Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Immunology and Infection

En forsinket vaccination Model af kronisk Pseudomonas aeruginosa Sårinfektion

doi: 10.3791/60599 Published: February 20, 2020
* These authors contributed equally

Summary

Vi beskriver en forsinket vaccinationsprotokol til generering af kroniske sårinfektioner hos immunkompetente mus.

Abstract

Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa) er en stor nosokomiel patogen af stigende relevans for menneskers sundhed og sygdom, især i fastsættelsen af kroniske sårinfektioner hos diabetiske og indlagte patienter. Der er et presserende behov for kronisk infektion modeller til støtte i undersøgelsen af sårpatogenese og udvikling af nye behandlingsformer mod dette patogen. Her beskriver vi en protokol, der bruger forsinket vaccination 24 timer efter fuld tykkelse excisional sårede. Infektionen af den midlertidige sårmatrix, der er til stede på dette tidspunkt, forebygger enten hurtig rydning eller spredning af infektion og etablerer i stedet kronisk infektion, der varer 7-10 dage uden behov for implantation af fremmede materialer eller immunsuppression. Denne protokol efterligner en typisk tidsmæssig forløb af postoperativ infektion hos mennesker. Brugen af en selvlysende P. aeruginosa stamme (PAO1:lux) giver mulighed for kvantitativ daglig vurdering af bakteriel byrde for P. aeruginosa sårinfektioner. Denne nye model kan være et nyttigt redskab i undersøgelsen af bakteriel patogenese og udvikling af nye behandlingsformer for kroniske P. aeruginosa sårinfektioner.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa) er en Gram-negativ stang-formet bakterie med stigende relevans for menneskers sundhed og sygdom. Det er ansvarlig for omfattende sygelighed og dødelighed i nosokomielle indstillinger, især involverer sårinfektioner hos immunkompromitterede patienter1,2. Fremkomsten af multiresistente stammer af denne patogen har givet yderligere impulser til undersøgelse af faktorer, der bidrager til P. aeruginosa virulens, mekanismer af P. aeruginosa antibiotikaresistens, og nye metoder til forebyggelse og behandling af denne dødelige infektion3. Som sådan har behovet for dyremodeller for kronisk sårinfektion som redskaber til at undersøge disse forskningsspørgsmål aldrig været større.

Desværre, mange dyremodeller af P. aeruginosa infektion tendens til at simulere akut infektion med hurtig opløsning af infektion eller hurtig tilbagegang på grund af sepsis4,5, som ikke i tilstrækkelig grad simulere de oftentimes kroniske karakter af disse infektioner. For at løse denne ulempe, nogle modeller udnytte implantation af fremmedlegemer såsom agar perler, silikone implantater, eller alginat geler6,7,8. Andre modeller bruger mus, der er immunkompromitterede på grund af fremskreden alder, fedme, eller diabetes, eller gennem farmakologiske midler såsom cyclophosphamid-induceret neutropeni9,10,11,12. Men enten brugen af fremmede materialer eller immun kompromitteret værter sandsynligvis ændrer den lokale inflammatoriske proces, hvilket gør det vanskeligt at få en forståelse af patofysiologi involveret i kroniske sårinfektioner i værter med ellers normale immunforsvar.

Vi har udviklet en kronisk model af P. aeruginosa sårinfektion i mus, der indebærer forsinket podning med bakterier efter excisional sårede. Forsinket vaccination giver mulighed for eksperimenter, der vurderer bakteriel byrde, der strækker sig ud til mindst 7 dage. Denne model åbner nye muligheder for at undersøge både patogenese og nye behandlinger af P. aeruginosa kroniske infektioner.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Alle metoder, der er beskrevet her, er blevet godkendt af Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) på Stanford University.

1. Fremstilling og vækst af bakterier

  1. Udfør alt arbejde med P. aeruginosa og dyr med BSL-2 forholdsregler pr forskerens institutionelle biosikkerhedsudvalg og retningslinjer for dyrebrugsudvalget. Gør alle trin, der er beskrevet her involverer P. aeruginosa, herunder musevaccination, i en biosikkerhed kabinet.
  2. Den selvlysende PAO1: lux stamme af P. aeruginosa er tilgængelig fra vores laboratorium efter anmodning. Streak PAO1, gemt som frosne glycerol lager, på Lysogeny Bouillon (LB) agar. For den selvlysende PAO1:lux-stamme skal LB agar indeholde selektive antibiotika (100 μg/ml carbenicillin og 12,5 μg/mL kanamycin). Vokse ved 37 °C natten over i en bakteriekuvøse.
  3. Vælg en isoleret koloni og vokse natten over ved 37 °C i 3 ml LB medium, pH 7.4. For selvlysende stammer skal bouillon indeholde 100 μg/ml carbenicillin. Vokse under rystende, aerobe forhold.

2. Forberedelse af proceduren

  1. Har alt personale, der udfører kirurgi bære en ren kjole / Lab frakke, ansigtsmaske, hår net, og handsker.
  2. Autoklave alle kirurgiske værktøjer, herunder saks og pincet. Brug aseptisk teknik til at sterilisere værktøjer mellem dyr.
  3. Rengør det kirurgiske bord med ethanol og forbered et rent kirurgisk felt.

3. Fjernelse af hår

  1. Bedøve 8-12 uger gamle C57BL/6J mus ved hjælp af 1%-3% isofluran. Efterforskere bør følge deres institutions veterinærpersonale retningslinjer for anæstesi, når du bruger isofluran.
    1. Start anæstesi ved at levere 1%-3% isofluran og justere ilt strømningshastigheden til 1,5 L/ min. Placer musen i induktionkammer.
    2. Knib musens tå for at vurdere anæstesidybden. Når musen ikke længere reagerer på stimulering, skal du fjerne den fra induktionskammeret og placere den på den kirurgiske bænk med næsen i isofluran næsekeglen.
    3. Påfør okulær smøremiddel på begge øjne.
  2. Afvej musen for at opnå en baseline pre-procedure vægt.
  3. Placer musen i liggende position. Injicer musen subkutant med forvarmet steril 0,9% natriumchlorid, 250 μL ved hver flanke for i alt 500 μL.
  4. Barber musens rygområde ved hjælp af en elektrisk barbermaskine. Barbering bør forekomme på et andet sted end den kirurgiske station for at forhindre hårforurening af såret.
  5. Påfør et tyndt lag af hårfjerning lotion. Lad lotion sidde i 20-60 s. Fjern hår og overskydende lotion med gaze fugtet i varmt vand. Efter hårfjerning, gå videre til den excisional såring procedure.

4. Fuld tykkelse excisional sår kirurgi

  1. Tilføres vedvarende frigivelse buprenorphin 0,6-1 mg/kg subkutant ved hjælp af en 25 G nål i midten af ryg-dorsale område af musen. Langsom frigivelse buprenorphin giver smertelindring over 48-72 h.
  2. Desinficere operationsstedet. Tør rygoverfladen af med en steril betadinpodning. Tør overskydende betadin med en steril alkohol podning. Dette bør udføres 3 gange (skiftevis mellem betadin og alkohol), swabbing ved at flytte fra midten i en cirkulær måde til kanten. Lad området lufttørre.
  3. Create a drape surrounding the surgical site using sterile gauze or plastic cling wrap.
  4. Stræk huden stram caudally. Brug en steril 6-mm diameter hud biopsi punch til at gøre en indledende snit gennem venstre rygepidermis. Gentag på højre ryg epidermis.
  5. Brug pincet til telt huden fra midten af venstre skitserede sår område. Punktafgifter epidermal og dermal lag ved hjælp af saks. Gentag på højre skitserede sår område for at skabe symmetriske excisional sår.
  6. Vask sår med 50 μL steril saltvand. Lad operationsstedet og det omgivende hud lufttørre. Derefter dække sår og dorsum med en gennemsigtig film dressing.
  7. Placer musen tilbage i et rent bur. Hus 1 dyr pr bur.
  8. Placer buret på en varmepude og skærm, indtil musen vågner.
  9. Når du udfører ovenstående operation på flere dyr, skal du bruge en varm perlesterilisator til at rense alle kirurgiske instrumenter mellem dyr.
  10. Lad 24 timer for musene at komme sig efter den kirurgiske procedure og for dannelse af en foreløbig sårmatrix over sårene, før du fortsætter med at iokkulere bakterier.

5. Vaccination med P. aeruginosa

  1. Fortyndes natten PAO1:lux kultur til OD600 = 0,05 i 75 ml LB medier, der indeholder 100 μg/ml carbenicillin og dyrke bakterier, indtil kulturen er i tidlig eksponentiel fase (OD600 ≈ 0,3). Det skal tage cirka 2-3 timer.
  2. PaO1:lux i PBS fortyndes til en koncentration på (7,5 ± 2,5) x 102 CFU/ml. Sørg for at forberede overskydende inoculum for at sikre tilstrækkelig volumen og for at give mulighed for plating efter forsøget. Hvis transport mellem faciliteter (dvs. fra laboratoriet til vivarium), skal du bruge dobbelt indeslutning i en lækagesikker boks tydeligt mærket Biohazard.
  3. Udfør alt arbejde med P. aeruginosa og mus ved hjælp af godkendte personlige værnemidler i et animal biosafety level 2 (ABSL-2) godkendt biologisk sikkerhedsskab (BSC). Genanvendeligt udstyr såsom vejevægten skal dækkes med plastfolie for at forhindre kontaminering.
  4. Bedøve ved hjælp af 3% isofluran som beskrevet ovenfor. Vej musen og registrere vægten. Injicer musen subkutant med forvarmet steril 0,9% natriumchlorid, 250 μL ved hver flanke for i alt 500 μL.
  5. Hvis musens gennemsigtige film dressing er kommet ud natten, fjerne eventuelle resulterende skurv omhyggeligt og sat på en ny dressing.
  6. Brug en 500 μL tuberkulin 27 G sikkerhedshættesprøjte til at injicere 40 μL af PAO1:lux suspensionen gennem den gennemsigtige filmdressing i hvert sår. Der bør anvendes forskellige mus til ikke-inokulerede/PBS-sårkontrol for at forhindre krydskontaminering fra den kontralaterale side.
  7. Placer musen tilbage i sit bur på en varmepude og overvåge, indtil den vågner op. Alle mus skal anbringes individuelt i separate bure for at forhindre krydskontaminering.
  8. Give højt kalorieindhold ernæringstilskud pasta klemt inde mellem mad pellets på gulvet i buret.
  9. Brug de resterende inokulum til at stribe en LB agar plade. Tælle kolonier for at bekræfte antallet af bakterier administreres.

6. In vivo billeddannelse af inficerede sår

  1. Følg BSL-2 indeslutningsprotokoller for transport af mus til og fra billedbehandlingsinstrumentet, herunder brug af en sekundær beholder. Pas på ikke at overføre eller tabe dyrestrøelse under overførslen af musen til induktionskammeret eller billedbehandlingsinstrumentet.
  2. Inducee anæstesi af musen med inhaleret 1%-3% isofluran i et induktionkammer som beskrevet i trin 3.1.
  3. Når musen er bestøvet, placere den i liggende position i billedbehandling kammer af en optisk billeddannelse system med næsen i isofluran næse kegle.
  4. Åbn softwareprogrammet.
  5. Anskaffelsesparametrene vil variere afhængigt af antallet af afbildede dyr samtidigt og intensiteten af bioluminescens. De grundlæggende parametre, der skal angives, omfatter eksponeringstid, binning, f/stop og synsfelt (FOV). Vores standardstartindstillinger er eksponeringstid 30 sekunder, binning lav (2), f / stop 1,2, og FOV 25. Juster disse indstillinger efter behov afhængigt af forskerens behov.
  6. Analysér luminescensdata ved hjælp af et billedbehandlingsprogram (se Materialetabel). Luminescens vil blive repræsenteret som en pseudocolor billede overlejret på en farve fotografi af mus.
    1. Opret et interesseområde på såret, og mål den gennemsnitlige flux (fotoner/sekund), der registreres. Bemærk, at data også kan rapporteres som udstråling (fotoner/sekund/cm²/steradian), men så længe billedplatformens afstand fra kameraet forbliver konstant mellem billeddannelse, er flux tilstrækkelig.
    2. Mål baggrunden ved at oprette en investeringsafkastet på et tilfældigt område på billedplatformen. Træk baggrundsnummeret på fotoner/sekund.
    3. Eksporter dataene til et regneark til yderligere analyse.
  7. Udfør billedbehandling som beskrevet ovenfor så ofte som dagligt for at spore infektion progression.

7. Postoperativ forvaltning

  1. Overvåg mus i henhold til retningslinjer, der er fastsat af forskerens IACUC-protokol. Vi overvåger alle mus dagligt i de første 4 dage, så hver anden dag indtil udgangen af eksperimentet. Veje musene en gang om dagen i de første 4 dage efter operationen i en BSC. Tilføres 250 μL 0,9 % natriumchlorid subkutant på dag 1 og 2 efter infektion.
  2. Kontroller for tegn på smerte / angst i mus, herunder pukkelrygget kropsholdning, scruffy pels, sløvhed, åndedrætsbesvær, facial grimasse, og vægttab.
  3. Hvis dyr viser tegn på forringelse af helbredet, skal du rådføre sig med en dyrlæge. Enhver mus, der synes at vise forværrede tegn på smerte / nød og et vægttab på 20% eller derover bør aflives.

8. Sårexcision

  1. Når forsøget er afsluttet, ofres musene ved hjælp af CO2-indånding efterfulgt af cervikal forskydning. Kassér dyrekroppen i henhold til institutionens ABSL-2-protokoller.
  2. Punktafgifter sår senge ved hjælp af sterilsaks og pinc i en BSC. Placer hver sårseng i 1 ml steril PBS i et 1,5 ml polypropylenrør. Hakke sårvævet med en saks. Alle sår bør behandles som ASBL-2, selv om de ikke betragtes som inficerede.
  3. Inkuber på en shaker ved 300 omdr./min. i 2 timer ved 4 °C. Vortex hvert rør i 10 s og seriel fortynde bakteriespildevand i PBS. Plade fortyndet bakteriel spildevand på LB agar at opregne den bakterielle byrde.
  4. Overvej sår inficeret, hvis selvlysende signal i såret er over baggrunden luminescens og flere bakterier påvises i såret spildevand end i sår podet med PBS som kontrol.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Ved hjælp af en selvlysende stamme af PAO1 med en plasmid kodning af luxABCDE reporter system (PAO1:lux), vi udført excisional sårede på mus, vaccineret disse sår med planktoniske P. aeruginosa 24 h senere, og målte bakteriel byrde over tid (Figur 1 og figur 2). Et repræsentativt billede, der er opnået ved hjælp af et optisk billedsystem, viser, at denne model resulterer i påviselig luminescens (figur 3A). Infektion toppede ved dag 3 post-podning og varede 7 dage efter podning baseret på både bioluminescens og koloni tal (Figur 3B-C). Ved hjælp af denne model, vi er i stand til pålideligt generere sår varig 7-10 ays afhængigt af stammen af bakterier og musenbaggrund. Dyrkning af bakterier isoleret fra såret viste, at kvantificerede CFU / sår korreleret med opdaget luminescens (Figur 3D). Endelig, på trods af påviselige og kvantificerbare P. aeruginosa infektion, mus overlevede i mindst 7 dage. Selv om der var indledende hurtigt vægttab umiddelbart efter infektion, saltvand injektioner og supplerende ernæring resulterede i restaurering af vægt (Figur 3E). Endelig beregnede vi den vaccinationsdosis, hvor 50 % af sårene ville blive bæredygtigt inficeret med PAO1. Den beregnede IC50-værdi var ~7,7 x 102 CFU/ml. Doser højere end 104 CFU/ml resulterede i 100% infektionsrate (figur 3F). Disse resultater blev tilpasset fra tidligere offentliggjorte data13.

Figure 1
Figur 1: Skematisk, der forestiller den eksisonske sårinfektionsmodel i fuld tykkelse med forsinket podning med bioluminescerende P. aeruginosa. Streak PAO1: lux på dag -2. Vælg en koloni på dag -1 og vokse natten over i LB bouillon. Udfør eksyionssårkirurgi på dag -1. På dag 0, vaccinere med PAO1:lux ved at injicere i sårsengen gennem den gennemsigtige filmdressing. Udfør bioluminescensbilleddannelse efter vaccination. Gentag billeddannelse så ofte som dagligt gennem dag 7-10. På dag 7-10, ofre dyr og høst sår. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 2
Figur 2: Skematisk af eksplikationskirurgi. Efter hårfjerning og sterilisering af huden med alkohol og betadin, bruge en 6 mm biopsi punch til at gøre en indledende snit gennem epidermis af venstre og højre dorsum. Brug saks og pincet til at fjerne de dermale og epidermale lag. Vask med PBS. Dæk med en klar dressing. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 3
Figur 3: P. aeruginosa sårinfektion kan påvises gennem 7 dages infektion. (A) Repræsentativt billede af en mus inficeret med PAO1:lux med bioluminescens overlay på excisional sår. B) Selvlysende signal, der afspejler sårbakteriebyrden. N = 6 sår. Vaccination: 105 CFU/mL PAO1. (C)Lineær regressionsanalyse af in vivo-selvlysende signal og bakteriel CFU af PAO1:lux-inficerede sår, indsamlet 4-7 dage efter podning med 105 CFU/ml for at muliggøre en række bakterielle byrder. (D) Bakteriel byrde i CFU/sår over tid hos mus inficeret med 105 CFU/mL PAO1:lux. (E) Vægtændring (i forhold til vægt før sårexcision kirurgi på T = -1) N = 4 mus / gruppe. Afbildet er boxplots for 5-95 percentil. Statistik er to-vejs ANOVA korrigeret med Sidak flere sammenligninger. F) Ikke-lineær regressionsanalyse af sårinfektionsraten, der anvendes til at beregne IC50 for PAO1 tre dage efter podning. Alle grafer er repræsentative for n≥3-eksperimenter. Dette tal er blevet ændret fra Sweere et al. 201913. Klik her for at se en større version af denne figur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Vi har udviklet en ny forsinket vaccination P. aeruginosa sårinfektion model. Strategien med at forsinke podning med bakterier indtil 24 timer efter excisional såring gør det muligt at vurdere sårinfektioner over en 1-ugers tidsramme. Ved at bruge en selvlysende stamme af P. aeruginosa,er det muligt at spore infektion progression i hele infektionen kursus. Jo længere infektionsforløb sammenlignet med andre P. aeruginosa infektion modeller vil give nye muligheder for at studere vært-patogen interaktioner og nye behandlingsformer rettet mod P. aeruginosa sårinfektioner. For eksempel har vi allerede brugt denne model til at demonstrere pf bakteriofages rolle med hensyn til at stimulere et antiviralt immunrespons, der gør det muligt for P. aeruginosa at unddrage sig værtens immunsystem14.

Inddragelsen af 24 timers restitutionstid mellem den excisionale sår kirurgi og bakteriel vaccination er et kritisk skridt i denne sårinfektion model. Det gør det muligt for dyrene at komme sig efter sårkirurgi, før de bliver smittet, som sandsynligvis spiller en rolle i deres evne til at overleve gennem mindst 7 dage. Desuden støtter den dannelsen af en foreløbig sårmatrix før inokulering, som i kombination med den gennemsigtige filmdressing giver et miljø, der fremmer biofilmdannelse. Vi udførte en række sonderende eksperimenter under udviklingen af denne model ser på forskellige mængder af tid mellem sårede og podning. Det er vores erfaring, øjeblikkelig vaccination efter sårede ofte resulterer i sepsis og død. Omvendt førte vaccination ved 48 timer og senere tidspunkter til uacceptable niveauer af heterogenitet mellem mus og mellem sår på samme mus. Som tydeligt i figur 3Akan der stadig være en vis grad af forventet heterogenitet i bakteriebelastningen af inficerede sår, selv med den 24-h forsinkede vaccination. En måde at kompensere for dette på er at bruge flere dyr i hvert eksperiment.

Et unikt aspekt af denne protokol er excision af to sår uafhængigt snarere end at folde huden ned midterlinjen og stansning igennem for at skabe to bilaterale sår, som det sker i nogle andre sår modeller. Vi fandt, at denne folde metode var også effektiv til at producere symmetriske sår med rene margener. Men, mus behandlet på denne måde typisk blev septisk hurtigt efter bakteriel vaccination og døde. Vi mener, at dette kan skyldes, at denne folde metode fjerner dermal Panniculus carnosus - et tyndt lag af muskler underliggende huden på mus, der ikke er til stede hos mennesker. Vi spekulerer på, at denne barriere kan hjælpe med at forhindre bakteriel formidling.

En vigtig del af denne protokol er tilstrækkelig hårfjerning fra operationsstedet, som overskydende hår kunne give en nidus for superinfektion og forstyrrer overholdelseaf den gennemsigtige film dressing. Vi har konstateret, at barbering ud over hårfjerning creme giver optimal hårfjerning med minimal hudirritation, men grundigt vask fra cremen med varmt vand er stadig vigtigt.

En anden integreret faktor er ernæringsmæssig støtte, hydrering, og smerte kontrol i løbet af de første par dage af postkirurgiske og infektion kursus. For at løse dette, administrerer vi 500 μL subkutan 0,9% natriumchlorid på dag -1 og 0, derefter 250 μL på dag 1 og 2. Vi leverer også en multivitamin og kaloriefattige flydende gel supplement på tidspunktet for den excisional sår kirurgi. Som det fremgår af figur 3E, giver disse foranstaltninger mulighed for tilstrækkelig genindvinding af vægten pr. dag 3. Med hensyn til analgesi har vi konstateret, at vedvarende frigivelse 0,5 mg/kg buprenorphin givet før den ekskrementerssårkirurgi giver tilstrækkelig smertekontrol i 72 timer, men yderligere doser kan gives, hvis det er berettiget baseret på fund af angst i en individuel mus.

Selv om en model af P. aeruginosa sårinfektion strækker sig til 7-10 dage er en betydelig fordel i forhold til mere akutte modeller af infektion, dette stadig ikke kan være tilstrækkeligt til at besvare visse forskningsspørgsmål, der involverer mere kroniske infektioner. En af grundene til denne begrænsning er, at det selvlysende signal fra PAO1:lux-stammen af P. aeruginosatoppe på dag 2-3(figur 3B). Efter ~ 7 dage luciferase signalet kan blive upålidelige. Derfor kvantificerer vi bakterierne ved at platere sårspildevand på LB-plader og tælle CFU'er for at bekræfte infektionen af hvert sår i slutningen af forsøget. En anden mulig ulempe ved denne model er kravet om en in vivo billedbehandling system, som nogle laboratorier måske ikke har adgang til. En vej uden om denne hindring er at bruge ikke-selvlysende vilde type bakteriestammer. Dette giver stadig forskeren mulighed for at drage fordel af denne kroniske infektion model og, som angivet ovenfor, bakterierne CFUs kan kvantificeres i slutningen af forsøget.

Vi har beskrevet en ny model for forsinket vaccination P. aeruginosa sårinfektion, der gør det muligt eksperimenter strækker sig til 7-10 dage. Denne model vil tjene som et nyttigt redskab til evaluering af værtspatogen interaktion med P. aeruginosa, samt udvikling af nye behandlingsformer. Denne model har potentiale for flere fremtidige retninger, herunder tilpasning til andre sårpatogener såsom Staphylococcus aureus, samt polymikrobielle infektioner, herunder P. aeruginosa kombineret med andre patogener.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingen konkurrerende finansielle interesser at afsløre.

Acknowledgments

Den pUT-Tn5-EM7-lux-Km1 selvlysende konstruere vektor var en elskværdig gave fra J. Hardy. Schematics blev skabt med BioRender.com. Vi takker laboratoriet i G. Gurtner for deres råd om sårinfektion model. Vi takker også T. Doyle fra Stanford Center for Innovation i In Vivo Imaging for hans tekniske ekspertise. Dette arbejde blev støttet af tilskud R21AI133370, R21AI133240, R01AI12492093, og tilskud fra Stanford SPARK, Falk Medical Research Trust og Cystisk Fibrose Foundation (CFF) til P.L.B. C.R.D blev støttet af T32AI007502. En Gabilan Stanford Graduate Fellowship for Videnskab og Teknik og en Lubert Stryer Bio-X Stanford Tværfaglige Graduate Fellowship støttede J.M.S.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.9% Sodium Chloride injection Hospira 2484457
18 G x 1 sterile needle BD 305195
25 G x 1 1/5 sterile needle BD 305127
Alcohol swab BD 326895
Aura Imaging Software Spectral Instruments Imaging n/a
Betadine Purdue Frederick Company 19-065534
Buprenorphine SR LAB Zoopharm n/a
C57BL/6J male mice The Jackson Laboratory 000664
Disposable biopsy punch, 6mm Integra 33-36
Fine scissors - Tungsten Carbide Fine Science Tools 14568-09
Glass Bead Dry Sterilizer Harvard Apparatus 61-0183
Granulated Agar Fisher BioReagents BP9744
Heating Pad Milliard 804879481218
Insulin syringe with 28 G needle BD 329461
Lago X Imaging System Spectral Instruments Imaging n/a
LB broth Fisher BioReagents BP1426
Leur-Lok 1 mL syringe BD 309628
Mini Arco Animal Trimmer Wahl Professional 919152
Nair Hair Removal Lotion with Baby Oil Church and Dwight n/a Available at any pharmacy
Octagon Forceps Fine Science Tools 11041-08
Petri dish Falcon 351029
Phosphate Buffered Saline (PBS) 1x Corning 21-040-CV
Press and Seal Cling Wrap Glad n/a
SafetyGlide Insulin syringe with 30 G needle BD 305934
Safetyglide Insulin syringe, 1/2 mL, 30 G x 5/16 TW BD 305934
Scale Ohaus Scout Pro SP202
Supplical Nutritional Supplement Henry Schein Animal Health 29908
Tegaderm, 6 cm x 7 cm 3M 1624W

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Sen, C. K., et al. Human skin wounds: a major and snowballing threat to public health and the economy. Wound Repair and Regeneration. 17, (6), 763-771 (2009).
  2. Serra, R., et al. Chronic wound infections: the role of Pseudomonas aeruginosa and Staphylococcus aureus. Expert Review of Anti-infective Therapy. 13, (5), 605-613 (2015).
  3. Obritsch, M. D., Fish, D. N., MacLaren, R., Jung, R. Nosocomial infections due to multidrug-resistant Pseudomonas aeruginosa: epidemiology and treatment options. Pharmacotherapy. 25, (10), 1353-1364 (2005).
  4. Secor, P. R., et al. Filamentous Bacteriophage Produced by Pseudomonas aeruginosa Alters the Inflammatory Response and Promotes Noninvasive Infection In Vivo. Infection and Immunity. 85, (1), (2017).
  5. Rice, S. A., et al. The biofilm life cycle and virulence of Pseudomonas aeruginosa are dependent on a filamentous prophage. The ISME Journal. 3, (3), 271-282 (2009).
  6. Bayes, H. K., Ritchie, N., Irvine, S., Evans, T. J. A murine model of early Pseudomonas aeruginosa lung disease with transition to chronic infection. Scientific Reports. 6, 35838 (2016).
  7. van Gennip, M., et al. Interactions between polymorphonuclear leukocytes and Pseudomonas aeruginosa biofilms on silicone implants in vivo. Infection and Immunity. 80, (8), 2601-2607 (2012).
  8. Trøstrup, H., et al. Pseudomonas aeruginosa biofilm aggravates skin inflammatory response in BALB/c mice in a novel chronic wound model. Wound Repair and Regeneration. 21, (2), 292-299 (2013).
  9. Zhao, G., et al. Time course study of delayed wound healing in a biofilm-challenged diabetic mouse model. Wound Repair and Regeneration. 20, (3), 342-352 (2012).
  10. Brubaker, A. L., Rendon, J. L., Ramirez, L., Choudhry, M. A., Kovacs, E. J. Reduced neutrophil chemotaxis and infiltration contributes to delayed resolution of cutaneous wound infection with advanced age. Journal of Immunolology. 190, (4), 1746-1757 (2013).
  11. Watters, C., et al. Pseudomonas aeruginosa biofilms perturb wound resolution and antibiotic tolerance in diabetic mice. Medical Microbiology and Immunology. 202, (2), 131-141 (2013).
  12. Lee, C., Kerrigan, C. L., Picard-Ami, L. A. Cyclophosphamide-induced neutropenia: effect on postischemic skin-flap survival. Plastic and Reconstructive Surgery. 89, (6), 1092-1097 (1992).
  13. Sweere, J. M., et al. The immune response to Chronic Pseudomonas aeruginosa wound infection in immunocompetent mice. Advances in Wound Care. (2019).
  14. Sweere, J. M., et al. Bacteriophage trigger antiviral immunity and prevent clearance of bacterial infection. Science. 363, (6434), (2019).
En forsinket vaccination Model af kronisk <em>Pseudomonas aeruginosa</em> Sårinfektion
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

de Vries, C. R., Sweere, J. M., Ishak, H., Sunkari, V., Bach, M. S., Liu, D., Manasherob, R., Bollyky, P. L. A Delayed Inoculation Model of Chronic Pseudomonas aeruginosa Wound Infection. J. Vis. Exp. (156), e60599, doi:10.3791/60599 (2020).More

de Vries, C. R., Sweere, J. M., Ishak, H., Sunkari, V., Bach, M. S., Liu, D., Manasherob, R., Bollyky, P. L. A Delayed Inoculation Model of Chronic Pseudomonas aeruginosa Wound Infection. J. Vis. Exp. (156), e60599, doi:10.3791/60599 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter