Summary
Die Verwendung eines RNA-basierten Ansatzes zur Bestimmung quantitativer Immunprofile von soliden Tumorgeweben und zur Nutzung klinischer Kohorten für die Entdeckung von bioonkologischen Biomarkern wird durch molekulare und informatikische Protokolle beschrieben.
Abstract
Immuntherapien versprechen die Behandlung von onkologischen Patienten, aber die komplexe Heterogenität der Tumormikroumgebung macht die Vorhersage des Behandlungsreaktionens schwierig. Die Fähigkeit, die relativen Populationen von Immunzellen im und um das Tumorgewebe aufzulösen, hat sich als klinisch relevant für das Verständnis der Reaktion erwiesen, ist jedoch durch traditionelle Techniken wie Durchflusszytometrie und Immunhistochemie eingeschränkt ( IHC), aufgrund der großen Menge an Gewebe erforderlich, Mangel an genauen Zelltyp Marker, und viele technische und logistische Hürden. Ein Assay (z.B. der ImmunoPrism Immune Profiling Assay) überwindet diese Herausforderungen, indem er sowohl kleine Mengen an RNA als auch stark degradierte RNA, gemeinsame Merkmale von RNA, die aus klinisch archiviertem festem Tumorgewebe extrahiert werden, aufträgt. Der Zugriff auf den Test erfolgt über ein Reagenzien-Kit und Cloud-basierte Informatik, die eine durchgängige quantitative Immunprofilierungslösung mit hohem Durchsatz für Illumina-Sequenzierungsplattformen bietet. Die Forscher beginnen mit nur zwei Abschnitten formalinfixiertem Paraffin-eingebettetem (FFPE)-Gewebe oder 20-40 ng der gesamten RNA (je nach Probenqualität), und das Protokoll erzeugt einen Immunprofilbericht, der acht Immunzelltypen und zehn Immunescape- eine vollständige Sicht auf die Tumormikroumgebung. Für die Nutzung der resultierenden Daten ist keine zusätzliche bioinformatische Analyse erforderlich. Mit den entsprechenden Stichprobenkohorten kann das Protokoll auch verwendet werden, um statistisch signifikante Biomarker innerhalb einer Patientenpopulation von Interesse zu identifizieren.
Introduction
Quantifizierung von tumorinfiltrierenden Lymphozyten (TILs) und anderen immunbedingten Molekülen in formalinfixierten und paraffineingebetteten (FFPE) soliden Tumor-Humangewebeproben hat in der klinischen Forschung einen Wert gezeigt1,2,3. Häufige Techniken wie Durchflusszytometrie und singlezellige Ribonukleinsäure (RNA) Sequenzierung sind nützlich für frisches Gewebe und Blut4, aber sind ungeeignet für die Analyse von FFPE-Materialien aufgrund der Unfähigkeit, lebensfähige Zellsuspensionen zu schaffen. Aktuelle Methoden, die zur Quantifizierung dieser Zellen im FFPE-Gewebe verwendet wurden, leiden unter großen Herausforderungen. Die Immunhistochemie (IHC) und andere ähnliche bildgebende Arbeitsabläufe erfordern spezifische Antikörper zum Nachweis von Zelloberflächenproteinen, die laborübergreifend nur schwer zu standardisieren sind, um eine reproduzierbare Quantifizierung zu ermöglichen5. Plattformen wie das nCounter-System verlassen sich auf die Expression einzelner Gene, um wichtige Immunzellen zu definieren6, wodurch die Empfindlichkeit und Spezifität des Nachweises begrenzt wird. Allgemeinere RNA-Sequenzierungsmethoden, gekoppelt mit eigenständigen Software-Tools, sind verfügbar, erfordern jedoch eine signifikante Optimierung und Validierung vor der Verwendung7,8,9,10,11,12. Die jüngsten Fortschritte bei der Kombination von Lasercapture Microdissection (LCM) mit RNA-Sequenzierung für FFPE-Gewebe haben sich als vielversprechend erwiesen; Für translationale Studien zur Identifizierung robuster Biomarker13,14ist jedoch eine schlüsselfertigere Lösung mit höherem Durchsatz erforderlich. Methoden zur Erzeugung multidimensionaler Biomarker, wie z. B. Predictive Immune Modeling, die Patientenkohorten einschließlich Therapie-Responder, Krebssubtypen oder Überlebensergebnisse mit hoher Vorhersagegenauigkeit und statistischer Signifikanz definieren, werden im Zeitalter der Präzisionsmedizin und Immuntherapie immerwichtiger.
Um diesem Bedarf gerecht zu werden, wurde ein Immunprofiling-Assay entwickelt, um eine empfindliche und spezifische Quantifizierung von Immunzellen in soliden Tumor-FFPE-Geweben mit standardisierten RNA-Sequenzierungsreagenzien und Cloud-basierter Informatik zu ermöglichen. Neben der Aufnahme degradierter RNA aus FFPE-Gewebe ist das Protokoll in der Lage, RNA aus begrenzenden Gewebeproben wie Kernnadelbiopsien, Nadelaspirierungen und mikro- oder makroseziertem Gewebe aufzunehmen. RNA-Daten aus jeder Probe werden mit einer Datenbank von Genexpressionsmodellen von Immunzellen, den so genannten Immun-Gesundheitsexpressionsmodellen, verglichen, um Immunzellen als Prozentsatz der gesamtin der Probe vorhandenen Zellen zu quantifizieren. Kurz gesagt, wurden diese Modelle mit maschinellen Lernmethoden erstellt, um einzigartige multigene Expressionsmuster aus Ganzentranskriptomdaten zu identifizieren, die aus gereinigten Immunzellpopulationen (isoliert mit kanonischen Zell-Oberflächen-Markern)17,18erzeugt wurden. Die der Technologie zugrunde liegenden multidimensionalen Gesundheitsexpressionsmodelle ermöglichen es dem Assay, jede Immunzelle als Prozent der gesamtin der heterogenen Mischung vorhandenen Zellen zu quantifizieren. Dies ermöglicht es dem Forscher, Inter- und Intra-Sample-Immunzellvergleiche zu erzeugen, die nachweislich einen klinischen Wertvon 19,20haben. Weitere Anwendungen sind die Quantifizierung der Immunantwort vor und nach der Behandlung, wie in den repräsentativen Ergebnissen beschrieben. Der Assay berichtet über mehrere Merkmale der Immunkontexturierung des Tumors und der Tumormikroumgebung, einschließlich der absoluten Prozentsätze von acht Immunzelltypen (abgeleitet aus Genexpressionsmodellen): CD4+ T-Zellen, CD8+ T-Zellen, CD56+ Natural Killer-Zellen, CD19+ B-Zellen, CD14+ Monozyten, Tregs, M1-Makrophagen und M2-Makrophagen. Darüber hinaus meldet der Assay die Expression (in Transkripten pro Million oder TPM) von zehn Immun-Escape-Genen: PD-1, PD-L1, CTLA4, OX40, TIM-3, BTLA, ICOS, CD47, IDO1 und ARG1.
Das Reagenzien-Kit wird verwendet, um qualitativ hochwertige Bibliotheken für die Sequenzierung auf einer Illumina-Plattform nach einer hybriden Capture-basierten Bibliotheksvorbereitungsmethode bereit zu machen, wie in Abbildung 1dargestellt. Wenn ein Forscher keine Illumina-Sequenzierungsplattform in seinem Labor hat, kann er seine Proben zur Sequenzierung an ein Kernlabor übermitteln. Nach der Erstellung werden Sequenzierungsdaten zur automatisierten Analyse in das Prism-Portal hochgeladen, und dem Benutzer wird ein umfassendes, quantitatives Profil in Form des Immunberichts (Abbildung 2A) zurückgegeben. Benutzer können auch Stichprobengruppierungen im Prismenportal definieren, um einen Biomarker-Bericht zu erstellen (Abbildung 2B), in dem statistisch signifikante Biomarker hervorgehoben werden, die zwei Patientenkohorten unterscheiden. Wichtig ist, dass die vom Reagenzien-Kit generierten Daten nur für Forschungszwecke bestimmt sind und nicht für diagnostische Zwecke verwendet werden dürfen.
Abbildung 1: Übersicht über den Workflow. In diesem Protokoll wird DIE RNA zuerst in cDNA umgewandelt. Sequenzierungsadapter sind ligattiert, und adaptor-ligated cDNA wird von PCR verstärkt und barcodet, um eine Pre-Capture-Bibliothek zu erstellen. Biotinylierte Sonden werden dann zu bestimmten cDNA-Zielen hybridisiert, die dann mit Streptavidinperlen erfasst werden. Ungebundene, nicht zielgerichtete cDNA wird durch Waschen entfernt. Eine abschließende PCR-Anreicherung ergibt eine Nach-Capture-Bibliothek, die für die Sequenzierung bereit ist. *Die gesamte RNA muss aus menschlichen Proben stammen; intakte oder degradierte (FFPE) RNA sein. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Repräsentative Immunberichte. Der Workflow generiert zwei Berichte, einen individuellen Immunbericht (A) für jede verarbeitete Probe und einen Biomarker-Bericht (B) für definierte Patientenkohorten. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Das Protokoll benötigt ca. 16 h Vorbereitungszeit (von der gesamten RNA bis zu Bibliotheken, die für die Sequenzierung bereit sind); Es gibt jedoch eine Reihe von optionalen Haltepunkten, wie im Protokoll erwähnt. Der Assay nutzt die reiche, dynamische Natur der Transkriptomik, um über ältere Einzelanalyten-Biomarker zu multidimensionalen Genexpressionsmodellen überzugehen und so eine umfassende biologische Charakterisierung von Gewebeproben mit standardisierten Reagenzien und benutzerfreundliche Software-Tools. Es versetzt Forscher in die Lage, eine moderne Technologie in ihrem eigenen Labor zu nutzen, indem sie maschinelles Lernen und eine Datenbank von Health Expression Models nutzen, um genauere, quantitative requantitative Immunprofile wertvoller klinischer Proben abzuleiten und multidimensionale RNA-Biomarker mit vollständiger statistischer Analyse.
Protocol
Die in den hier gezeigten repräsentativen Ergebnissen verwendeten menschlichen Gewebeproben wurden von einer seriösen Einheit (TriStar Technology Group) erworben und verfügen über eine informierte Zustimmung der Spender, die akademische und kommerzielle Forschung sowie die Genehmigung einer zuständigen ethischen Ausschuss.
Teil I: Vorbereitung der Bibliotheksvorbereitung vor der Erfassung
1. RNA Quantifizierung und Qualifizierung
- Quantifizieren Sie die RNA mithilfe eines fluorometrischen Assays, um den geeigneten Input für den Assay zu bestimmen. Bewerten Sie die Qualität der Eingangs-RNA mithilfe der Elektrophorese, um die RNA-Integritätsnummer (RIN) und den Prozentsatz der Fragmente >200 Nukleotide (DV200) zu bestimmen.
- Für intakte (RIN > 7) oder teilweise abgebaute RNA-Proben (RIN = 2 bis 7) folgen Sie den Bibliotheksvorbereitungsschritten für hochwertige/intakte RNA, beginnend mit Schritt 2.1. Die Qualität der RNA ist wichtig für die Auswahl der richtigen Fragmentierungszeit im Thermal Cycler Program #1 (Ergänzende Tabelle 2).
- Bei stark abgebauten Proben (z.B. RIN = 1 bis 2 oder FFPE) wird der DV200-Wert ermittelt. Diese Proben erfordern keine Fragmentierung und folgen den Anweisungen für degradierte RNA, beginnend mit Schritt 2.2.
- Bereiten Sie die entsprechende Menge an Gesamt-RNA für jede Probe vor, indem Sie 20 ng RNA (High-Quality/Intact RNA with RIN > 2) oder 40 ng RNA (Degraded/FFPE RNA with DV200 > 20%) verdünnen. bis zu 5 l in nukleasefreiem Wasser. Die Verarbeitung von Proben mit DV200 < 20% wird nicht empfohlen. Für die mit dem Kit gelieferten RNA-Proben 1 l der entsprechenden RNA in 4 l nukleasefreiem Wasser verdünnen. Kontrollproben folgen der gleichen Verarbeitung wie für hochwertige (Intact) oder degradierte (FFPE) RNA-Materialien, wie sie beschriftet sind. Siehe Zusatztabelle 1 für alle im Kit enthaltenen Reagenzien.
2. RNA-Fragmentierung und Priming
- Folgen Sie Schritt 2.1.1 für hochwertige/intact RNA mit RIN > 2.
- Für hochwertige RNA die Fragmentierungs- und Grundierreaktion auf Eis in einem nukleasefreien PCR-Rohr nach Tabelle 1zusammensetzen.
- Mischen Sie gründlich durch Pipettieren nach oben und unten mehrmals. Drehen Sie dann die Proben in einer Mikrozentrifuge kurz
HINWEIS: Für alle Zentrifugenspins im Protokoll wird eine Geschwindigkeit von 1.000 x g für mindestens 3 s empfohlen. - Legen Sie die Proben in einen thermischen Cycler und verwenden Sie Programm #1 (Ergänzende Tabelle 2).
- Übertragen Sie die Röhren sofort auf Eis und fahren Sie mit First Strand cDNA Synthesis for High Quality RNA (Schritt 3.1) fort. Zur gleichzeitigen Vorbereitung von High Quality und FFPE RNA beginnen Sie mit der Vorbereitung der FFPE-RNA (Schritt 2.2) während der Fragmentierungsinkubation.
- Mischen Sie gründlich durch Pipettieren nach oben und unten mehrmals. Drehen Sie dann die Proben in einer Mikrozentrifuge kurz
- Für hochwertige RNA die Fragmentierungs- und Grundierreaktion auf Eis in einem nukleasefreien PCR-Rohr nach Tabelle 1zusammensetzen.
| Fragmentierung und Priming Mix | Volumen (L) |
| Intakte oder teilweise abgebaute RNA (20 ng) | 5 |
| Erster Strangsynthese-Reaktionspuffer | 4 |
| Random Primer | 1 |
| Gesamtvolumen | 10 |
Tabelle 1: Fragmentierung und Grundierungsreaktion für hochwertige RNA. Komponenten der Fragmentierungs- und Grundierungsreaktion für hochwertige RNA sollten entsprechend den gezeigten Volumen zusammengesetzt und auf Eis gemischt werden. Ein Master-Mix aus First Strand Synthesis Reaction Buffer und Random Primers kann hergestellt und den RNA-Proben hinzugefügt werden.
- Folgen Sie Schritt 2.2.1 für Degraded/FFPE RNA mit DV200 > 20%.
- Für stark degradierte (FFPE) RNA, die keine Fragmentierung erfordert, montieren Sie die Grundierungsreaktion, wie in Tabelle 2beschrieben. Für intakte RNA, denken Sie daran, Schritt 2.1 zu folgen.
- Mischen Sie gründlich durch Pipettieren nach oben und unten mehrmals. Dann drehen Sie die Proben in einer Mikrozentrifuge kurz herunter.
- Legen Sie die Proben in einen thermischen Cycler und verwenden Sie Programm #2 (Ergänzende Tabelle 2).
- Übertragen Sie die Röhren auf Eis und fahren Sie zur First Strand cDNA Synthesis for Highly Degraded (FFPE) RNA (Schritt 3.2) über.
- Für stark degradierte (FFPE) RNA, die keine Fragmentierung erfordert, montieren Sie die Grundierungsreaktion, wie in Tabelle 2beschrieben. Für intakte RNA, denken Sie daran, Schritt 2.1 zu folgen.
| Priming-Reaktion | Volumen (L) |
| FFPE RNA (40 ng) | 5 |
| Random Primer | 1 |
| Gesamtvolumen | 6 |
Tabelle 2: Zufällige Grundierungsreaktion für stark degradierte RNA. Komponenten der Grundierungsreaktion für stark abgebaute RNA sollten auf Eis in einem nukleasefreien PCR-Rohr montiert werden.
3. Erste Strang cDNA-Synthese
- Folgen Sie Schritt 3.1.1 für hochwertige/intact RNA mit RIN > 2.
- Für intakte RNA (hochwertig) die First Strand Synthesis Reaction auf Eis in einem nukleasefreien PCR-Rohr nach Tabelle 3montieren.
- Halten Sie die Reaktionen auf Eis, gründlich mischen, indem Sie mehrmals nach oben und unten. Drehen Sie die Proben in einer Mikrozentrifuge kurz herunter und fahren Sie direkt zur Inkubation der ersten Strangsynthese (Schritt 4) fort.
- Für intakte RNA (hochwertig) die First Strand Synthesis Reaction auf Eis in einem nukleasefreien PCR-Rohr nach Tabelle 3montieren.
| Erste Strangsynthese | Volumen (L) |
| Fragmentierte und grundierte RNA (Schritt 2.1.3) | 10 |
| First Strand Synthesis Specificity Reagenz | 8 |
| Erster Strangsynthese-Enzymmix | 2 |
| Gesamtvolumen | 20 |
Tabelle 3: Erste Strangsynthesereaktion für hochwertige RNA. Komponenten der Fragmentierungs- und Grundierungsreaktion für hochwertige RNA sollten entsprechend den angegebenen Volumen zusammengesetzt und auf Eis gemischt werden. Eine Master-Mischung aus First Strand Synthesis Specificity Reagenz und First Strand Synthesis Enzyme Mix kann hergestellt und zu den fragmentierten und grundierten RNA-Proben hinzugefügt werden.
- Folgen Sie Schritt 3.2.1 für Degraded/FFPE RNA mit DV200 > 20%.
- Für stark abgebaute RNA (FFPE) die First Strand Synthesis Reaction auf Eis in einem nukleasefreien PCR-Rohr nach Tabelle 4zusammensetzen.
- Halten Sie die Reaktionen auf Eis, gründlich mischen, indem Sie mehrmals nach oben und unten. Drehen Sie die Proben in einer Mikrozentrifuge kurz herunter und fahren Sie direkt zur Inkubation der ersten Strangsynthese (Schritt 4) fort.
- Für stark abgebaute RNA (FFPE) die First Strand Synthesis Reaction auf Eis in einem nukleasefreien PCR-Rohr nach Tabelle 4zusammensetzen.
| Erste Strangsynthese | Volumen (L) |
| Grundierte RNA (Schritt 2.2.3) | 6 |
| Erster Strangsynthese-Reaktionspuffer | 4 |
| First Strand Spezifitätsreagenz | 8 |
| Erster Strangsynthese-Enzymmix | 2 |
| Gesamtvolumen | 20 |
Tabelle 4: Erste Strangsynthesereaktion für stark abgebaute RNA. Komponenten der Fragmentierungs- und Grundierungsreaktion für stark abgebaute RNA sollten entsprechend den gezeigten Volumen zusammengesetzt und auf Eis gemischt werden. Ein Master-Mix aus First Strand Synthesis Reaction Buffer, First Strand Synthesis Specificity Reagent und First Strand Synthesis Enzyme Mix kann hergestellt und den grundierten RNA-Proben hinzugefügt werden.
4. Erste Strangsynthese Inkubation
- Halten Sie die Rohre auf Eis, mischen Sie gründlich durch Pipettieren nach oben und unten mehrmals. Drehen Sie die Proben in einer Mikrozentrifuge kurz herunter. Inkubieren Sie die Proben in einem vorgewärmten thermischen Cycler nach Programm #3 (Ergänzende Tabelle 2).
5. Zweite Strang cDNA-Synthese
- Bereiten Sie die zweite Strang-cDNA-Synthesereaktion auf Eis vor, indem Sie die in Tabelle 5aufgeführten Komponenten zusammensetzen, einschließlich des ersten Strangreaktionsprodukts aus Schritt 4.1.
| Zweite Strangsynthese-Reaktion | Volumen (L) |
| Erstes Strangsyntheseprodukt (Schritt 4.1) | 20 |
| Zweiter Strangsynthese-Reaktionspuffer | 8 |
| Zweiter Strangsynthese-Enzymmix | 4 |
| Nukleasefreies Wasser | 48 |
| Gesamtvolumen | 80 |
Tabelle 5: Reaktion der zweiten Strangsynthese. Die Komponenten der zweiten Strang-cDNA-Synthesereaktion sollten entsprechend den dargestellten Volumen zusammengesetzt und auf Eis gemischt werden. Ein Master-Mix aus dem Second Strand Synthesis Reaction Buffer, Second Strand Synthesis Enzyme Mix und Nuclease-free Water kann hergestellt und dem First Strand Synthesis Product hinzugefügt werden.
- Halten Sie die Rohre auf Eis, mischen Sie gründlich durch Pipettieren nach oben und unten mehrmals. Inkubieren Inkubation in einem thermischen Cycler nach Programm #4 (Zusatztabelle 2).
6. cDNA Cleanup mit SPRI (Solid Phase Reversible Immobilisierung) Perlen
- Lassen Sie die SPRI-Perlen vor Gebrauch mindestens 30 min auf Raumtemperatur erwärmen und wirbeln Sie dann SPRI-Perlen für ca. 30 s, um sie wieder aufzusetzen.
- Fügen Sie der zweiten Strangsynthesereaktion 144 L resuspendierte Perlen hinzu(80). Mischen Sie gut durch Pipettiern nach oben und unten mindestens 10 Mal und inkubieren für 5 min bei Raumtemperatur.
- Drehen Sie die Rohre kurz in einer Mikrozentrifuge und legen Sie die Rohre auf ein magnetisches Rack, um Perlen vom Überstand zu trennen. Nachdem die Lösung klar ist, entfernen und entsorgen Sie den Überstand sorgfältig. Achten Sie darauf, die Perlen, die DNA enthalten, nicht zu stören.
- Fügen Sie 180 l frisch zubereitetes 80% Ethanol in die Rohre, während auf dem magnetischen Rack. Bei Raumtemperatur für 30 s inkubieren und dann den Überstand vorsichtig entfernen und entsorgen.
- Wiederholen Sie Schritt 6.4 einmal für insgesamt 2 Waschschritte.
- Entfernen Sie das Restethanol vollständig. Lassen Sie die Rohre auf dem Magnetgestell und die Luft trocknen die Perlen für ca. 3 min mit dem Deckel offen, oder bis sichtbar trocken. Trocknen Sie die Perlen nicht übertrocknen, da dies zu einer geringeren Wiederherstellung der DNA führen kann.
- Entfernen Sie die Rohre vom Magneten und fügen Sie den Perlen 53 L 0,1x TE Buffer (im Reagenzien-Kit enthalten, siehe Ergänzungstabelle 1) hinzu. Pipette mindestens 10 Mal rauf und runter, um gründlich zu mischen. 2 min bei Raumtemperatur inkubieren.
- Legen Sie die Rohre auf ein magnetisches Rack, so dass Perlen vollständig vom Überstand getrennt werden können. Übertragen Sie 50 l des Überstandes, um nukleasefreie PCR-Rohre zu reinigen. Achten Sie darauf, die Perlen nicht zu stören. Dies ist ein optionaler Haltepunkt im Protokoll, cDNA-Proben können bei -20 °C gespeichert werden.
7. Ende der Reparatur der cDNA-Bibliothek
- Montieren Sie die Endreparaturreaktion auf Eis, indem Sie die in Tabelle 6 aufgeführten Komponenten zum zweiten Strangsyntheseprodukt aus Schritt 6.8 zusammenbauen.
| End-Reparatur-Reaktion | Volumen (L) |
| Zweites Strangsyntheseprodukt (Schritt 6.8) | 50 |
| End Repair Reaction Buffer | 7 |
| Ende Reparatur Enzyme Mix | 3 |
| Gesamtvolumen | 60 |
Tabelle 6: Reparaturreaktion beenden. Die Komponenten der Endreparaturreaktion sollten entsprechend den dargestellten Volumen auf Eis montiert und gemischt werden. Ein Master-Mix aus dem End Repair Reaction Buffer und dem End Repair Enzyme Mix kann hergestellt und dem Second Strand Synthesis Product hinzugefügt werden.
- Stellen Sie eine Pipette auf 50 l und pipette dann das gesamte Volumen nach oben und unten mindestens 10 Mal gründlich mischen. Kurz Zentrifuge, um alle Flüssigkeit von den Seiten der Rohre zu sammeln. Es ist wichtig, gut zu mischen. Das Vorhandensein einer kleinen Menge von Blasen wird die Leistung nicht beeinträchtigen.
- Inkubieren Sie die Proben in einem thermischen Cycler nach Programm #5 (Ergänzende Tabelle 2).
8. Adaptor Ligation
- Verdünnen Sie vor dem Einrichten der Ligationsreaktion den Adapter im eiskalten Adaptor-Verdünnungspuffer, wie in Tabelle 7dargestellt, multiplizieren Sie mit der erforderlichen Anzahl von Proben plus 10 % mehr. Den verdünnten Adapter auf Eis halten.
| Ligation sdilution | Volumen (L) |
| Adapter | 0.5 |
| Adapter-Verdünnungspuffer | 2 |
| Gesamtvolumen | 2.5 |
Tabelle 7: Adapterverdünnung. Der Adapter sollte auf Eis mit Adapterverdünnungspuffer entsprechend den dargestellten Volumen verdünnt werden.
- Montieren Sie die Ligationsreaktion auf Eis, indem Sie die in Tabelle 8beschriebenen Komponenten in der angegebenen Reihenfolge zum Endvorbereitungsreaktionsprodukt aus Schritt 7.3 hinzufügen. Beachten Sie, dass der Ligation Master Mix und Ligation Enhancer im Voraus gemischt werden können. Diese Mischung ist für mindestens 8 h bei 4 °C stabil. Mischen Sie den Ligation Master Mix, Ligation Enhancer und Adaptor nicht vor der Verwendung im Adaptor Ligation Step vor.
| Ligationsreaktion | Volumen (L) |
| Ende der vorbereiteten DNA (Schritt 7.3) | 60 |
| Verdünnter Adapter (Schritt 8.1) | 2.5 |
| Ligation Enhancer | 1 |
| Ligation Master Mix | 30 |
| Gesamtvolumen | 93.5 |
Tabelle 8: Ligationsreaktion. Die Komponenten der Adaptorligationsreaktion sollten entsprechend den in der angegebenen Reihenfolge dargestellten Volumen auf Eis montiert werden. Ein Master-Mix aus Ligation Enhancer und Ligation Master Mix kann mit diluted Adaptor hergestellt und der End Prepped DNA hinzugefügt werden. Mischen Sie den verdünnten Adapter und den Ligation Master Mix oder Ligation Enhancer nicht vor dem Mischen der mit der End Prepped DNA.
- Stellen Sie eine Pipette auf 80 l und pipette dann das gesamte Volumen nach oben und unten mindestens 10 Mal gründlich mischen. Führen Sie eine schnelle Drehung durch, um die gesamte Flüssigkeit von den Seiten der Rohre zu sammeln. Der Ligation Master Mix ist sehr zähflüssig. Achten Sie darauf, eine ausreichende Mischung der Ligationsreaktion zu gewährleisten, da eine unvollständige Vermischung zu einer reduzierten Ligationseffizienz führt. Das Vorhandensein einer kleinen Menge von Blasen wird die Leistung nicht beeinträchtigen.
- Inkubieren Sie nach Programm #6 (Ergänzende Tabelle 2), und entfernen Sie dann die Ligationsmischung aus dem thermischen Cycler und fügen Sie 3 l adaptor Processing Enzyme hinzu, was zu einem Gesamtvolumen von 96,5 l führt.
- Pipette nach oben und unten mehrmals gut zu mischen, und dann inkubieren nach Programm #7 (Ergänzung Tabelle 2) bevor Sie sofort zur Reinigung der Ligation Reaktion.
9. Reinigung der Ligationsreaktion mit SPRI Neads
- Lassen Sie SPRI Beads vor Gebrauch mindestens 30 min auf Raumtemperatur erwärmen und wirbeln Sie dann SPRI-Perlen für ca. 30 s, um sie wieder aufzusetzen.
- Fügen Sie 87 L von resuspendierten SPRI-Perlen hinzu und mischen Sie gut, indem Sie mindestens 10 Mal nach oben und unten pfeifen. 10 min bei Raumtemperatur inkubieren.
- Drehen Sie die Rohre kurz in einer Mikrozentrifuge und legen Sie die Rohre auf ein magnetisches Rack, um Perlen vom Überstand zu trennen. Nachdem die Lösung klar ist (ca. 5 min), entfernen Sie den Überstand sorgfältig und entsorgen Sie ihn. Entsorgen Sie die Perlen nicht.
- Fügen Sie 180 l frisch zubereitetes 80% Ethanol in die Rohre, während auf dem magnetischen Rack. Bei Raumtemperatur für 30 s inkubieren und dann den Überstand vorsichtig entfernen und entsorgen. Wiederholen Sie Schritt 9.4 einmal für insgesamt 2 Waschschritte.
- Entfernen Sie das Restethanol vollständig. Lassen Sie die Rohre auf dem Magnetgestell und die Luft trocknen die Perlen für ca. 3 min mit dem Deckel offen, oder bis sichtbar trocken. Trocknen Sie die Perlen nicht übertrocknen, da dies zu einer geringeren Wiederherstellung der DNA führen kann.
- Entfernen Sie die Rohre vom Magneten und fügen Sie den Perlen 17 L 0,1x TE-Puffer hinzu. Pipette mindestens 10 Mal rauf und runter, um gründlich zu mischen. Inkubieren Sie für 2 min bei Raumtemperatur, und legen Sie dann die Rohre auf einem magnetischen Rack, so dass Perlen vollständig vom Überstand zu trennen.
- Übertragen Sie 15 L des Überstandes, um nukleasefreie PCR-Rohre zu reinigen. Achten Sie darauf, die Perlen nicht zu stören. Dies ist ein optionaler Haltepunkt im Protokoll, die Adaptor-ligted DNA kann bei -20 °C gespeichert werden.
10. PCR-Anreicherung von Adaptor Ligated DNA
- Richten Sie die PCR-Reaktion wie in Tabelle 9beschrieben ein. Ein Master Mix mit dem Pre-Capture PCR Master Mix und dem Universal Primer kann hergestellt und der Adaptor-Liga-DNA hinzugefügt werden. Verwenden Sie für die Multiplexsequenzierung für jede Reaktion eindeutige Indexprimer, und fügen Sie jede Probe einzeln hinzu.
| PCR-Anreicherung | Volumen (L) |
| Adaptor-ligated DNA (Schritt 10.1) | 15 |
| Pre-Capture PCR Master Mix | 25 |
| Universeller PCR Primer | 5 |
| Index (X) Primer | 5 |
| Gesamtvolumen | 50 |
Tabelle 9: PCR-Anreicherung von adaptorligierter DNA. Komponenten der PCR-Anreicherung der adaptorligierten DNA-Reaktion sollten entsprechend den dargestellten Volumen auf Eis montiert und gemischt werden. Ein Master-Mix aus dem Pre-Capture PCR Master Mix und dem Universal PCR Primer kann hergestellt und der adaptoren LIGAttten-DNA hinzugefügt werden. Für multiplexige Sequenzierung sollte jedem Beispiel ein eindeutiger Indexprimer gegeben werden.
- Mischen Sie gut, indem Sie sanft nach oben und unten 10 mal. Drehen Sie die Rohre kurz in einer Mikrozentrifuge und legen Sie sie in einen thermischen Cycler und führen Sie die PCR-Verstärkung mit Program #8 (Zusatztabelle 2) durch.
11. Reinigung der PCR-Reaktion mit SPRI-Perlen
- Lassen Sie SPRI Beads vor Gebrauch mindestens 30 min auf Raumtemperatur erwärmen und wirbeln Sie dann SPRI-Perlen für ca. 30 s, um sie wieder aufzusetzen.
- Fügen Sie jeder PCR-Reaktion 45 L resuspendierte Perlen hinzu(50 ). Mischen Sie gut durch Pipettieren nach oben und unten mindestens 10 Mal, bevor Sie für 5 min bei Raumtemperatur inkubieren.
- Drehen Sie die Rohre kurz in einer Mikrozentrifuge und legen Sie die Rohre auf ein magnetisches Rack, um Perlen vom Überstand zu trennen. Nachdem die Lösung klar ist (ca. 5 min), entfernen Sie den Überstand sorgfältig und entsorgen Sie ihn. Achten Sie darauf, die Perlen, die DNA enthalten, nicht zu stören.
- Fügen Sie 180 l frisch zubereitetes 80% Ethanol in die Rohre, während in der magnetischen Rack. Bei Raumtemperatur für 30 s inkubieren und dann den Überstand vorsichtig entfernen und entsorgen. Wiederholen Sie Schritt 11.4 einmal für insgesamt 2 Waschschritte.
- Entfernen Sie das Restethanol vollständig. Lassen Sie die Rohre auf dem Magnetgestell und die Luft trocknen die Perlen für ca. 3 min mit dem Deckel offen, oder bis sichtbar trocken. Trocknen Sie die Perlen nicht übertrocknen, da dies zu einer geringeren Wiederherstellung der DNA führen kann.
- Entfernen Sie die Rohre vom Magneten und fügen Sie den Perlen 23 L 0,1x TE Buffer hinzu. Pipette mindestens 10 Mal rauf und runter, um gründlich zu mischen. 2 min bei Raumtemperatur inkubieren.
- Legen Sie die Rohre auf ein magnetisches Rack, so dass Perlen vollständig vom Überstand getrennt werden können. Übertragen Sie 20 L des Überstandes, um nukleasefreie PCR-Rohre zu reinigen. Achten Sie darauf, die Perlen nicht zu stören. Dies ist ein optionaler Stopppunkt im Protokoll, Pre-Capture-Bibliotheken können bei -20 °C gespeichert werden.
12. Validierung und Quantifizierung der Pre-Capture-Bibliothek
- Messen Sie die Konzentration der Pre-Capture-Bibliothek mit einem Fluorometer und einem Testkit mit hoher Empfindlichkeit. Für den Fortfahren zu Teil II: Hybridisierung und Erfassung ist eine Mindestausbeute von 200 ng erforderlich.
- Führen Sie 1 L Bibliothek auf einem digitalen Elektrophoresesystem aus. Verdünnen Sie die Probe bei Bedarf, um eine Überlastung des High Sensitivity Chips gemäß den Protokollempfehlungen des Herstellers zu vermeiden.
- Stellen Sie fest, dass das Elektropherogramm eine schmale Verteilung mit einer Spitzengröße von etwa 250-400 bp zeigt (siehe Repräsentative Ergebnisse, Abbildung 3 und Abbildung 4).
- Wenn ein 128 bp Peak (Adapter-Dimer) in den Bioanalyzer-Spuren sichtbar ist und die Intensität des Signals die Intensität von 250-400 bp Bibliothekssignal beträgt (siehe Repräsentative Ergebnisse, Abbildung 5), und dann das Probenvolumen (von Schritt 11,7) auf 50 l mit 0,1x TE-Puffer aufnimmt und die SPRI-Bead-Reinigung wiederholt (Schritt 11). Dies ist ein optionaler Stopppunkt im Protokoll, Pre-Capture-Bibliotheken können bei -20 °C gespeichert werden, bevor Sie zu Teil II: ImmunoPrism Hybridization und Capture wechseln.
Teil II: Hybridisierung und Erfassung
13. Kombinieren Sie blockierende Oligos, Cot-1 DNA, Pre-Capture Library DNA und Dry
- Mischen Sie die in Schritt 11 und Quantified in Step 12 vorbereitete Barcode-Bibliothek mit Cot-1 DNA und Blocking Oligos in einem nukleasefreien PCR-Rohr oder 1,5 ml Mikrorohr, wie in Tabelle 10dargestellt.
| Reagenz | Menge/Volumen |
| Barcode-Bibliothek aus Schritt 10.10 | 200 ng |
| Cot-1 DNA | 2 g |
| Oligos blockieren | 2 l |
Tabelle 10: Hybridisierungsvorbereitung und Austrocknung. Komponenten, die zur Trocknung von Bibliotheken zur Vorbereitung der Hybridisierung kombiniert werden sollen, sollten entsprechend den dargestellten Mengen montiert werden.
- Trocknen Sie den Inhalt des Rohres mit einem Vakuumkonzentrator, der auf 30-45 °C eingestellt ist. Dies ist ein optionaler Stopppunkt im Protokoll. Nach dem Trocknen können Die Rohre über Nacht bei Raumtemperatur (15-25 °C) oder länger bei -20 °C gelagert werden.
14. Hybridisieren von DNA-Capture-Sonden mit der Bibliothek
- Thaw 2x Bead Wash Buffer and Hybridization Buffer, Hybridization Buffer Enhancer, ImmunoPrism Probe Panel, 10x Wash Buffer 1, 10x Wash Buffer 2, 10x Wash Buffer 3 und 10x Stringent Wash Buffer bei Raumtemperatur. Prüfen Sie vor der Verwendung den Hybridisierungspuffer auf Kristallisation von Salzen. Wenn Kristalle vorhanden sind, erhitzen Sie das Rohr bei 65 °C, schütteln Sie es zeitweise, bis der Puffer vollständig verwoben ist.
- Erstellen Sie bei Raumtemperatur den Hybridisierungsmastermix in einem Rohr. Multiplizieren Sie die Volumen mit der Anzahl der Stichproben, und fügen Sie 10 % mehr hinzu, wie aus Tabelle 11folgt.
| HybridisierungMaster Mix | Volumen (L) |
| Hybridisierungspuffer | 8.5 |
| Hybridisierungspuffer-Enhancer | 2.7 |
| ImmunoPrism-Sonden-Panel | 5 |
| Nukleasefreies Wasser | 0.8 |
| Gesamtvolumen | 17 |
Tabelle 11: Hybridisierungsmaster-Mix. Komponenten des Hybridisierungs-Master-Mix sollten entsprechend den dargestellten Volumen bei Raumtemperatur montiert und gemischt werden.
- Vortex oder Pipette nach oben und unten, um gut zu mischen. Fügen Sie dann 17 L des Hybridisierungs-Master-Mix zu jedem Rohr hinzu, das getrocknete DNA enthält. Versiegeln Sie die Rohre und brüten Sie für 5 min bei Raumtemperatur.
- Wirbeln Sie die Proben, um sicherzustellen, dass sie vollständig gemischt sind, und drehen Sie die Proben kurz in einer Mikrozentrifuge. Übertragen Sie ggf. jede Probe von einem 1,5 ml Mikrorohr in ein nukleasefreies PCR-Rohr.
- Legen Sie die Proben in einen thermischen Cycler und führen Sie Programm #9 (Ergänzende Tabelle 2).
- Während der Inkubation die Waschpuffer (Schritt 15) und Streptavidinperlen (Schritt 16) vorbereiten, so dass genügend Zeit zur Vorwärmung und zum Ausgleich der Streptavidinperlen zur Zeit ist.
15. Bereiten Sie Waschpuffer vor
HINWEIS: Waschpuffer werden als 2x (Bead Wash Buffer) oder 10x (alle anderen Waschpuffer) konzentrierten Lösungen geliefert.
- Verdünnen Sie während der Hybridisierungsinkubation den 2x Bead Wash Buffer und die 10x Wash Buffers, um 1x Arbeitslösungen zu erstellen, multiplizieren Sie mit der erforderlichen Anzahl von Proben und fügen Sie 10% zusätzliche hinzuzufügen, nach Tabelle 12. Wenn 10x Waschpuffer 1 trüb ist, erhitzen Sie die Flasche in einem 65 °C Wasserbad oder Heizblock, um Partikel wieder aufzuhängen. 1x Waschpuffer gefroren, sollte nach dem Auftauen gemischt werden.
| Waschpuffer | Konzentrierter Puffer (L) | Nukleasefreies Wasser (L) | Gesamt (L) |
| Perlenwaschpuffer | 150 | 150 | 300 |
| Waschpuffer 1 | 25 | 225 | 250 |
| Waschpuffer 2 | 15 | 135 | 150 |
| Waschpuffer 3 | 15 | 135 | 150 |
| Stringent Wash Buffer | 30 | 270 | 300 |
Tabelle 12: Waschpufferverdünnung. Die Konzentrationswaschpuffer sollten entsprechend den dargestellten Volumen mit nukleasefreiem Wasser bei Raumtemperatur verdünnt werden.
- Aliquot die 1x Waschpuffer in nukleasefreie PCR-Rohre und legen Sie bei den entsprechenden Temperaturen, wie in Tabelle 13angegeben . Achten Sie darauf, ausreichend Überage für Pipettierung enthalten. Verwenden Sie für beheizte Puffer einen thermischen Cycler, der auf 65 °C eingestellt ist, wobei der Deckel auf 70 °C eingestellt ist.
| Waschpuffer | Haltetemperatur | Volumen/Rohr (L) | Anzahl der Rohre/Probe |
| Perlenwaschpuffer | RT (15-25 °C) | 100 | 3 |
| Waschpuffer 1 | 65 °C | 100 | 1 |
| Waschpuffer 1 | RT (15-25 °C) | 150 | 1 |
| Waschpuffer 2 | RT (15-25 °C) | 150 | 1 |
| Waschpuffer 3 | RT (15-25 °C) | 150 | 1 |
| Stringent Wash Buffer | 65 °C | 150 | 2 |
Tabelle 13: Verdünnte Waschpuffer. Die verdünnten Waschpuffer sollten entsprechend dem Volumen und der Anzahl der untersuchten Rohre pro Probe in getrennte Rohre eingegliedert werden. Waschpuffer müssen vor der Verwendung bei der angegebenen Temperatur gehalten werden.
- Bereiten Sie den Bead Resuspension Mix bei Raumtemperatur vor, wie in Tabelle 14dargestellt, multiplizieren Sie mit der erforderlichen Anzahl von Proben und fügen Sie 10 % mehr hinzu.
| Bead Resuspension Mix | Volumen (L) |
| Hybridisierungspuffer | 8.5 |
| Hybridisierungspuffer-Enhancer | 2.7 |
| Nukleasefreies Wasser | 5.8 |
| Gesamtvolumen | 17 |
Tabelle 14: Bead Resuspension Mix. Komponenten von Bead Resuspension Mix sollten je nach den dargestellten Volumen bei Raumtemperatur montiert und gemischt werden.
16. Bereiten Sie die Streptavidin Perlen
- Gleichgewichtsstreptavidinperlen bei Raumtemperatur mindestens 30 min vor Gebrauch. Mischen Sie die Perlen gründlich, indem Sie für 15 s und aliquot 50 l Perlen pro Aufnahme in eine nukleasefreie PCR-Röhre wirbeln.
- Fügen Sie jedem Rohr 100 L 1x 1x Bead Wash Buffer (vorbereitet in Schritt 15.1) hinzu. Sanft Pipette nach oben und unten 10 Mal zu mischen. Legen Sie das Rohr auf ein magnetisches Rack, so dass Perlen vollständig vom Überstand getrennt werden können.
- Entfernen und entsorgen Sie den klaren Überstand. Achten Sie darauf, die Perlen nicht zu stören.
- Führen Sie die folgende Wäsche durch.
- Entfernen Sie aus dem magnetischen Rack. Fügen Sie 100 l 1x Bead Wash Buffer zu jedem Rohr mit Perlen hinzu, und dann Pipette nach oben und unten 10 Mal zu mischen.
- Legen Sie das Rohr in das magnetische Rack, so dass Perlen vollständig vom Überstand getrennt werden können.
- Entfernen und entsorgen Sie den klaren Überstand vorsichtig.
- Wiederholen Sie Schritt 16.4 einmal für insgesamt zwei Wähbe.
- Entfernen Sie aus dem magnetischen Rack. Fügen Sie 17 L Bead Resuspension Mix aus Schritt 15.3 zu jedem Rohr hinzu. Pipette auf und ab mehrmals gründlich mischen. Stellen Sie sicher, dass Die Perlen nicht an den Seiten der Rohre kleben. Drehen Sie bei Bedarf kurz die Rohre, um die Perlen an der Unterseite zu sammeln.
17. Binden Sie hybridisiertes Ziel an die Streptavidin-Perlen
- Nachdem die 4-stündige Hybridisierungsinkubation abgeschlossen ist, entfernen Sie die Proben aus dem Thermischen Cycler und stellen Sie den Thermischen Cycler auf 65 °C mit dem beheizten Deckel auf 70 °C eingestellt.
- Übertragen Sie mit einer Mehrkanalpipette 17 L vollständig homogenisierte Perlen auf die Proben. Mischen Sie gründlich durch Pipettieren nach oben und unten 10 mal.
- Binden Sie die DNA an die Perlen, indem Sie die Röhren in den thermischen Cycler nach Programm #10 (Ergänzende Tabelle 2). Während der Inkubation die Streifenrohre alle 10-12 min kurz entfernen und vorsichtig für 3 s wirbeln, um sicherzustellen, dass die Perlen in Suspension bleiben. Alternativ können Sie durch Pipettieren mehrmals nach oben und unten mischen. Fahren Sie sofort fort, um Streptavidin Perlen zu waschen (Schritt 18).
18. Wash Streptavidin Perlen ungebundene DNA zu entfernen
- Verwenden Sie die 1x Waschpuffer aus Schritt 15.2 und speichern Sie beheizte Puffer während der Wäsche im Thermischen Cycler.
- Fügen Sie den Rohren ab Schritt 17.3 100 l vorgeheizten 1x Waschpuffer 1 hinzu. Mischen Sie gründlich durch Pipettieren nach oben und unten 10 mal. Legen Sie die Rohre auf ein magnetisches Rack, so dass Perlen vollständig vom Überstand getrennt werden können.
- Pipette und entsorgen Sie den Überstand, der ungebundene DNA enthält. Entfernen Sie aus dem magnetischen Rack.
- Führen Sie die folgenden 65 °C waschen.
- Fügen Sie 150 l vorgeheizten 1x Stringent Wash Buffer hinzu.
- Mischen Sie gründlich durch Pipettierung nach oben und unten mindestens 10 Mal. Vermeiden Sie Blasen beim Pipetieren. Achten Sie darauf, dass Perlen vollständig in allen Röhren resuspendiert sind.
- Inkubieren Sie im thermischen Cycler bei 65 °C für 5 min.
- Legen Sie die Rohre auf ein magnetisches Rack, so dass Perlen vollständig vom Überstand getrennt werden können. Pipette und entsorgen Sie den Überstand, der ungebundene DNA enthält. Entfernen Sie aus dem magnetischen Rack.
- Wiederholen Sie Schritt 18.4 für insgesamt zwei Strenge Washes.
- Führen Sie die erste Raumtemperaturwäsche durch.
- Fügen Sie 150 l Raumtemperatur 1x Waschpuffer 1 hinzu.
- Pipette 10 bis 20 Mal rauf und runter, um die Perlen vollständig zu suspendieren.
- Versiegeln Sie die Rohre und brüten für 2 min, abwechselnd zwischen sanftwirbeln für 30 s und ruhen für 30 Sekunden. Achten Sie darauf, dass Perlen in allen Brunnen während der gesamten Inkubation vollständig in allen Röhren resuspendedn.
- Kurz zentrieren Sie die Rohre.
- Legen Sie die Rohre auf ein magnetisches Rack, so dass Perlen vollständig vom Überstand getrennt werden können. Pipette und entsorgen Sie den Überstand.
- Versiegeln Sie die Rohre und zentrieren Sie kurz. Kehren Sie zum magnetischen Rack zurück und verwenden Sie eine 10-l-Pipette, um restliche Waschpuffer zu entfernen.
- Führen Sie die zweite Raumtemperaturwäsche durch.
- Fügen Sie 150 l Raumtemperatur 1x Waschpuffer 2 hinzu.
- Pipette 10 bis 20 Mal rauf und runter, um die Perlen vollständig zu suspendieren.
- Versiegeln Sie die Rohre und brüten für 2 min, abwechselnd zwischen sanftwirbeln für 30 s und ruhen für 30 Sekunden. Achten Sie darauf, dass Perlen in allen Brunnen während der gesamten Inkubation vollständig in allen Röhren resuspendedn.
- Kurz zentrieren Sie die Rohre.
- Übertragen Sie das gesamte Volumen der in Wash Buffer 2 aufgehängten Perlen, um nukleasefreie PCR-Rohre zu reinigen. Wichtig: Die Übertragung der Perlen auf frische Schläuche ist wichtig, um eine Außerhalb des Ziels zu vermeiden.
- Legen Sie die Rohre auf ein magnetisches Rack, so dass Perlen vollständig vom Überstand getrennt werden können. Pipette und entsorgen Sie den Überstand.
- Versiegeln Sie die Rohre und zentrieren Sie kurz. Kehren Sie zum magnetischen Rack zurück und verwenden Sie eine 10-l-Pipette, um restliche Waschpuffer zu entfernen.
- Führen Sie die dritte Raumtemperaturwäsche durch.
- Fügen Sie 150 l Raumtemperatur 1x Waschpuffer 3 hinzu.
- Pipette 10 bis 20 Mal rauf und runter, um die Perlen vollständig zu suspendieren.
- Versiegeln Sie die Rohre und brüten für 2 min, abwechselnd zwischen sanftwirbeln für 30 s und ruhen für 30 Sekunden. Achten Sie darauf, dass Perlen in allen Brunnen während der gesamten Inkubation vollständig in allen Röhren resuspendedn.
- Kurz zentrieren Sie die Rohre.
- Legen Sie die Rohre auf ein magnetisches Rack, so dass Perlen vollständig vom Überstand getrennt werden können. Pipette und entsorgen Sie den Überstand.
- Versiegeln Sie die Rohre und zentrieren Sie kurz. Kehren Sie zum magnetischen Rack zurück und verwenden Sie eine 10-L-Pipette, um restliche Waschpuffer zu entfernen.
- Entfernen Sie aus dem magnetischen Rack und fügen Sie den Perlen 20 L nukleasefreies Wasser hinzu.
- Pipette nach oben und unten 10 Mal, um sicherzustellen, dass Perlen an der Seite der Rohre geklebt wurden resuspended.
- Wichtig: Entsorgen Sie die Perlen nicht. Verwenden Sie in Schritt 19 die gesamten 20 L resuspendierten Perlen mit erfasster DNA.
19. Führen Sie finale, Post-Capture PCR-Anreicherung
- Bereiten Sie den Post-Capture PCR Master Mix gemäß der folgenden Tabelle vor, multiplizieren Sie mit der erforderlichen Anzahl von Proben und fügen Sie gemäß Tabelle 1510 % mehr hinzu.
| Post-Capture PCR Master Mix Component | Volumen (L) |
| Post-Capture PCR MasterMix | 25 |
| Post-Capture PCR Primer Mix | 1.25 |
| Nukleasefreies Wasser | 3.75 |
| Gesamtvolumen | 30 |
Tabelle 15: PCR-Master-Mix nach der Erfassung. Komponenten von Post-Capture PCR Master Mix sollten entsprechend den gezeigten Volumen auf Eis montiert und gemischt werden.
- Fügen Sie jeder Probe 30 L des Post-Capture PCR Master Mix für ein endgültiges Reaktionsvolumen von 50 l hinzu. Mischen Sie gründlich, indem Sie 10 Mal nach oben und unten pipetieren.
- Legen Sie die PCR-Röhren in den thermischen Cycler und inkubieren Sie nach Programm #11 (Ergänzende Tabelle 2).
20. Reinigen Von PCR-Fragmenten nach der Erfassung
- Lassen Sie SPRI Beads vor Gebrauch mindestens 30 min auf Raumtemperatur erwärmen und wirbeln Sie dann SPRI-Perlen für ca. 30 s, um sie wieder aufzusetzen.
- Fügen Sie jeder PCR-angereicherten Erfassung 75 L resuspendierte Perlen hinzu (50 l). Mischen Sie gut, indem Sie mindestens 10 Mal nach oben und unten pfeifen. Die Streptavidinperlen stören die SPRI-Perlenreinigung nicht. 5 min bei Raumtemperatur inkubieren.
- Drehen Sie die Rohre kurz in einer Mikrozentrifuge und legen Sie die Rohre auf ein magnetisches Rack, um Perlen vom Überstand zu trennen. Nachdem die Lösung klar ist, entfernen und entsorgen Sie den Überstand sorgfältig. Achten Sie darauf, die Perlen, die DNA enthalten, nicht zu stören.
- Fügen Sie 180 l frisch zubereitetes 80% Ethanol in die Röhre, während in der magnetischen Rack. Bei Raumtemperatur für 30 s inkubieren und dann den Überstand vorsichtig entfernen und entsorgen.
- Wiederholen Sie Schritt 20.4 einmal für insgesamt 2 Waschschritte.
- Entfernen Sie das Restethanol vollständig. Lassen Sie das Rohr auf dem magnetischen Rack und Luft trocken 3 min mit dem Deckel offen, oder bis sichtbar trocken. Trocknen Sie die Perlen nicht übertrocknen. Dies kann zu einer geringeren Wiederherstellung der DNA führen.
- Entfernen Sie das Rohr vom Magneten. Elute die DNA aus den Perlen durch Zugabe von 22 l 0,1x TE Buffer. Mischen Sie gut, indem Sie mehrmals nach oben und unten. 2 min bei Raumtemperatur inkubieren. Legen Sie das Rohr auf das Magnetgestell, bis die Lösung klar ist.
- Entfernen Sie 20 L des Überstandes und übertragen Sie auf ein sauberes nukleasefreies PCR-Rohr, wobei Sie darauf achten, die Perlen nicht zu stören. Dies ist ein optionaler Stopppunkt im Protokoll, Bibliotheken können bei -20 °C gespeichert werden.
21. Bibliothek validieren und quantifizieren
- Messen Sie die Konzentration der erfassten Bibliothek mit einem Fluorometer und einem Assay Kit mit hoher Empfindlichkeit.
- Messen Sie die durchschnittliche Fragmentlänge der erfassten Bibliothek mit einem digitalen Elektrophorese-DNA-Chip mit hoher Empfindlichkeit und berechnen Sie die durchschnittliche Fragmentgröße für jede Bibliothek mithilfe der Systemsoftware. Die durchschnittliche Fragmentgröße sollte etwa 250-400 bp betragen (siehe Repräsentative Ergebnisse, Abbildung 6 und Abbildung 7). Dies ist ein optionaler Stopppunkt im Protokoll, abgeschlossene Bibliotheken können bei -20 °C gespeichert werden.
22. Sequenzierung auf einer Sequenzierungsplattform
- Für die Sequenzierung, verdünnen Bibliotheken auf 2 nM und folgen Sie den Richtlinien des Herstellers für das Laden und DenBetrieb des Sequenzers. Sequenzbibliotheken bis zu einer Mindesttiefe von 15 Millionen Einzel-End-Lesevorgängen von mindestens 50 bp Länge.
23. Analyse von Sequenzierungsdaten zur Generierung von Immunprofilen und Entdeckung von Biomarkern mit dem Prism Portal, einem Cloud-basierten Informatik-Tool
- Erstellen Sie ein Prism-Konto, indem Sie https://prism.cofactorgenomics.com/
- Nachdem Sie sich angemeldet haben, klicken Sie in der oberen Symbolleiste auf einer beliebigen Seite in Prism auf Neues Projekt senden, um die entmultiplexierten FASTQ-Sequenzierungsdateien hochzuladen oder Dateien hochzuladen, die auf BaseSpace mit dem Prism-Konto gespeichert sind.
- Füllen Sie das Formular Neues Projekt aus, einschließlich des Projektnamens und der Beispiele nach Gruppe oder Kohorte. Die Gruppierung von Stichproben und die entsprechenden Gruppierungsnamen sind erforderlich, um den Biomarker Discovery Report zu generieren. Beachten Sie, dass mindestens 3 Proben pro Gruppe erforderlich sind, um den Biomarker Discovery Report zu generieren. Klicken Sie auf die Schaltfläche Anwendung starten, um das Formular zu senden. Wenn dies erfolgreich ist, wird eine Bestätigungsseite angezeigt.
- Während der Anmeldung klicken Sie in der oberen Symbolleiste oder auf einer beliebigen Seite von Prism auf Ergebnisse anzeigen. Prism ermöglicht es einem Benutzer, den Status der eingereichten Projekte zu sehen und Beispiel- und Biomarkerberichte pro Projekt anzuzeigen. Es wird eine Tabelle mit Projekten geben, die der Benutzer auf Prism erstellt hat. Die Tabelle enthält drei Spalten für den Status, den Namen und das Datum der Übermittlung.
HINWEIS: Der Status jedes Projekts kann sein:
• "Laufen", wo die Projektanalyse gerade ausgeführt wird, oder
• "Erfolg", bei dem die Projektanalyse abgeschlossen ist und Berichte vorliegen. - Wenn die Analyse eines Projekts abgeschlossen ist (angezeigt durch den Status "Erfolg"), zeigen Sie die einzelnen Beispielberichte und einen Biomarker Discovery-Bericht an. Beachten Sie, dass der Biomarker Discovery-Bericht nur verfügbar ist, wenn das Projekt das erforderliche Minimum von drei Beispielen pro Gruppe enthält.
- Um auf diese Berichte zuzugreifen, kehren Sie zur Projekttabelle zurück und klicken Sie auf den Namen des Projekts. Auf dieser Projektseite wird eine Tabelle mit einer Zeile für jedes Beispiel im Projekt angezeigt. Klicken Sie auf den Link in jeder Zeile unter der Spalte Bericht, um auf den individuellen Bericht jedes Beispiels zuzugreifen. Klicken Sie direkt unter der Tabelle auf den Link für den Biomarker Discovery Report. Wenn sich auf dieser Seite keine Links befinden, wurde die Analyse des Projekts noch nicht abgeschlossen.
Representative Results
Es gibt eine Reihe von Prüfpunkten im gesamten Protokoll, die es einem Benutzer ermöglichen, die Qualität und Quantität der generierten Materialien zu bewerten. Nach Schritt 12, der im Protokoll beschrieben wird, wird ein Elektropherogramm erzeugt, wie in Abbildung 3dargestellt, das für eine typische Pre-Capture-Bibliothek für eine intakte RNA-Probe (RIN = 7.8) steht.
Abbildung 3: Typische Pre-Capture Library Bioanalyzer-Spur für eine intakte RNA-Probe. Pre-Capture-Bibliotheken erscheinen als breiter Spitzenwert von etwa 250-400 Basenpaaren (bp) in der Größe. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Es sollte darauf geachtet werden, eine Überverstärkung zu vermeiden, wie aus dem zweiten Peak um 1.000 bp in Abbildung 4,einem repräsentativen Elektropherogramm einer aus einer FFPE-RNA-Probe erzeugten FFPE-RNA-Probe (DV200 = 46), hervorgeht. Wenn dieser Peak im Verhältnis zum Hauptgipfel (etwa 250-400 Basenpaare (bp), wie gezeigt), klein ist, wird er nicht mit nachgelagerten Schritten oder Analysen stören. Wenn der zweite Peak im Verhältnis zum 250-400 bp-Peak groß ist, kann die Pre-Capture-Bibliothek mit weniger PCR-Zyklen neu hergestellt werden, um die Überverstärkung zu reduzieren.
Abbildung 4: Typische Pre-Capture Library Bioanalyzer-Ablaufverfolgung für eine FFPE-RNA-Probe. Der zweite Spitzenwert um 1.000 bp deutet auf eine Überverstärkung hin. Wenn dieser Peak im Verhältnis zum Hauptgipfel um 250-400 bp klein ist (wie gezeigt), wird er die nachgelagerten Schritte oder die Analyse nicht beeinträchtigen. Wenn der zweite Peak im Verhältnis zum 250-400 bp-Peak groß ist, kann die Pre-Capture-Bibliothek mit weniger PCR-Zyklen neu hergestellt werden, um eine Überverstärkung zu reduzieren. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Wie in Schritt 12.1.3 beschrieben, sollte das Vorhandensein von Adapterdimermen bewertet werden, um festzustellen, ob eine zusätzliche Bereinigung erforderlich ist. Die in Abbildung 5 dargestellten Elektropherogramme sind repräsentativ für inakzeptable (Abbildung 5A, DV200 = 33) und akzeptable(Abbildung 5B, DV200 = 46) Mengen des Adapter-Dimers, der als scharfer Spitzenwert um 128 bp erscheint.
Abbildung 5: Voraberfassungsbibliothek Bioanalyzer-Spuren. Der Adapter-Dimer zeigt sich als scharfer Peak um 128 bp. (A) Übermäßige Adapter-Dimere sind in diesem Elektropherogramm vorhanden. (B) In dieser Spur sind akzeptable Adapter-Dimer-Ebenen dargestellt. Beide Spuren zeigen Hinweise auf eine leichte Überverstärkung, aber dies sollte den ImmunoPrism-Assay nicht stören. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Nach Abschluss des Protokolls werden vor der Sequenzierung die endgültigen Bibliotheken erneut mittels digitaler Elektrophorese ausgewertet. Bibliotheken aus FFPE-RNA haben tendenziell eine geringere durchschnittliche Größenverteilung als Bibliotheken aus intakter RNA. Bei intakten RNA-Proben sollte die resultierende Spur bild 6 ähnlich aussehen (RIN = 9.5). Bei degradierter oder FFPE-RNA sollte die resultierende Spur abbildung 7 (DV200 = 36) ähnlich aussehen.
Abbildung 6: Typische Endbibliothek Bioanalyzer-Spur für eine intakte RNA-Probe. Endgültige Bibliotheken erscheinen als breiter Peak um 250-400 Basenpaare (bp) in der Größe. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 7: Typische Endbibliothek Bioanalyzer-Ablaufverfolgung für eine FFPE-RNA-Probe. Bibliotheken aus FFPE-RNA haben tendenziell eine geringere durchschnittliche Größenverteilung als Bibliotheken aus intakter RNA. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Wie beschrieben, können die mit diesem Protokoll generierten Ergebnisse auf zwei wichtige Arten angewendet werden, wie in Abbildung 8dargestellt.
Abbildung 8: Zwei Anwendungsfälle des Protokolls. Die Ergebnisse dieses Immunprofiling-Assays werden in zwei wichtigen Translationsanwendungen angewendet. (A) Der erste Anwendungsfall beginnt mit menschlichem, solidem Tumorgewebe (einschließlich FFPE-Archiven) und erzeugt ein individuelles Immunprofil für die Probe. (B) Einmal für eine Kohorte menschlicher Proben generiert, werden die Daten mit dem Prismportal kombiniert, um einen multidimensionalen Biomarker und den entsprechenden Biomarker-Bericht zu generieren. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Um jeden dieser Anwendungsfälle zu veranschaulichen, sind repräsentative Daten aus einer kleinen translationalen Studie enthalten21. Bei den in dieser Studie verwendeten Proben handelt es sich um eine Reihe von Proben von 7 Patienten, die bei nicht-kleinzelligem Lungenkrebs (NSCLC) diagnostiziert und behandelt wurden. Die Proben sind patientengerechtes, festes Tumorgewebe aus Biopsien vor und nach der Behandlung. Zunächst wurden einzelne Proben analysiert, um ein Immunprofil zu erzeugen, wie z. B. der in Abbildung 9dargestellte Beispielbericht .
Abbildung 9: Beispiel für einen individuellen Immunbericht für eine NSCLC-Probe. Die Prism Portal-Pipeline generiert für jede verarbeitete Probe einen grafischen Bericht, wobei ein repräsentativer Bericht für eine NSCLC-Volumentumorprobe generiert wird. (A) Die Vorderseite des Berichts zeigt grafisch den Abbau von Immunzellen in der aus dem FFPE-Gewebe extrahierten RNA-Probe. (B) Die Rückseite des Berichts enthält eine Tabelle der Immunzellen (in absoluten Prozentsätzen) und der Escape-Genexpression (in Transkriptionen pro Million oder TPM) sowie eine Leistungsaufstellung für den Test. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Die Immunprofile vor und nach der Behandlung können verwendet werden, um zu verstehen, wie eine Therapie (Chemotherapie oder Bestrahlung, in dieser Studie) die Tumormikroumgebung verändert hat. Ein Beispiel ist in Abbildung 10dargestellt, in dem die prozentualen Veränderungen für jede Immunzelle und der Gesamtimmungehalt vor und nach der Chemotherapie für einen einzelnen Patienten dargestellt werden.
Abbildung 10: Beispiel ergebnisse für die Vor- und Nachbehandlung. Gezeigt werden individuelle Immunzellen- und Gesamtimmuninhaltsdaten, die aus Proben vor und nach der Behandlung eines einzelnen NSCLC-Patienten generiert wurden. In diesem Beispiel erhielt der Patient eine Chemotherapie als Behandlung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Die Patienten können nach Kriterien wie klinischen Ergebnissen oder Phänotypen zum Vergleich gruppiert werden. In Abbildung 11wurden beispielsweise die Proben in der NSCLC-Studie nach der Zeit bis zur Krankheitsprogression nach der Behandlung verglichen. Eine Teilmenge der Patienten zeigte ein Wiederauftreten der Erkrankung in >18 Monaten, und eine andere Teilmenge schritt schneller voran, in 18 Monaten. Der mediane Deltawert (Differenz zwischen Vor- und Nachbehandlungswerten) wird für jede Probe verglichen, um vermeintliche Biomarker des Krankheitsverlaufs zu identifizieren.
Abbildung 11: Beispiel Für den Vergleich mit dem klinischen Ergebnis. Quantitative Veränderungen zwischen den Immunzellprozentsätzen in übereinstimmenden NSCLC-Proben vor und nach der Behandlung wurden berechnet und als "Delta"-Wert gemeldet. Die gelb markierten zeigen deutliche Signalwechsel zwischen dem Überlebensstatus. Blaue Balken stellen mediane Deltawerte für >18 Monate bis zum Fortschreiten der Erkrankung dar, orange Balken stellen mediane Deltawerte für 18 Monate bis zum Fortschreiten der Erkrankung dar. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Schließlich können ähnliche Stichprobengruppierungen verwendet werden, um probenspezifisch zu untersuchen, um prädiktive Biomarker zu identifizieren, indem sie das Prismportal verwenden, um einen Biomarker-Bericht zu erstellen. In Abbildung 12ist der gleiche klinische Phänotyp (Krankheitsprogression) wie oben beschrieben definiert die Stichprobengruppierungen. In diesem Beispiel wurden zwei Immun-Escape-Gene als statistisch signifikante Unterscheidungsmerkmale der Stichprobengruppierungen identifiziert (CD47 und OX40, dargestellt im unteren Bereich von Abbildung 12A). Da in diesem Beispiel die einzelnen Genbiomarker robust mit klarer statistischer Signifikanz sind, fügt der multidimensionale Biomarker keinen signifikanten Vorhersagewert hinzu (ImmunoPrism, wie im oberen rechten Balkendiagramm von Abbildung 12B). Die vollständige Tabelle der Daten, einschließlich der Ergebnisse für alle 18 Analyten für den Assay, ist auf der Rückseite des Berichts zusammengefasst, einschließlich statistischer Analysen und einer kurzen Zusammenfassung der Methoden.
Abbildung 12: Beispiel Biomarker-Bericht für NSCLC-Proben. Die Biomarker Discovery-Pipeline liefert einen visuellen Bericht über einzelne Biomarker und einen maschinell lernenden multidimensionalen Biomarker mit detaillierten Statistiken. (A) Für diese Studie identifizierte die Pipeline zwei einzelne Biomarker (CD47 und OX40) als statistisch signifikant für die Definition des Krankheitsverlaufs mit einem Schwellenwert von 18 Monaten. (B) Auf der Rückseite des Berichts sind Einzelheiten zur Methode und zu den vollständigen Ergebnissen enthalten. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Zusatztabelle 1: Reagenz-Kit-Materialien. Eine Liste der im ImmunoPrism Kit bereitgestellten Materialien wird zusammen mit den Teilenummern aufgeführt, auf die im Herstellerprotokoll verwiesen wird. Alle anderen erforderlichen Ausrüstungen und Materialien sind in der Materialtabelle aufgeführt. Besuchen Sie https://cofactorgenomics.com/product/immunoprism-kit/ für Sicherheitsdatenblätter (SDS). Bitte klicken Sie hier, um diese Datei anzuzeigen (Rechtsklick zum Herunterladen).
Ergänzende Tabelle 2: Thermische Cycler-Programme. Die empfohlenen Cycler-Programme, auf die im gesamten Protokoll verwiesen wird, werden zur Vereinfachung der Programmierung zusammengefasst. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei anzuzeigen (Rechtsklick zum Herunterladen).
Ergänzende Tabelle 3: Sequencing Index Guide. Die im Reagenz-Kit enthaltenen Indexprimer sind aufgeführt; Jeder Reaktion für die Entmultiplexing nach der Sequenzierung wird eine einzigartige Grundierung hinzugefügt. Empfohlene Low-Level-Multiplex-Kombinationen sind ebenfalls vorhanden. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei anzuzeigen (Rechtsklick zum Herunterladen).
Discussion
Das Protokoll benötigt 20 ng intakte oder 40 ng stark abgebaute (FFPE) RNA. Die RNA-Probe sollte frei von DNA, Salzen (z. B. Mg2+oder Guanidiniumsalzen), divalenten Kationenchelisierungsmitteln (z. B. EDTA, EGTA, Citrat) oder organischen Stoffen (z. B. Phenol und Ethanol) sein. Es wird nicht empfohlen, mit RNA-Proben fortzufahren, die eine DV200 <20% haben. Die Verwendung der In-Kit-Kontroll-RNA wird dringend empfohlen, da diese Kontrollen eine Möglichkeit bieten, die Leistung im gesamten Protokoll zu bewerten, von der Bibliotheksvorbereitung bis zur Analyse.
Das Protokoll ist für die Verwendung von 0,2 ml PCR-Streifenrohren ausgelegt. Falls gewünscht, kann das Protokoll auch mit den Brunnen in einer 96-Well-PCR-Platte durchgeführt werden. Verwenden Sie einfach die Bohrungen einer 96-Well-PCR-Platte anstelle aller Verweise auf PCR-Röhren oder Bandröhren. Verwenden Sie PCR-Platten nur mit klaren Brunnen, da es wichtig ist, die vollständige Resuspension von Perlen während der Perlenreinigung und Waschschritte visuell zu bestätigen.
Während des gesamten Protokolls reagenzien gefroren oder auf Eis aufbewahren, sofern nicht anders angegeben. Verwenden Sie Reagenzien erst, wenn sie vollständig aufgetaut sind. Achten Sie darauf, alle Reagenzien vor der Verwendung gründlich zu mischen.
Die Enzyme bei -20 °C aufbewahren, bis sie einsatzbereit sind, und nach Gebrauch sofort auf -20 °C zurückkehren. Verwenden Sie nur molekulartaugliches Nuklease-freies Wasser; es wird nicht empfohlen, DEPC-behandeltes Wasser zu verwenden. Beim Pipetieren zum Mischen, vorsichtig ansaugen und mindestens 50% des Gesamtvolumens abgeben, bis die Lösungen gut vermischt sind. Pipette mischen alle Master-Mischungen, die Enzyme enthalten. Die Verwendung von Wirbel zum Mischen der Enzyme könnte zu Einer Denaturierung führen und ihre Leistung beeinträchtigen. Verwenden Sie bei der Perlenreinigung frisch hergestellte 80% Ethanollösungen aus molekularem Ethanol. Die Verwendung von Ethanollösungen, die nicht frisch sind, kann zu geringeren Erträgen führen. Vermeiden Sie das Übertrocknen der Perlen, da dies die Elutionseffizienz reduzieren kann (Perlen sehen geknackt aus, wenn sie übergetrocknet sind).
Wie in Schritt 10 beschrieben, werden jeder Reaktion eindeutige Indexprimer hinzugefügt. Basierend auf den Sequenzen dieser Indizes sind für Low-Level-Multiplexing bestimmte Indexkombinationen optimal. Die Sequenzen dieser Indizes sind für die Entmultiplexung der Daten nach der Sequenzierung erforderlich. Die Sequenzen und empfohlenen Multiplex-Kombinationen sind in Der Ergänzenden Tabelle 3aufgeführt. In diesem Schritt ist es wichtig zu beachten, dass die Anzahl der empfohlenen PCR-Zyklen je nach qualität der verwendeten RNA variiert, und, einige Optimierung kann erforderlich sein, um PCR-Überverstärkung zu verhindern. Für die ImmunoPrism Intact Control RNA und andere hochwertige RNA starten Sie die Optimierung mit 10 PCR-Zyklen. Für die ImmunoPrism FFPE Control RNA und andere stark degradierte/FFPE RNA starten Sie die Optimierung mit 15 PCR-Zyklen. Es wird empfohlen, eine Testbibliothek mit RNA zu erstellen, die für das zu analysierende Material repräsentativ ist, um die PCR-Zyklen zu optimieren. Es sollte die minimale Anzahl von PCR-Zyklen verwendet werden, die konsistent ausreichende Ausbeuten von Bibliotheksergebnissen vor der Erfassung (>200 ng) liefern. Ein sekundärer Spitzenwert um 1000 bp auf der Bioanalyzer-Spur deutet auf eine Überverstärkung hin (Abbildung 4). Die Überverstärkung sollte minimiert werden, aber das Vorhandensein einer kleinen sekundären Spitze wird die Testergebnisse nicht beeinträchtigen.
Um den Probenverlust zu minimieren und Schaltrohre zu vermeiden, kann Schritt 13 in PCR-Röhren, Streifenrohren oder einer 96-Well-PCR-Platte anstelle von 1,5 ml Mikroröhren durchgeführt werden, wenn Ihr Vakuumkonzentrator dies zulässt. Der Rotor kann auf vielen Konzentratoren entfernt werden. Dadurch können die Bandrohre oder Platten in das Vakuum passen. Die Vakuumkonzentration kann dann ohne Zentrifugation mit der wässrigen Trocknungseinstellung ausgeführt werden. Anweisungen finden Sie im Handbuch ihres Vakuumkonzentrators. Werden die Proben in Bandröhren oder einer 96-Well-Platte getrocknet, kann der Hybridisierungsschritt im selben Gefäß durchgeführt werden.
Achten Sie in Schritt 17 darauf, alle 10-12 min zu wirbeln, um die Effizienz der Perlenerfassung zu erhöhen. Halten Sie die Kappen der warmen Bandrohre beim Mischen vorsichtig fest, um zu verhindern, dass sich Die Rohre öffnen.
Die in Schritt 18 beschriebenen Wähdaten sind entscheidend, um eine hohe unspezifische Kontamination zu vermeiden, und müssen genau beobachtet werden. Achten Sie darauf, die Perlen bei jeder Wäsche vollständig wieder aufzuhängen, die Waschpuffer vollständig zu entfernen und während des Waschpuffers 2 die Proben in ein frisches Streifenrohr zu geben (Schritt 18.6.5). Stellen Sie sicher, dass die Streptavidin-Perlen vollständig resuspendiert sind und während der gesamten Inkubation in Suspension bleiben. Das Spritzen auf den Rohrkappen wirkt sich nicht negativ auf die Erfassung aus. Während der Raumtemperaturwähungen kann ein Mikroplattenwirbelmischer verwendet werden, um die Proben während der gesamten zweiminütigen Inkubationszeit für eine einfachere Resuspension zu wirbeln. Lassen Sie die Streptavidin-Perlen nicht austrocknen. Bei Bedarf in den Puffern Brutmittel ausdehnen, um das Trocknen der Perlen zu vermeiden. Wenn Sie mehr als ein Streifenrohr verwenden, arbeiten Sie für jede Wäsche mit einem Streifenrohr nach dem anderen, während die anderen Streifenrohre im Thermocycler sitzen. Dies kann dazu beitragen, über das Trocknen der Perlen oder Rauschen zu vermeiden, was zu einer schlechten Resuspension oder anderen suboptimalen Techniken führt. Für Erstbenutzer wird nicht empfohlen, mehr als 8 Bibliotheksreaktionen gleichzeitig zu verarbeiten.
Aktuelle Immunprofilierungstechniken liefern ein Kontinuum an Informationen - von Tausenden von Datenpunkten, die eine signifikante Interpretation (RNA-Sequenzierung) erfordern, bis hin zu einem individuellen, diskreten Datenpunkt (Single-Plex IHC). Das hier beschriebene Protokoll stellt einen Ansatz dar, der sich irgendwo in der Mitte befindet, mit einem fokussierten Bereich, der eine hohe Empfindlichkeit ermöglicht, aber nur eine Teilmenge klinisch relevanter transkriptomischer Daten erfasst. Aufgrund der Art der Massen-RNA-Extraktion liefert dieses Protokoll keine Informationen über die räumlichen Beziehungen zwischen Immunzellen und der Tumormikroumgebung, jedoch können die Ergebnisse durch bildgebende Technologien ergänzt werden, um diese Informationen hinzuzufügen. Es gibt eine Vielzahl von Anwendungen für die durch dieses Protokoll generierten Daten, da es viel über die Biologie von Krebs als Krankheit und die Therapien, die entwickelt werden, um es zu behandeln, zu lernen gibt. Wie aus den repräsentativen Ergebnissen hervorgeht, ist der individuelle Immunbericht nützlich, um zu verstehen, wie sich das Immunprofil eines Patienten als Reaktion auf Ereignisse wie das Fortschreiten der Erkrankung oder die Behandlung ändern kann. Während die hier vorgestellten Ergebnisse einige Beispielanwendungsfälle liefern, sind andere Anwendungen, einschließlich der Untersuchung des Wirkmechanismus einer Therapie und der Identifizierung von vermeintlichen Biomarkern klinischer Ergebnisse wie progressionsfrei und Gesamtüberleben, ebenfalls praktisch. Bei der Verwendung dieses Protokolls für Biomarker-Erkennungsanwendungen ist es wichtig, ein gutes Studiendesign zu praktizieren, um sicherzustellen, dass homogene Populationen analysiert werden, ausreichende Proben für die statistische Leistung enthalten sind und Verzerrungsquellen berücksichtigt werden. Aufgrund der fokussierten, schlanken Natur des Assays ist es möglich, sich einen Weg zur klinischen Validierung und nachgelagerten Anwendung dieser Biomarker vorzustellen, sobald sie entdeckt wurden.
Disclosures
Alle Autoren sind bei Cofactor Genomics, Inc. beschäftigt, dem Unternehmen, das das ImmunPrism Reagenzkit und die in diesem Artikel verwendeten Informatik-Tools entwickelt und produziert. Der ImmunoPrism Assay ist nur für Die Forschung und ist nicht für den Einsatz in diagnostischen Verfahren.
Acknowledgments
Die Autoren möchten die TriStar Technology Group für die Bereitstellung der biologischen Proben für die repräsentativen Ergebnisse sowie die gesamten molekularen, Analyse-, Produkt- und Handelsteams von Cofactor Genomics für ihr technisches Know-how und ihre Unterstützung.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2 mL PCR 8 tube strip | USA Scientific | 1402-2700 | USA Scientific 0.2 mL PCR 8-tube strip |
| 200 Proof Ethanol | MilliporeSigma | EX0276-1 | Prepare 80% by mixing with nuclease-free water on the day of the experiment |
| 96-well thermal cyclers | BioRad | 1861096 | |
| Solid-phase Reversible Immobilization (SPRI) Beads | Beckman-Coulter | A63882 | Agencourt AMPure XP – PCR Purification beads |
| Digital electrophoresis chips and kit | Agilent Technologies | 5067-4626 | Agilent High Sensitivity DNA chips and kit |
| Digital electrophoresis system | Agilent Technologies | G2939AA | Agilent 2100 Electrophoresis Bioanalyzer |
| Streptavidin Beads | ThermoFisher Scientific | 65306 | Dynabeads M-270 Streptavidin |
| ImmunoPrism Kit – 24 reaction | Cofactor Genomics | CFGK-302 | Cofactor ImmunoPrism Immune Profiling Kit – 24 reactions |
| Human Cot-1 DNA | ThermoFisher Scientific | 15279011 | Invitrogen brand |
| Magnetic separation rack | Alpaqua/Invitrogen | A001322/12331D | 96-well Magnetic Ring Stand |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 22620701 | |
| Microcentrifuge tubes | USA Scientific | 1415-2600 | USA Scientific 1.5 mL low-adhesion microcentrifuge tube |
| NextSeq550 | Illumina | SY-415-1002 | Any Illumina sequencer may be used for this protocol |
| Nuclease-free water | ThermoFisher Scientific | AM9937 | |
| Prism Extraction Kit | Cofactor Genomics | CFGK-401 | Cofactor Prism FFPE Extraction Kit – 24 samples |
| Purified RNA | - | - | Purified from human tissue samples |
| Fluorometer | ThermoFisher Scientific | Q33226 | Qubit 4 System |
| Fluorometric Assay Tubes | Axygen | PCR-05-C | 0.5mL Thin Wall PCR Tubes with Flat Caps |
| High Sensitivity Fluorometric Reagent Kit | Life Technologies | Q32854 | Qubit dsDNA HS Assay Kit |
| Vacuum concentrator | Eppendorf | 22820001 | VacufugePlus |
| Vortex mixer | VWR | 10153-838 | |
| Water bath or heating block | VWR/USA Scientific | NA/2510-1102 | VWR water bath/USA Scientific heating block |
References
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