Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Immunology and Infection

En fördröjd inokulering modell av kronisk pseudomonas aeruginosa Sår infektion

doi: 10.3791/60599 Published: February 20, 2020
* These authors contributed equally

Summary

Vi beskriver ett försenat inokuleringsprotokoll för att generera kroniska sårinfektioner hos immunkompetenta möss.

Abstract

Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa) är en stor nosokomial patogen av ökande relevans för människors hälsa och sjukdom, särskilt vid fastställandet av kroniska sårinfektioner hos diabetiker och sjukhuspatienter. Det finns ett akut behov av kroniska infektionsmodeller för att underlätta undersökningen av sårpatogenes och utvecklingen av nya terapier mot denna patogen. Här beskriver vi ett protokoll som använder fördröjd inokulering 24 timmar efter full-tjocklek excisional såra. Infektionen av den provisoriska sårmatrisen som för närvarande för närvarande försvårar antingen snabb röjning eller spridning av infektion och fastställer i stället kronisk infektion som varar 7–10 dagar utan behov av implantation av främmande material eller immunsuppression. Detta protokoll härmar en typisk temporal kurs av postoperativ infektion hos människor. Användningen av en luminescent P. aeruginosa stam (PAO1:lux) möjliggör kvantitativ daglig bedömning av bakteriell börda för P. aeruginosa sårinfektioner. Denna nya modell kan vara ett användbart verktyg vid undersökning av bakteriell patogenes och utvecklingen av nya terapier för kroniskA P. aeruginosa sårinfektioner.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa) är en Gram-negativ stavformad bakterie med ökande relevans för människors hälsa och sjukdom. Det är ansvarig för omfattande sjuklighet och dödlighet i nosocomial inställningar, särskilt med sårinfektioner hos immunkomprometterade patienter1,2. Framväxten av multiresistenta stammar av denna patogen har gett ytterligare impulser till utredning av faktorer som bidrar till P. aeruginosa virulens, mekanismer för P. aeruginosa antibiotikaresistens, och nya metoder för förebyggande och behandling av denna dödliga infektion3. Som sådan har behovet av djurmodeller av kronisk sårinfektion som verktyg för att undersöka dessa forskningsfrågor aldrig varit större.

Tyvärr, många djur modeller av P. aeruginosa infektion tenderar att simulera akut infektion med snabb lösning av infektion eller snabb nedgång på grund av sepsis4,5,som inte tillräckligt simulera ofta kronisk karaktär av dessa infektioner. För att ta itu med denna nackdel, vissa modeller använder implantation av främmande organ såsom agar pärlor, silikonimplantat, eller alginate geler6,7,8. Andra modeller använder möss som är immunkomprometterade på grund av hög ålder, fetma eller diabetes, eller genom farmakologiska medel såsom cyclophosphamide-inducerad neutropeni9,10,11,12. Emellertid, antingen användningen av främmande material eller immun komprometterade värdar sannolikt förändrar den lokala inflammatoriska processen, vilket gör det svårt att få en förståelse för patofysiologi inblandade i kroniska sårinfektioner i värdar med annars normala immunsystem.

Vi har utvecklat en kronisk modell av P. aeruginosa sårinfektion hos möss som innebär fördröjd inokulering med bakterier efter excisional såra. Fördröjd inokulering möjliggör experiment som bedömer bakteriebördan som sträcker sig ut till minst 7 dagar. Denna modell öppnar nya möjligheter för att undersöka både patogenes och nya behandlingar av P. aeruginosa kroniska infektioner.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Alla metoder som beskrivs här har godkänts av Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) vid Stanford University.

1. Beredning och tillväxt av bakterier

  1. Utför allt arbete med P. aeruginosa och djur med BSL-2 försiktighetsåtgärder enligt forskarens institutionella riktlinjer för biosäkerhet och riktlinjer för djuranvändningskommittén. Gör alla steg som beskrivs här med P. aeruginosa, inklusive musinokulering, i ett biosäkerhetsskåp.
  2. Den självlysande PAO1:lux stammen av P. aeruginosa är tillgänglig från vårt labb på begäran. Streak PAO1, lagras som fryst glycerol lager, på Lysogeny Broth (LB) agar. För den luminescerande PAO1:luxstammen bör LB-agar innehålla selektiva antibiotika (100 μg/ml carbenicillin och 12,5 μg/ml kanamycin). Växa vid 37 °C över natten i en bakterieinkubator.
  3. Välj en isolerad koloni och växa över natten vid 37 °C i 3 ml LB medium, pH 7,4. För luminescerande stammar ska buljongen innehålla 100 μg/ml carbenicillin. Väx under skakningar, aeroba förhållanden.

2. Förberedelser för förfarandet

  1. Har all personal som utför kirurgi bära en ren klänning / Lab päls, ansiktsmask, hårnät och handskar.
  2. Autoklav alla kirurgiska verktyg, inklusive sax och pincett. Använd aseptisk teknik för att sterilisera verktyg mellan djur.
  3. Rengör operationsbordet med etanol och förbered ett rent kirurgiskt fält.

3. Hårborttagning

  1. Anesthetize 8-12 veckor gamla C57BL/6J möss med 1%-3% isofluran. Utredarna bör följa institutionens riktlinjer för veterinärpersonal för anestesi när de använder isofluran.
    1. Starta anestesi genom att leverera 1%–3% isofluran och justera syreflödet till 1,5 L/min. Placera musen i induktionskammaren.
    2. Nyp musens tå för att bedöma anestesidjupet. När musen inte längre svarar på stimulering, ta bort den från induktionskammaren och placera den på operationsbänken med näsan i isofluran näskon.
    3. Applicera okulärt smörjmedel på båda ögonen.
  2. Väg musen för att få en baslinje förprocedurvikt.
  3. Placera musen i liggande läge. Injicera musen subkutant med förvärmd steril 0,9% natriumklorid, 250 μL vid varje flank för totalt 500 μL.
  4. Raka den dorsala delen av musen med hjälp av en elektrisk rakapparat. Rakning bör förekomma på en annan plats än den kirurgiska stationen för att förhindra hårkontaminering av såret.
  5. Applicera ett tunt lager av hårborttagninglotion. Låt lotionen sitta för 20–60 s. Ta bort håret och överflödig lotion med gasväv fuktad i varmt vatten. Efter hårborttagning, fortsätt till excisional såra förfarandet.

4. Full tjocklek excisional sår kirurgi

  1. Injicera ihållande frisättning buprenorfin 0,6–1 mg/kg subkutant med en 25 G-nål i mitten av ryggytan på musen. Långsam frisättning buprenorfin ger smärtlindring över 48-72 h.
  2. Desinficera operationsstället. Torka dorsala ytan med en steril betadinsvabb. Torka överflödig betadin med en steril alkoholpinne. Detta bör utföras 3 gånger (omväxlande mellan betadin och alkohol), svabbning genom att flytta från mitten på ett cirkulärt sätt till kanten. Låt området lufttorka.
  3. Skapa en drapera kring operationsstället med steril gasväv eller plastplastfolie.
  4. Sträck huden spänd caudally. Använd en steril 6 mm diameter hud biopsi punch för att göra ett första snitt genom den vänstra dorsala epidermis. Upprepa på höger dorsala epidermis.
  5. Använd pincett för att tälta huden från mitten av det vänstra skisserade sårområdet. Punktskatt epidermal och dermal lager med sax. Upprepa till höger skisserat sårområde för att skapa symmetriska excisional sår.
  6. Tvätta sår med 50 μl steril realine. Låt operationsplatsen och den omgivande huden lufttorka. Täck sedan såren och dorsum med en transparent filmdressing.
  7. Placera musen tillbaka i en ren bur. Hus 1 djur per bur.
  8. Placera buren på en värmeplatta och övervaka tills musen vaknar.
  9. När du utför ovanstående operation på flera djur, använd en varm bead sterilizer för att rengöra alla kirurgiska instrument mellan djur.
  10. Låt 24 h för mössen att återhämta sig från det kirurgiska ingreppet och för bildandet av en provisorisk sårmatris över såren innan du fortsätter att inokulering med bakterier.

5. Inokulering med P. aeruginosa

  1. Späd över natten PAO1:lux kultur till OD600 = 0,05 i 75 ml LB-medier som innehåller 100 μg/mL carbenicillin och odla bakterierna tills kulturen är i tidig exponentiell fas (OD600 ≈ 0,3). Det borde ta ungefär 2–3.
  2. Späd PAO1:lux i PBS till en koncentration på (7,5 ± 2,5) x 102 CFU/ml. Var noga med att förbereda överskott inokulat för att säkerställa tillräcklig volym och att tillåta plätering efter experimentet. Om transport mellan anläggningar (dvs. från labbet till vivarium), använd dubbel inneslutning i en läckagesäker låda tydligt märkt Biohazard.
  3. Utför allt arbete med P. aeruginosa och möss med hjälp av godkänd personlig skyddsutrustning i ett animal biosafety level 2 (ABSL-2) godkänt biologiskt säkerhetsskåp (BSC). Återanvändbar utrustning som vägningsskalan bör täckas med klamrarplastför att förhindra kontaminering.
  4. Anösen med 3% isofluran enligt beskrivningen ovan. Väg musen och spela in vikten. Injicera musen subkutant med förvärmd steril 0,9% natriumklorid, 250 μL vid varje flank för totalt 500 μL.
  5. Om musens genomskinliga filmdressing har lossnat över natten, ta bort eventuella sårskorpor noggrant och sätta på en ny dressing.
  6. Använd en 500 μL tuberkulin 27 G säkerhetslockspruta för att injicera 40 μl av PAO1:lux suspension genom transparent filmdressing i varje sår. Olika möss bör användas för icke-inokulerade/PBS-sårkontroller för att förhindra korskontaminering från den kontralaterala sidan.
  7. Placera musen tillbaka i sin bur på en värmeplatta och övervaka tills den vaknar. Alla möss ska inhysas individuellt i separata burar för att förhindra korskontaminering.
  8. Ge hög kalori näringstillskott pasta inklämd mellan mat pellets på golvet i buren.
  9. Använd den återstående inokulat för att strimla en LB agar platta. Greve kolonier för att bekräfta antalet bakterier som administreras.

6. In vivo avbildning av infekterade sår

  1. Följ BSL-2 inneslutningsprotokoll för transport av möss till och från bildinstrumentet, inklusive användning av en sekundär behållare. Var noga med att inte överföra eller släppa några djursängkläder under överföringen av musen till induktionskammaren eller bildinstrumentet.
  2. Inducera anestesi av musen med inandade 1%-3% isofluran i en induktionskammare som beskrivs i steg 3.1.
  3. När musen är sövd, placera den i liggande läge i bildkammaren i ett optiskt bildsystem med näsan i isofluran näsa kon.
  4. Öppna programprogrammet.
  5. Förvärvsparametrarna varierar beroende på antalet djur som avbildades samtidigt och intensiteten i bioluminescensen. De grundläggande parametrarna som ska ställas in är exponeringstid, lagerplats, f/stop och synfält (FOV). Våra standardstartinställningar är exponeringstid 30 sekunder, binning låg (2), f/stop 1.2 och FOV 25. Justera dessa inställningar efter behov beroende på forskarens behov.
  6. Analysera luminescensdata med hjälp av ett bildprogram (se Materialförteckning). Luminescens kommer att representeras som en pseudocolor bild överlagrad på en färg fotografi av möss.
    1. Skapa en region av intresse (ROI) på sårplatsen och mät det genomsnittliga flödet (foton/sekund) som upptäcks. Observera att data också kan rapporteras som utstrålning (fotoner/second/cm²/steradian), men så länge avståndet till bildplattformen från kameran förblir konstant mellan bildbehandling är flödet tillräckligt.
    2. Mät bakgrunden genom att skapa en avkastning på ett slumpmässigt område på bildplattformen. Subtrahera bakgrundsnumret av foton/sekund.
    3. Exportera data till ett kalkylblad för vidare analys.
  7. Utför bildbehandling enligt beskrivningen ovan så ofta som dagligen för att spåra infektionsprogression.

7. Postoperativ förvaltning

  1. Övervaka möss enligt riktlinjer som fastställts av forskarens IACUC-protokoll. Vi övervakar alla möss dagligen under de första 4 dagarna, sedan varannan dag fram till slutet av experimentet. Väg mössen en gång per dag under de första 4 dagarna efter operationen i en BSC. Injicera 250 μl 0,9 % natriumklorid subkutant på dagar efter infektion 1 och 2.
  2. Kontrollera om det finns tecken på smärta/ångest hos mössen, inklusive böjd hållning, scruffy coat, letargi, andningssvårigheter, ansiktsgrimaser och viktminskning.
  3. Om djur uppvisar tecken på försämrad hälsa, rådgör med en veterinär. Varje mus som verkar visa försämrade tecken på smärta / ångest och en viktminskning på 20% eller större bör avlivas.

8. Sårexcision

  1. I slutet av experimentet, offra mössen med CO2 inandning, följt av livmoderhalscancer störning. Kassera djurkadaverenligt institutionens ABSL-2 protokoll.
  2. Punktskatter sängar med steril sax och pincett i en BSC. Placera varje sårbädd i 1 ml steril PBS i ett 1,5 ml polypropylenrör. Hacka sårvävnaden med sax. Alla sår bör behandlas som ASBL-2, även om de inte anses smittade.
  3. Inkubera på en shaker vid 300 rpm för 2 h vid 4 °C. Vortex varje rör för 10 s och seriellt späda bakterieutsläpp i PBS. Platta det utspädda bakterieutflödet på LB-agar för att räkna upp bakteriebördan.
  4. Tänk på sår infekterade om luminescerande signal i såret är över bakgrundsluminescens och fler bakterier detekteras i såret spillvatten än i sår inokuleras med PBS som kontroll.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Med hjälp av en luminescerande stam av PAO1 med en plasmid kodning luxABCDE reporter systemet (PAO1:lux), utförde vi excisional sårpå möss, inokulerade dessa sår med planktoniska P. aeruginosa 24 h senare, och mätt bakteriell börda över tiden(figur 1 och figur 2). En representativ bild som erhållits med hjälp av ett bildoptiskt system visar att denna modell resulterar i detekterbar luminans(figur 3A). Infektionen nådde en topp dag 3 efter inokuleringen och kvarstod 7 dagar efter inokulering baserat på både bioluminescens och koloniantal (figur 3B–C). Med hjälp av denna modell, Vi kan tillförlitligt generera sår som varar 7-10 ays beroende på stammen av bakterier och musen bakgrund. Kulturen av bakterierna isolerade från såret visade att kvantifierad CFU/sår korrelerade med upptäckt luminans (figur 3D). Slutligen, trots påvisbara och kvantifierbara P. aeruginosa infektion, överlevde möss i minst 7 dagar. Även om det fanns inledande snabb viktminskning omedelbart efter infektion, saline injektioner och kompletterande näring resulterade i återställande av vikt (Figur 3E). Slutligen beräknade vi inokuleringsdosen vid vilken 50% av såren skulle bli hållbart infekterade med PAO1. Det beräknade IC50-värdet var ~7,7 x 102 CFU/ml. Doser högre än 104 CFU/ml resulterade i 100% infektionsfrekvens(figur 3F). Dessa resultat har anpassats från tidigare publicerade data13.

Figure 1
Figur 1: Schematisk föreställande excisional full-tjocklek sårinfektion modell med fördröjd inokulering med bioluminescerande P. aeruginosa. Streak PAO1:lux på dag -2. Välj en koloni dag -1 och växa över natten i LB buljong. Utför excisional sårkirurgi på dag -1. På dag 0, vaccinera med PAO1:lux genom att injicera i sårsängen genom den genomskinliga filmdressingen. Utför bioluminescensavbildning efter inokulering. Upprepa bildbehandling så ofta som dagligen till dag 7–10. Dag 7–10 offradjur och sår. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2: Schematisk av excisional sårkirurgi. Efter hårborttagning och sterilisering av huden med alkohol och betadin, använd en 6 mm biopsi punch för att göra ett första snitt genom epidermis av vänster och höger dorsum. Använd sax och pincett för att ta bort dermal och epidermala lager. Tvätta med PBS. Täck med en klar dressing. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3: P. aeruginosa sårinfektion kan upptäckas genom 7 dagars infektion. (A)Representativ bild av en mus infekterad med PAO1:lux med bioluminescens överlägg på excisional sår. (B)Luminescent signal som återspeglar sår bakteriebörda. N = 6 sår. Inokulering: 105 CFU/mL PAO1. (C)Linjär regressionsanalys av in vivo-luminescentsignal och bakteriell CFU av PAO1:lux-infekterade sår, samlade 4–7 dagar efter inokulering med 105 CFU/ml för att möjliggöra en rad bakteriebördor. (D)Bakteriell börda i CFU/sår över tid hos möss infekterade med 105 CFU/ml PAO1:lux. (E)Viktförändring (i förhållande till vikt före sårexcision kirurgi på T = -1) N = 4 möss/grupp. Avbildas är boxplots för 5-95 percentilen. Statistiken är Tvåvägs ANOVA korrigeras med Sidak flera jämförelser. (F) Ickelinjär regressionsanalys av sårinfektionsfrekvens som används för att beräkna IC50 för PAO1 tre dagar efter inokulering. Alla grafer är representativa för n≥3 experiment. Denna siffra har ändrats från Sweere et al. 201913. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Vi har utvecklat en roman försenad inokulering P. aeruginosa sårinfektion modell. Strategin att fördröja inokulering med bakterier till sen 24 h efter excisional sår möjliggör utvärdering av sårinfektioner under en 1-veckors tidsram. Genom att använda en luminescerande stam av P. aeruginosa, är det möjligt att spåra infektionprogression under infektionskursen. Den längre infektionsförloppet jämfört med andra P. aeruginosa infektion modeller kommer att möjliggöra nya möjligheter att studera värd-patogen interaktioner och nya terapier inriktning P. aeruginosa sår infektioner. Till exempel har vi redan använt denna modell för att visa den roll som Pf bakteriophage att stimulera ett antiviralt immunsvar som gör att P. aeruginosa att undvika värdimmunsystemet14.

Införandet av 24 h återhämtningstid mellan excisional sårkirurgi och bakteriell inokulering är ett kritiskt steg i denna sårinfektion modell. Det gör det möjligt för djuren att återhämta sig från sårkirurgi innan de smittas, som sannolikt spelar en roll i deras förmåga att överleva genom minst 7 dagar. Dessutom stöder den bildandet av en provisorisk sårmatris före inokulering, som i kombination med den genomskinliga filmdressingen ger en miljö som främjar biofilmbildning. Vi utförde en rad förberedande experiment under utvecklingen av denna modell tittar på olika mängder tid mellan sårning och inokulering. Enligt vår erfarenhet, omedelbar inokulering efter såra resulterar ofta i sepsis och död. Omvänt ledde inokulering vid 48 timmar och senare tidspunkter till oacceptabla nivåer av heterogenitet mellan möss och mellan sår på samma mus. Som framgår av figur 3A, det kan fortfarande finnas en viss grad av förväntad heterogenitet i bakteriell belastning av infekterade sår, även med 24-h fördröjd inokulering. Ett sätt att kompensera för detta är att använda flera djur i varje experiment.

En unik aspekt av detta protokoll är excision av två sår självständigt snarare än vikning huden ner mittlinjen och stansning genom att skapa två bilaterala sår, som görs i vissa andra sår modeller. Vi fann att denna hopfällbara metod också var effektiv för att producera symmetriska sår med rena marginaler. Möss som behandlades på detta sätt blev dock vanligtvis septisk snabbt efter bakteriell inokulering och dog. Vi tror att detta kan bero på att denna hopfällbara metod tar bort dermal Panniculus carnosus - ett tunt lager av muskler bakom huden på möss som inte finns hos människor. Vi spekulerar i att denna barriär kan bidra till att förhindra bakteriell spridning.

En viktig del av detta protokoll är tillräcklig hårborttagning från operationsstället, eftersom överflödigt hår kan ge en nidus för superinfektion och stör följsamhet av den genomskinliga filmdressing. Vi har funnit att rakning förutom hårborttagning grädde ger optimal hårborttagning med minimal hudirritation, men noggrant tvätta av krämen med varmt vatten är fortfarande viktigt.

En annan integrerad faktor är näringsstöd, hydrering och smärtkontroll under de första dagarna av postkirurgiska och infektion smitta kursen. För att ta itu med detta administrerar vi 500 μl subkutan 0,9% natriumklorid dag -1 och 0, sedan 250 μL dag 1 och 2. Vi levererar också en multivitamin och kalori flytande gel tillägg vid tidpunkten för excisional sår kirurgi. Såsom framgår av figur 3Emöjliggör dessa åtgärder en adekvat återvinning av vikt senast dag 3. När det gäller analgesi har vi funnit att ihållande frisättning 0,5 mg/kg buprenorfin som ges före excisional sårkirurgi ger tillräcklig smärtkontroll för 72 h, men ytterligare doser kan ges om det är motiverat baserat på undersökningsresultaten av nöd i en enskild mus.

Även om en modell av P. aeruginosa sårinfektion som sträcker sig till 7-10 dagar är en betydande fördel jämfört med mer akuta modeller av infektion, kan detta fortfarande inte vara tillräckligt för att svara på vissa forskningsfrågor med mer kroniska infektioner. En orsak till denna begränsning är att den självlysande signalen från PAO1:lux-stammen av P. aeruginosa toppar dag 2–3 (figur 3B). Efter ~ 7 dagar luciferase signalen kan bli opålitlig. Av denna anledning kvantifierar vi bakterierna genom plätering sårutflöde på LB-plattor och räknar CFUs för att bekräfta infektion en infektion i varje sår i slutet av experimentet. En annan möjlig nackdel med denna modell är kravet på ett in vivo imaging system, som vissa laboratorier kanske inte har tillgång till. Ett sätt runt detta hinder är att använda icke-luminescerande vilda typer bakteriestammar. Detta gör det fortfarande möjligt för forskaren att dra nytta av denna kroniska infektionsmodell och, som anges ovan, bakterierna CFUs kan kvantifieras i slutet av experimentet.

Vi har beskrivit en ny modell av fördröjd inokulering P. aeruginosa sårinfektion som gör att experiment som sträcker sig till 7-10 dagar. Denna modell kommer att fungera som ett användbart verktyg för att utvärdera värd-patogen interaktion med P. aeruginosa, liksom utvecklingen av nya terapier. Denna modell har potential för flera framtida riktningar, inklusive anpassning för andra sårpatogener såsom Staphylococcus aureus, samt polymikrobiella infektioner inklusive P. aeruginosa i kombination med andra patogener.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har inga konkurrerande ekonomiska intressen att avslöja.

Acknowledgments

PUT-Tn5-EM7-lux-Km1-luminescentkonstruktionsvektorn var en nådig gåva från J. Hardy. Scheman skapades med BioRender.com. Vi tackar labbet av G. Gurtner för deras råd om sårinfektion sakansmodellen. Vi tackar också T. Doyle från Stanford Center for Innovation i In Vivo Imaging för hans tekniska expertis. Detta arbete stöddes av bidrag R21AI133370, R21AI133240, R01AI12492093, och bidrag från Stanford SPARK, Falk Medical Research Trust och Cystic Fibrosis Foundation (CFF) till P.L.B. C.R.D stöddes av T32AI007502. En Gabilan Stanford Graduate Fellowship for Science and Engineering och en Lubert Stryer Bio-X Stanford tvärvetenskapliga Graduate Fellowship stödde J.M.S.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.9% Sodium Chloride injection Hospira 2484457
18 G x 1 sterile needle BD 305195
25 G x 1 1/5 sterile needle BD 305127
Alcohol swab BD 326895
Aura Imaging Software Spectral Instruments Imaging n/a
Betadine Purdue Frederick Company 19-065534
Buprenorphine SR LAB Zoopharm n/a
C57BL/6J male mice The Jackson Laboratory 000664
Disposable biopsy punch, 6mm Integra 33-36
Fine scissors - Tungsten Carbide Fine Science Tools 14568-09
Glass Bead Dry Sterilizer Harvard Apparatus 61-0183
Granulated Agar Fisher BioReagents BP9744
Heating Pad Milliard 804879481218
Insulin syringe with 28 G needle BD 329461
Lago X Imaging System Spectral Instruments Imaging n/a
LB broth Fisher BioReagents BP1426
Leur-Lok 1 mL syringe BD 309628
Mini Arco Animal Trimmer Wahl Professional 919152
Nair Hair Removal Lotion with Baby Oil Church and Dwight n/a Available at any pharmacy
Octagon Forceps Fine Science Tools 11041-08
Petri dish Falcon 351029
Phosphate Buffered Saline (PBS) 1x Corning 21-040-CV
Press and Seal Cling Wrap Glad n/a
SafetyGlide Insulin syringe with 30 G needle BD 305934
Safetyglide Insulin syringe, 1/2 mL, 30 G x 5/16 TW BD 305934
Scale Ohaus Scout Pro SP202
Supplical Nutritional Supplement Henry Schein Animal Health 29908
Tegaderm, 6 cm x 7 cm 3M 1624W

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Sen, C. K., et al. Human skin wounds: a major and snowballing threat to public health and the economy. Wound Repair and Regeneration. 17, (6), 763-771 (2009).
  2. Serra, R., et al. Chronic wound infections: the role of Pseudomonas aeruginosa and Staphylococcus aureus. Expert Review of Anti-infective Therapy. 13, (5), 605-613 (2015).
  3. Obritsch, M. D., Fish, D. N., MacLaren, R., Jung, R. Nosocomial infections due to multidrug-resistant Pseudomonas aeruginosa: epidemiology and treatment options. Pharmacotherapy. 25, (10), 1353-1364 (2005).
  4. Secor, P. R., et al. Filamentous Bacteriophage Produced by Pseudomonas aeruginosa Alters the Inflammatory Response and Promotes Noninvasive Infection In Vivo. Infection and Immunity. 85, (1), (2017).
  5. Rice, S. A., et al. The biofilm life cycle and virulence of Pseudomonas aeruginosa are dependent on a filamentous prophage. The ISME Journal. 3, (3), 271-282 (2009).
  6. Bayes, H. K., Ritchie, N., Irvine, S., Evans, T. J. A murine model of early Pseudomonas aeruginosa lung disease with transition to chronic infection. Scientific Reports. 6, 35838 (2016).
  7. van Gennip, M., et al. Interactions between polymorphonuclear leukocytes and Pseudomonas aeruginosa biofilms on silicone implants in vivo. Infection and Immunity. 80, (8), 2601-2607 (2012).
  8. Trøstrup, H., et al. Pseudomonas aeruginosa biofilm aggravates skin inflammatory response in BALB/c mice in a novel chronic wound model. Wound Repair and Regeneration. 21, (2), 292-299 (2013).
  9. Zhao, G., et al. Time course study of delayed wound healing in a biofilm-challenged diabetic mouse model. Wound Repair and Regeneration. 20, (3), 342-352 (2012).
  10. Brubaker, A. L., Rendon, J. L., Ramirez, L., Choudhry, M. A., Kovacs, E. J. Reduced neutrophil chemotaxis and infiltration contributes to delayed resolution of cutaneous wound infection with advanced age. Journal of Immunolology. 190, (4), 1746-1757 (2013).
  11. Watters, C., et al. Pseudomonas aeruginosa biofilms perturb wound resolution and antibiotic tolerance in diabetic mice. Medical Microbiology and Immunology. 202, (2), 131-141 (2013).
  12. Lee, C., Kerrigan, C. L., Picard-Ami, L. A. Cyclophosphamide-induced neutropenia: effect on postischemic skin-flap survival. Plastic and Reconstructive Surgery. 89, (6), 1092-1097 (1992).
  13. Sweere, J. M., et al. The immune response to Chronic Pseudomonas aeruginosa wound infection in immunocompetent mice. Advances in Wound Care. (2019).
  14. Sweere, J. M., et al. Bacteriophage trigger antiviral immunity and prevent clearance of bacterial infection. Science. 363, (6434), (2019).
En fördröjd inokulering modell av kronisk <em>pseudomonas aeruginosa</em> Sår infektion
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

de Vries, C. R., Sweere, J. M., Ishak, H., Sunkari, V., Bach, M. S., Liu, D., Manasherob, R., Bollyky, P. L. A Delayed Inoculation Model of Chronic Pseudomonas aeruginosa Wound Infection. J. Vis. Exp. (156), e60599, doi:10.3791/60599 (2020).More

de Vries, C. R., Sweere, J. M., Ishak, H., Sunkari, V., Bach, M. S., Liu, D., Manasherob, R., Bollyky, P. L. A Delayed Inoculation Model of Chronic Pseudomonas aeruginosa Wound Infection. J. Vis. Exp. (156), e60599, doi:10.3791/60599 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter