Summary
El propósito de este método es presentar un método simple y eficiente para la perfusión, inflación y fijación de los pulmones del ratón para el examen de la patología pulmonar y la evaluación de metástasis en el pulmón.
Abstract
La capacidad de evaluar la histología pulmonar es fundamental para los campos de la investigación del cáncer de pulmón y la metástasis del cáncer. Es igualmente importante realizar necropsias rápida y eficientemente a partir de estudios sin sacrificar la calidad de los tejidos adquiridos. El objetivo de este protocolo es presentar un método para perfundir, inflar y fijar rápidamente los pulmones del ratón para el análisis histológico posterior. Este método no estandariza la inflación pulmonar; por lo tanto, no requiere ningún procedimiento o equipo especial y en su lugar simplemente inculca fijación directamente a través de la tráquea después de perfusión a través del corazón. Esto permite una estimación suficiente del tamaño del tumor, histología y puntuación. Esto también permite la recolección de tejido congelado antes de la fijación del tejido pulmonar. Este método es limitado en el sentido de que no permite la cuantificación morfométrica posterior del pulmón; sin embargo, es más que suficiente para el análisis de tumores pulmonares a partir de modelos de ratón genéticamente modificados (GEMMs), modelos singénicos, así como estudios de tumores y metástasis xenógrafos.
Introduction
Existen una variedad de modelos de ratón de oncogenesis pulmonar y metástasis del cáncer hasta el pulmón que van desde GEMMs complejos hasta modelos inducidos por carcinógenos hasta modelos singénicos y xenógrafos, donde las células cancerosas se inyectan a través de intracardiaco, intratorácico, la vena de la cola u otros métodos para establecer tumores dentro del pulmón. Todos estos modelos comparten la necesidad común de evaluación histológica de histología pulmonar y patología. Por lo tanto, es necesario tener un método robusto pero rápido para realizar necropsias de ratones mientras se perfunden los pulmones para eliminar el exceso de sangre, e inflar y fijar los pulmones para visualizar claramente la arquitectura pulmonar. La velocidad es un componente crítico de este procedimiento, ya que puede ser necesario recoger los pulmones de docenas de ratones en un solo punto de tiempo. Este procedimiento se puede realizar en menos de 6 minutos por ratón.
Si bien este procedimiento es más que suficiente para evaluar la histología tumoral, no se recomienda para aquellos que deseen realizar estereología o mediciones morfométricas de los pulmones. Estas mediciones requieren que la inflación pulmonar se normalice, al igual que el cálculo de la superficie absoluta del pulmón, el volumen absoluto y el tamaño y el número1del alveolar. Este método tampoco es óptimo para algunos enfoques de imágenes. Por ejemplo, la toma de imágenes de los pulmones a través de μCT para el análisis morfométrico ex vivo requiere que los pulmones permanezcan llenos de aire2. Cuando la preservación de los espacios y dimensiones del aire son la principal preocupación, se recomienda fijar los pulmones mediante técnicas de deshidratación por perfusión3,4. Una de las mayores preocupaciones de este modelo es el potencial de rupturing de las paredes alveolares, disminuyendo su uso en estudios de enfisema; sin embargo, el procedimiento recomendado para la fijación de pulmones para el estudio del enfisema sigue siendo bastante similar, ya que se recomienda fijar los pulmones ya sea por instilación intratraqueal de 10% de formalina (similar al protocolo descrito aquí) bajo presión constante del líquido o por fijación in situ5.
La ventaja del procedimiento descrito aquí es que no requiere presión constante del líquido, sino que infla los pulmones hasta que se han expandido por completo, disminuyendo así el tiempo necesario para el procedimiento. El procedimiento aquí descrito se asemeja mucho a los métodos recomendados por un armamentoarium de la Sociedad de Patología Toxicológica, donde se formó un subcomité para recomendar los mejores métodos de fijación pulmonar para estudios toxicológicos. La mayoría de los científicos de este subcomité recomendaron arreglar los pulmones mediante instilación intratraqueal con una jeringa, aunque había diferentes recomendaciones sobre el momento en que el pulmón quedó en el fijador6. Por lo tanto, mientras que existe una variedad de métodos de inflación pulmonar y fijación, el método descrito aquí se propone para ser el método óptimo para inflar rápidamente y fijar los pulmones para la evaluación histológica tumoral aguas abajo.
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Protocol
Todos los métodos descritos aquí han sido aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de la Universidad de Alabama en Birmingham.
1. Protocolo experimental
- Sacrifique el ratón utilizando un método IACUC aprobado. Aquí, usamos la dislocación cervical de un ratón anestesiado con un 5% de isoflurano. Utilice un ratón adecuado para el estudio; aquí, usamos un ratón FVB de 8 semanas de edad
- Con tijeras quirúrgicas, realice una incisión horizontal de 3,5-5 mm en el centro del abdomen inferior. A continuación, inserte tijeras quirúrgicas en el pequeño agujero creado a partir de la incisión y corte verticalmente por la línea media central hasta justo debajo del cuello del ratón.
- Tire de la piel hacia atrás con los dedos e inspeccione los ganglios linfáticos axilares.
- Con tijeras quirúrgicas, realice una incisión lateral de 3,5 mm para abrir la cavidad abdominal y, a continuación, corte en la dirección anterior hasta la parte inferior del tórax. Inspeccione los órganos de la cavidad abdominal: hígado, bazo, riñones, etc.
- Con el plano de las tijeras quirúrgicas, o usando fórceps, mueva el hígado para exponer el diafragma. Inspeccione el diafragma en busca de crecimiento tumoral o metástasis. A continuación, recorte suavemente el diafragma en el lado derecho del operador, lo que le permite expandirse. Corte suavemente el diafragma de derecha a izquierda para exponer la cavidad torácica y los pulmones. Tenga cuidado de no cortar los pulmones.
- Corte a través del extremo lateral de la caja torácica izquierda (a la derecha del operador) para inspeccionar el lóbulo izquierdo de los pulmones.
- Mueva suavemente los lóbulos derecho del pulmón fuera del camino y corte el extremo lateral de la caja torácica derecha y retire la caja torácica.
NOTA: La extracción de la caja torácica es opcional, aunque la eliminación permite una visión más clara de la inflación pulmonar posterior.- Si se requiere tejido pulmonar fresco o congelado, utilice fórceps hemostat para sujetar el bronco del lóbulo izquierdo y resecar el pulmón izquierdo con tijeras quirúrgicas antes de la perfusión.
- Usando los fórceps para levantar el tejido que cubre la tráquea, cortar cualquier exceso de tejido. A continuación, corte suavemente el tejido delgado que recubre la tráquea para exponer las vías respiratorias.
- Corte la arteria renal con tijeras quirúrgicas.
- Para perfundir los pulmones, utilice una jeringa de 3 ml con una aguja de 22 G para inyectar 1 pbs con 10 U/ml de heparina en el ventrículo derecho del corazón. Perfundir lentamente los pulmones a aproximadamente 300 μL/s con PBS/heparina. Los pulmones con frecuencia se vuelven blancos. 2.5 mL de PBS se utilizan generalmente en este paso.
- Para la inflación pulmonar, utilice una jeringa de 3 ml con una aguja de 22 G, esta vez mantenida paralela a la tráquea. Inserte la aguja en la tráquea e inyecte un 10% de formalina con una velocidad de flujo no superior a ~200 μL/s hasta que los pulmones se hayan inflado por completo. Una vez inflados los pulmones, la formalina se reflujo fuera de la tráquea. Sujete la aguja en su lugar durante unos segundos más y luego retíriga.
- (Opcional) Antes de retirar la inflación de agujas y pulmones, utilice hilo de sutura para atar la tráquea. Para lograr esto, utilice 4 pulgadas de hilo de sutura que sostenga el punto de la rosca con un pequeño par de fórceps. Coloque el hilo en el lado dorsal de la tráquea y tire a través para hacer un bucle alrededor de la aguja. A continuación, haga un nudo de mano alrededor de la aguja. Tire del nudo apretado, retire la aguja de la tráquea, cierre el nudo.
- Utilice fórceps para levantar el corazón, inserte tijeras quirúrgicas directamente detrás de los pulmones y corte el tejido conectivo mientras levanta el corazón para resecar los pulmones.
- Corta el corazón para extraerlo de los pulmones.
- Coloque los pulmones un casete etiquetado con el ID del ratón o la identificación del estudio. Coloque el cassette en formalina tamponada al 10% y fije para 24-48 h. Los pulmones se pueden dejar en fijación durante más de un año si se desea.
- Transfiera el casete que contiene los pulmones al 70% de etanol y proceda al procesamiento para la histología.
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Representative Results
El protocolo anterior permite una perfusión rápida, inflación y fijación de los pulmones del ratón. Las cifras que se muestran a continuación representan la importancia de cada paso. La Figura 1 representa los pulmones manchados de H&E que han sido perfundidos con PBS y pulmones en los que se ha saltado el paso de perfusión o los pulmones no se perfundieron correctamente. Como se muestra, el exceso de sangre en los pulmones mal impregnados crea una histología menos que ideal y puede dificultar la observación completa de la arquitectura pulmonar. La Figura 2 demuestra tanto la importancia de la inflación como los peligros de la sobreinflación. Es más difícil identificar áreas de hiperplasia en pulmones no inflados debido a la compresión y proximidad de los alvéolos; sin embargo, en los pulmones sobreinflados, muchas de las paredes alveolares se han roto y esto podría confundirse con enfisema si no es cuidadoso. La Figura 3 representa la histología tumoral en los pulmones que han sido perfundidos e inflados utilizando la técnica descrita en este documento.
Figura 1: Tinción representativa de los pulmones perfundidos y no perfundidos. (A) Pulmones perfundidos con PBS. (B) Los pulmones no se perfunden. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Tinción H&E representativa de pulmones inflados, sin inflar y sobreinflados. (A) Los pulmones se inflaron y fijaron con un 10% de formalina hasta que los pulmones se expandieron por completo. (B) Los pulmones no se inflaron a través de la tráquea y en su lugar se colocaron directamente en un 10% de formalina. (C) Los pulmones se inflaron y fijaron con un 10% de formalina, pero el 10% de formalina se empujó continuamente a los pulmones más allá de la expansión completa, lo que resultó en una sobreinflación. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Tinción H&E representativa de pulmones de ratón perfundidos e inflados. (A) Los tumores pulmonares fueron inducidos utilizando el uretano carcinógeno químico. B) Metástasis pulmonares espontáneas de una línea celular xenógrada humana Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
El procedimiento descrito anteriormente para la perfusión, inflación y fijación de los pulmones de ratón es ideal para una preparación rápida y eficiente de los pulmones de ratón para la histología y el análisis patológico de tumores pulmonares. El procedimiento no requiere ningún equipo especial y se puede realizar en menos de 6 minutos por ratón. El procedimiento no requiere un volumen fijo para la inflación ni una presión fluida constante. Debido a que este procedimiento no está estandarizado, no se recomienda para aquellos que deseen realizar análisis estereológicos o morfométricos del pulmón. Los procedimientos en los que se requiere dicha normalización se han descrito mejor1,7.
Los pasos más críticos de este protocolo son la perfusión y la inflación. Es importante perfundir a través del ventrículo derecho del corazón, mientras que si la perfusión se realiza a través del ventrículo izquierdo, los pulmones no se perfunden. Es fácil saber si la perfusión se realiza correctamente, ya que los pulmones se volverán blancos. La instilación de fijación a través de la tráquea permite la inflación de los pulmones, lo que permite un análisis histológico más fácil de la arquitectura pulmonar. Es importante detener la administración de fijación tan pronto como los pulmones se hayan expandido por completo, ya que la sobreinflación puede causar rotura de la pared alveolar y la aparición de enfisema. Una vez inflados los pulmones, alguna formalina se reflujo de la tráquea. Esto es normal y no afecta el análisis histológico posterior; sin embargo, si esto es una preocupación, la tráquea puede ser atada antes de exculpar los pulmones.
Mientras que este protocolo utiliza formalina tamponada al 10% para fijar los pulmones, que es el fijador más comúnmente recomendado5,6, hay informes de artefactos introducidos por este fijador, a saber, contracción del tejido pulmonar1,8. Si esto es una preocupación, siga las directrices de la Sociedad Torácica Americana y la Sociedad Respiratoria Europea para la evaluación de la estructura pulmonar1. Otro fijador potencial no comúnmente recomendado, pero que puede resultar útil es la solución de Bouin, que puede proporcionar un mejor contraste para la evaluación de nódulos de superficie pulmonar9,10. En resumen, el protocolo descrito aquí proporciona un método robusto y simple para la fijación de pulmones de ratón para histología tumoral.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
La investigación reportada en esta publicación fue apoyada por el Centro Nacional para el Avance de las Ciencias Traslacionales bajo el número de premio UL1TR003096 (MDE), National Heart, Lung, and Blood Institute Predoctoral Fellowship in Lung Diseases Training Program 5T32HL134640 (MLD).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10% buffered formalin | Fisher | 23-245685 | |
| 22 G Needle | BD | 305155 | |
| 3 mL syringe | BD | 309656 | |
| 70% Ethanol | Decon | 2405 | |
| Forceps | Harvard Apparatus | 72-8595 | |
| Heparin | Fisher | H19 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Corning | 21-030-CV | |
| Surgical scissors | Harvard Apparatus | 72-8428 |
References
- Hsia, C. C., Hyde, D. M., Ochs, M., Weibel, E. R., Structure, A. An official research policy statement of the American Thoracic Society/European Respiratory Society: standards for quantitative assessment of lung structure. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 181 (4), 394-418 (2010).
- Vasilescu, D. M., Knudsen, L., Ochs, M., Weibel, E. R., Hoffman, E. A. Optimized murine lung preparation for detailed structural evaluation via micro-computed tomography. Journal of Applied Physiology. 112 (1), 159-166 (2012).
- Blumler, P., Acosta, R. H., Thomas-Semm, A., Reuss, S. Lung fixation for the preservation of air spaces. Experimental Lung Research. 30 (1), 73-82 (2004).
- Oldmixon, E. H., Suzuki, S., Butler, J. P., Hoppin, F. G. Perfusion dehydration fixes elastin and preserves lung air-space dimensions. Journal of Applied Physiology. 58 (1), 105-113 (1985).
- Braber, S., Verheijden, K. A., Henricks, P. A., Kraneveld, A. D., Folkerts, G. A comparison of fixation methods on lung morphology in a murine model of emphysema. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 299 (6), 843-851 (2010).
- Renne, R., et al. Recommendation of optimal method for formalin fixation of rodent lungs in routine toxicology studies. Toxicologic Pathology. 29 (5), 587-589 (2001).
- Limjunyawong, N., Mock, J., Mitzner, W. Instillation and Fixation Methods Useful in Mouse Lung Cancer Research. Journal of Visualized Experiments. (102), e52964 (2015).
- Lum, H., Mitzner, W. Effects of 10% formalin fixation on fixed lung volume and lung tissue shrinkage. A comparison of eleven laboratory species. American Review of Respiratory Disease. 132 (5), 1078-1083 (1985).
- Edmonds, M. D., et al. MicroRNA-31 initiates lung tumorigenesis and promotes mutant KRAS-driven lung cancer. Journal of Clinical Investigation. 126 (1), 349-364 (2016).
- Zhao, K., et al. Wogonin suppresses melanoma cell B16-F10 invasion and migration by inhibiting Ras-medicated pathways. PLoS One. 9 (9), 106458 (2014).
