾燥させます。
- 滅菌ガーゼまたはプラスチッククリングラップを使用して、外科現場を囲むドレープを作成します。
- 肌を大きく伸ばします。滅菌6mmの直径の皮膚生検パンチを使用して、左下表皮を通して初期切開を行います。右の後表皮を繰り返します。
- 鉗子を使用して、左輪郭の巻き傷口の中心から皮膚をテントに入れます。はさみを使用して表皮層と真皮層を切除する。左右に輪郭を描いた創傷領域を繰り返して、対称的な切除傷を作り出す。
- 創傷を50μLの滅菌生理液で洗浄します。手術部位と周囲の皮膚を空気乾燥させます。次に、傷とドーサムを透明フィルムドレッシングで覆う。
- マウスを清潔なケージに戻します。ケージあたり1匹の動物を収容します。
- ケージをヒーティングパッドに置き、マウスが目を覚ますまで監視します。
- 複数の動物に対して上記の手術を行う場合は、ホットビーズ滅菌装置を使用して、動物間のすべての外科器具を清掃する。
- マウスが外科的処置から回復し、細菌の接種に進む前に創傷に対する暫定的な創傷マトリックスの形成のために24時間を許可する。
5. P. アルギノーザとの接種
- PAO1:lux培養を100 μg/mLカルベニシリンを含むLB培地の75 mLでOD 600 = 0.05に希釈し、培養が初期指数相(OD600≈ 0.3)になるまで細菌を増殖させます。この時間は約 2 ~ 3 時間かかります。
- 希釈 PAO1:ルクスの濃度 (7.5 ± 2.5) x 102 CFU/mL.実験後に十分な容積を確保し、めっきを可能にするために、過剰な接種を準備してください。施設間の輸送(すなわち、ラボからビバリウムへ)を輸送する場合は、明確にバイオハザードと記された漏れ防止ボックスに二重封じ込めを使用してください。
- 動物バイオセーフティレベル2(ABSL-2)承認された生物学的安全キャビネット(BSC)で承認された個人保護具を使用してP.エルギノーサとマウスとすべての作業を行います。計量スケールなどの再利用可能な機器は、汚染を防ぐためにしがみつくラップで覆われるべきです。
- 上記のように3%のイソファフルランを用いた麻酔。マウスの重量を量り、重量を記録します。あらかじめ温めた無菌の0.9%の塩化ナトリウム、各脇腹に250μL、合計500μLのマウスを皮下に注入します。
- マウスの透明フィルムドレッシングが一晩外れた場合は、結果のかさぶたを慎重に取り除き、新しいドレッシングを着てください。
- 500 μLのツベルキュリン27G安全キャップシリンジを使用して、各創傷に透明フィルムドレッシングを通してPAO1:lux懸濁液40μLを注入します。異なるマウスは、非接種/PBS創傷コントロールに対して、反対側からの交差汚染を防ぐために使用されるべきである。
- マウスをヒーターパッドのケージに戻し、目が覚めるまで監視します。すべてのマウスは、クロスコンタミネーションを防ぐために、別々のケージに個別に収容する必要があります。
- ケージの床に食品ペレットの間に挟まれた高カロリーの栄養補助食品ペーストを提供します。
- 残りの接種を使用してLB寒天プレートをストリークします。コロニーを数え、投与する菌の数を確認する。
6. 感染した創傷の生体内イメージング
- 二次容器の使用を含め、イメージング機器との間でマウスを輸送するためのBSL-2封じ込めプロトコルに従ってください。マウスを誘導室や画像器具に移す際に、動物の寝具を転写したり、落下したりしないように注意してください。
- ステップ 3.1 で説明したように、吸入 1% – 3% イソファフルランを誘導チャンバに吸入してマウスの麻酔を誘導します。
- マウスが麻酔されたら、イソファランノーズコーンに鼻を持つ光学イメージングシステムのイメージングチャンバー内の起こりやすい位置に置きます。
- ソフトウェアプログラムを開きます。
- この取得パラメータは、同時に画像化された動物の数と生物発光の強度に基づいて変化する。設定する基本パラメータには、露出時間、ビン分割、f/ストップ、視野(FOV)などがあります。デフォルトの開始設定は、露出時間 30 秒、ビニングロー (2)、f/stop 1.2、および FOV 25 です。研究者のニーズに応じて、必要に応じてこれらの設定を調整します。
- イメージングプログラムを使用して発光データを解析します(材料の表を参照)。発光は、マウスのカラー写真に重ね合った疑似色画像として表される。
- 創傷部位に関心領域(ROI)を作成し、検出された平均フラックス(フォトン/秒)を測定します。データは放射輝度(フォトン/秒/cm²/steradian)として報告することもできますが、カメラからのイメージングプラットフォームの距離がイメージング間で一定である限り、フラックスで十分です。
- 画像処理プラットフォーム上のランダムな領域で ROI を作成して、背景を測定します。フォトン/秒の背景番号を減算します。
- データをスプレッドシートにエクスポートして、さらに詳しく分析します。
- 感染進行を追跡するために、上記のようにイメージングを毎日行う。
7. 術後管理
- 研究者のIACUCプロトコルによって設定されたガイドラインに従ってマウスを監視する。最初の4日間、実験終了まで1日おきにすべてのマウスを毎日監視します。BSCでの最初の4日間の手術後のマウスを1日1回計量する。感染後1日と2日目に皮下0.9%の塩化ナトリウムを250μL注入する。
- 腰痛の姿勢、不器用なコート、無気力、呼吸困難、顔面の悲しみ、体重減少など、マウスの痛み/苦痛の兆候を確認してください。
- 動物が健康状態を悪化させる兆候を示す場合は、獣医師に相談してください。痛み/苦痛の悪化の兆候と20%以上の減量を示すように見えるマウスは安楽死させるべきです。
8. 創傷切除
- 実験終了時に、CO2吸入を用いてマウスを屠殺し、続いて頸部脱臼を行った。施設のABSL-2プロトコルに従って動物の死体を処分してください。
- BSCで滅菌はさみと鉗子を使用して傷ついたベッドを物品化する。1.5 mLポリプロピレンチューブに1mL滅菌PBSに各創傷床を入れる。傷口組織をはさみでミンチします。すべての創傷は、感染していると見なされない場合でも、ASBL-2として扱われるべきである。
- 4°Cで2時間300rpmでシェーカーをインキュベートする。10sの各チューブをボルテックスし、PBS中の細菌廃液を連続的に希釈する。希釈した細菌排水をLB寒天にプレートして、細菌の負担を列挙します。
- 創傷内の発光シグナルがバックグラウンド発光を上回り、創傷流出液で、PBSを制御する創傷よりも多くの細菌が検出された場合に感染した創傷を考慮する。
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Representative Results
luxABCDEレポーターシステム(PAO1:lux)をコードするプラスミドを有するPAO1の発光株を用いて、マウスに切除創を行い、これらの創傷をプランクトンP.エルギノーサ24時間経過後に接種し、経時の細菌負担を測定した(図1および図2)。撮像光学系を用いて得られた代表的な画像は、このモデルが検出可能な発光をもたらすことを示している(図3A)。感染は接種後3日目にピークを迎え、生物発光とコロニー数の両方に基づいて接種後7日間持続した(図3B-C)。このモデルを使用して、我々は確実に細菌の株とマウスの背景に応じて7-10 ays持続する創傷を生成することができます。創傷から分離された細菌の培養は、検出された発光と相関するCFU/創傷を定量することを示した(図3D)。最後に、実証可能で定量化可能なP.アルギノーザ感染にもかかわらず、マウスは少なくとも7日間生存した。感染直後に最初の急速な体重減少があったが、生理食剤注射および栄養補給は体重回復をもたらした(図3E)。最後に、創傷の50%がPAO1に持続的に感染する接種量を計算した。計算されたIC50値は、〜7.7 x 102 CFU/mLであった。104 CFU/mLより高い用量は100%の感染率をもたらした(図3F)。これらの結果は、以前にパブリッシュされたデータ13から適合した。
図1:生物発光P.アルギノーザによる遅延接種による切除フル厚創傷感染モデルを示す模式図。ストリークPAO1:日-2のルクス。日-1にコロニーを選択し、LBスープで一晩成長します。日-1に切除創手術を行う。0日目、PAO1:luxを透明フィルムドレッシングを通して創傷床に注入することにより接種する。接種後に生物発光イメージングを行う。7-10日目を通して、毎日の画像処理を繰り返します。7-10日目に,動物を犠牲にし,傷を収穫する。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:切除創手術の概略図。脱毛とアルコールとベタジンで皮膚の殺菌後、6mmの生検パンチを使用して、左右のドーサムの表皮を通して最初の切開を行います。はさみと鉗子を使用して、皮膚層と表皮層を除去します。PBSで洗います。透明なドレッシングで覆います。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3:P.アルギノーザ創傷感染は、感染の7日間を介して検出され得る。(A) PAO1に感染したマウスの代表的な画像:切除傷上の生物発光オーバーレイを有するルクス。(B) 創傷細菌の負担を反映する発光シグナル。N = 6創傷。接種: 105 CFU/mL PAO1.(C) PAO1:lux感染創傷のインビボ発光シグナルおよび細菌CFUの線形退行分析は、細菌の負担の範囲を可能にするために105 CFU/mLで4〜7日間の接種後に収集した。(D) 105 CFU/mL PAO1:lux に感染したマウスにおけるCFU/創傷における細菌負担(E) 体重変化 (T=-1) N =4マウス/群に対する創傷切除手術前の体重変化。図は5~95パーセンタイルの箱ひげ図です。統計は、シダックの多重比較で修正された双方向分散分析(ANOVA)です。(F) PAO1の3日間のIC50の計算に使用された創傷感染率の非線形退縮分析すべてのグラフはn≥3の実験を代表する。この図は、2019年13年にSweereらから変更されました。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
我々は、新しい遅延接種P.アルギノーザ創傷感染モデルを開発した。切除傷後24時間まで細菌による接種を遅らせるという戦略は、1週間の時間枠にわたって創傷感染の評価を可能にする。P. eeruginosaの発光株を用いることによって、感染経過過程を通して感染進行を追跡することが可能である。他のP.緑口症感染モデルと比較して感染の長いコースは、宿主と病原体の相互作用とP.緑口創傷感染症を標的とする新しい治療法を研究するための新しい機会を可能にする。例えば、我々はすでにこのモデルを使用して、P.アルギノーサが宿主免疫系を回避することを可能にする抗ウイルス免疫応答を刺激する際のPfバクテリオファージの役割を実証した14。
切除創手術と細菌接種の間に24時間の回復時間を含めることは、この創傷感染モデルにおいて重要なステップである。これは、動物が感染する前に創傷手術から回復することを可能にし、少なくとも7日間生き残る能力に役割を果たす可能性が高い。さらに、接種前の仮創傷マトリックスの形成を支持し、透明フィルムドレッシングと組み合わせて、バイオフィルム形成に資する環境を提供する。このモデルの開発中に一連の探索実験を行い、創傷と接種の間の異なる時間を調べる。私たちの経験では、傷ついた後の即時接種は、しばしば敗血症および死をもたらす。逆に、48時間以降の時点での接種は、マウス間および同じマウス上の創傷間の異質性の容認できないレベルにつながった。図3Aに明らかなように、感染した創傷の細菌負荷には、24-hの遅延接種があっても、ある程度の不均一性が依然として予想される可能性がある。これを補う1つの方法は、各実験で複数の動物を使用することです。
このプロトコルのユニークな側面は、他のいくつかの創傷モデルで行われているように、正中線の下に皮膚を折りたたんでパンチスルーして2つの二国間創傷を作成するのではなく、独立して2つの創傷の切除である。この折りたたみ方法は、きれいなマージンを持つ対称的な創傷を作り出すためにも有効であることがわかった。しかし、この方法で治療されたマウスは、典型的には細菌接種後すぐに敗血症になり、死亡した。これは、この折りたたみ法が真皮のパンニクスカルノーサス(ヒトに存在しないマウスの皮膚の下にある筋肉の薄い層)を取り除くためであると考えています。この障壁は、細菌の普及を防ぐのに役立つかもしれないと推測しています。
このプロトコルの重要なコンポーネントは、過剰な毛髪が超感染のためのニダスを提供し、透明フィルムドレッシングの付着を妨げる可能性があるとして、外科部位からの十分な脱毛である。私たちは、脱毛クリームに加えてシェービングは、完全に暖かい水でクリームを洗い流すが、最小限の皮膚刺激で最適な脱毛を提供することを発見しました。
もう一つの不可欠な要因は、術後および感染後のコースの最初の数日間の栄養サポート、水分補給、および疼痛制御である。これに対処するために、1日目と0日目に皮下0.9%の塩化ナトリウム500μLを投与し、1日目と2日目に250μLを投与します。また、切除創手術時にマルチビタミンとカロリー液体ゲルサプリメントを供給します。図3Eに示すように、これらの措置は3日目までに体重を十分に回復することを可能にする。鎮痛に関しては、切除創術の前に与えられた持続放出0.5mg/kgブプレノルフィンが72時間に十分な疼痛制御を提供することを発見したが、個々のマウスにおける苦痛の所見に基づいて保証されれば、追加用量を与えることができる。
7-10日に及ぶP.緑細種創傷感染のモデルは、より急性の感染モデルよりも大きな利点であるが、これはまだより多くの慢性感染症を含む特定の研究の質問に答えるために十分ではないかもしれない。この制限の理由の 1 つは、PAO1:lux 株のP. eeruginosaの発光シグナルが 2 ~3 日目にピークを迎える (図 3B)。〜7日後にルシフェラーゼシグナルが信頼できなくなる。このため、LBプレート上の創傷液をめっきし、CFUsを数えて実験終了時に各創傷の感染を確認することで細菌を定量化した。このモデルのもう 1 つの欠点は、in vivo イメージング システムの要件であり、一部のラボではアクセスできない場合があります。この障害を回避する1つの方法は、非発光野生型細菌株を使用することです。これにより、研究者はこの慢性感染モデルを利用することができ、上記で示したように、実験の終わりに細菌CFUsを定量化することができます。
我々は、7-10日に及ぶ実験を可能にする遅延接種P.緑細血管創傷感染の新しいモデルを記述した。このモデルは、P. eeruginosaとの宿主病原体相互作用を評価し、新しい治療法の開発に役立ちます。このモデルは、黄色ブドウ球菌などの他の創傷病原体への適応、ならびに他の病原体と組み合わせたP.エルギノーザを含む多微生物感染症を含む、複数の将来の方向性の可能性を有する。
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Disclosures
著者らは、開示する競合する財政的利益を持っていません。
Acknowledgments
pUT-Tn5-EM7-lux-Km1発光構築ベクトルは、J.ハーディからの優雅な贈り物でした。回路図はBioRender.comで作成されました。私たちは、創傷感染モデルに関する彼らのアドバイスのためにG.ガートナーの研究室に感謝します。また、スタンフォード・イン・ビボ・イメージングイノベーションセンターのT・ドイルの技術的専門知識に感謝します。この作品は、R21AI133370、R21AI133240、R01AI12492093の助成金によってサポートされ、スタンフォードSPARK、フォーク医学研究信託、嚢胞性線維症財団(CFF)からP.L.B.C.R.Dへの助成金はT32AI007520によってサポートされました。ガビラン・スタンフォード大学大学院理工学研究科とルベール・ストリアー・バイオ-Xスタンフォード学際大学院フェローシップがJ.M.S.を支援しました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.9% Sodium Chloride injection | Hospira | 2484457 | |
| 18 G x 1 sterile needle | BD | 305195 | |
| 25 G x 1 1/5 sterile needle | BD | 305127 | |
| Alcohol swab | BD | 326895 | |
| Aura Imaging Software | Spectral Instruments Imaging | n/a | |
| Betadine | Purdue Frederick Company | 19-065534 | |
| Buprenorphine SR LAB | Zoopharm | n/a | |
| C57BL/6J male mice | The Jackson Laboratory | 000664 | |
| Disposable biopsy punch, 6mm | Integra | 33-36 | |
| Fine scissors - Tungsten Carbide | Fine Science Tools | 14568-09 | |
| Glass Bead Dry Sterilizer | Harvard Apparatus | 61-0183 | |
| Granulated Agar | Fisher BioReagents | BP9744 | |
| Heating Pad | Milliard | 804879481218 | |
| Insulin syringe with 28 G needle | BD | 329461 | |
| Lago X Imaging System | Spectral Instruments Imaging | n/a | |
| LB broth | Fisher BioReagents | BP1426 | |
| Leur-Lok 1 mL syringe | BD | 309628 | |
| Mini Arco Animal Trimmer | Wahl Professional | 919152 | |
| Nair Hair Removal Lotion with Baby Oil | Church and Dwight | n/a | Available at any pharmacy |
| Octagon Forceps | Fine Science Tools | 11041-08 | |
| Petri dish | Falcon | 351029 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) 1x | Corning | 21-040-CV | |
| Press and Seal Cling Wrap | Glad | n/a | |
| SafetyGlide Insulin syringe with 30 G needle | BD | 305934 | |
| Safetyglide Insulin syringe, 1/2 mL, 30 G x 5/16 TW | BD | 305934 | |
| Scale | Ohaus Scout Pro | SP202 | |
| Supplical Nutritional Supplement | Henry Schein Animal Health | 29908 | |
| Tegaderm, 6 cm x 7 cm | 3M | 1624W |
References
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