Användningen av en RNA-baserad metod för att bestämma kvantitativa immunprofiler av solida tumörvävnader och utnyttja kliniska kohorter för immunonkologi biomarkör upptäckt beskrivs genom en molekylär och informatik protokoll.
Immunterapier visar löfte vid behandling av onkologipatienter, men komplexa heterogenitet av tumörmikromiljön gör förutsäga behandlingssvar utmanande. Förmågan att lösa de relativa populationerna av immunceller som finns i och runt tumörvävnaden har visat sig vara kliniskt relevant för att förstå svar, men begränsas av traditionella tekniker som flödecytometri och immunohistokemi ( IHC), på grund av den stora mängd vävnad som krävs, brist på exakta markörer celltyp, och många tekniska och logistiska hinder. En analys (t.ex. immunoprism immunprofileringassay) övervinner dessa utmaningar genom att ta emot båda små mängder RNA och mycket försämrade RNA, vanliga funktioner i RNA som utvinns ur kliniskt arkiverad fast tumörvävnad. Analysen nås via en reagenskit och molnbaserade informatik som ger en kvantitativ, hög genomströmning immunprofileringslösning för Illumina sekvenseringsplattformar. Forskare börjar med så få som två delar av formalin-fast paraffin-inbäddade (FFPE) vävnad eller 20-40 ng av totala RNA (beroende på provkvalitet), och protokollet genererar en immun profil rapport kvantifiera åtta immuncelltyper och tio immun fly gener, fånga en fullständig bild av tumör mikromiljön. Ingen ytterligare bioinformatisk analys krävs för att använda sig av de resulterande uppgifterna. Med lämpliga provkohorter kan protokollet också användas för att identifiera statistiskt signifikanta biomarkörer inom en patientpopulation av intresse.
Kvantifiering av tumörinfiltreralymfocyter (TILs) och andra immunrelaterade molekyler i formalin-fasta och paraffin inbäddade (FFPE) fast tumör mänskliga vävnadprover har visat värde i klinisk forskning1,2,3. Vanliga tekniker som flödecytometri och single-cell ribonucleic syra (RNA) sekvensering är användbara för färsk vävnad och blod4, men är olämpliga för analys av FFPE material på grund av oförmåga att skapa livskraftiga cellsuspensioner. Nuvarande metoder som har använts för att kvantifiera dessa celler i FFPE vävnad lider av stora utmaningar. Immunohistochemistry (IHC) och andra liknande bildframställning arbetsflöden kräver specifika antikroppar för att upptäcka cell-ytan proteiner, vilket kan vara svårt att standardisera mellan laboratorier för att möjliggöra reproducerbara kvantifiering5. Plattformar som nCounter-systemet förlitar sig på uttrycket av enskilda gener för att definiera viktiga immunceller6, vilket begränsar känsligheten och specificiteten hos detektion. Mer generiska RNA sekvensering metoder, tillsammans med fristående mjukvaruverktyg, finns tillgängliga men kräver betydande optimering och validering före användning7,8,9,10,11,12. Senaste framstegen i att kombinera laser capture microdissection (LCM) med RNA sekvensering för FFPE vävnad har visat löfte; En mer hög genomströmning krävs dock nyckelfärdiga lösningar för translationella studier som syftar till att identifiera robusta biomarkörer13,14. Metoder för att generera flerdimensionella biomarkörer, såsom Prediktiv immunmodellering, som definierar patientkohorter inklusive terapi responders, cancer subtyper, eller överlevnad resultat med hög prediktiv noggrannhet och statistisk signifikans blir allt viktigare i en ålder av precision medicin och immunterapi15,16.
För att ta itu med detta behov utvecklades en immunprofileringanalys för att möjliggöra känslig och specifik kvantifiering av immunceller i solid tumör FFPE-vävnad med hjälp av standardiserade RNA-sekvenseringreagenser och molnbaserade informatik. Förutom att ta emot försämrade RNA från FFPE-vävnad kan protokollet rymma RNA från att begränsa vävnadsprover som kärnnålbiopsier, nålaspirater och mikro- eller makrodissekerad vävnad. RNA-data från varje prov jämförs med en databas med genuttrycksmodeller av immunceller, som kallas immunsystemets hälsouttrycksmodeller, för att kvantifiera immunceller i procent av de totala cellerna som finns i provet. Kort, dessa modeller byggdes med hjälp av maskininlärningsmetoder för att identifiera unika multigena uttrycksmönster från heltranskriptomdata som genereras från renade immuncellpopulationer (isolerade med kanoniska cell-yta markörer)17,18. De flerdimensionella hälsouttrycksmodeller som ligger till grund för tekniken gör det möjligt för analysen att kvantifiera varje immuncell som en procent av de totala celler som finns i den heterogena blandningen. Detta gör det möjligt för forskaren att generera jämförelser mellan och inom urvalet immunceller, som har visat sig ha kliniskt värde19,20. Andra tillämpningar är kvantifiering av immunsvar före och efter behandling, enligt beskrivningen i de representativa resultaten. Analysen rapporterar om flera funktioner i immuncontexture av tumör och tumör mikromiljö inklusive de absoluta procentsatserna av åtta immuncelltyper (härledda från genuttryckmodeller): CD4+ T-celler, CD8+ T-celler, CD56+ Natural Killer celler, CD19+ B-celler, CD14+ monocyter, Tregs, M1 makrofager och M2 makrofager. Dessutom rapporterar analysen uttrycket (i transkriptioner per miljon, eller TPM) av tio immunflyktgener: PD-1, PD-L1, CTLA4, OX40, TIM-3, BTLA, ICOS, CD47, IDO1 och ARG1.
Reagenssatsen används för att göra bibliotek av hög kvalitet redo för sekvensering på en Illumina-plattform efter en hybridinsamlingsbaserad biblioteksberedningsmetod, som visas i figur 1. Om en forskare inte har en Illumina sekvenseringsplattform i sitt laboratorium, får de lämna in sina prover till ett kärnlaboratorium för sekvensering. När sekvenseringsdata har genererats laddas upp till Prismportalen för automatiserad analys och en omfattande kvantitativ profil för varje enskilt prov returneras till användaren i form av immunrapporten (figur 2A. Användare kan också definiera provgrupperier i Prismportalen för att generera en Biomarker-rapport (figur 2B), som belyser statistiskt signifikanta biomarkörer som skiljer två patientkohorter. Viktigt är att de data som genereras av reagenssatsen endast är avsedda för forskningsanvändning och får inte användas för diagnostiska ändamål.
Bild 1: Översikt över arbetsflödet. I detta protokoll konverteras RNA först till cDNA. Sekvensering sadaptrar är ligated, och adapter-ligated cDNA förstärks och streckkodas av PCR för att skapa en pre-capture bibliotek. Biotinylated sonder hybridiseras sedan till specifika cDNA mål som sedan fångas med streptavidin pärlor. Obundet, icke-riktat cDNA avlägsnas genom tvätt. En slutlig PCR-anrikning ger ett bibliotek efter inspelning redo för sekvensering. *Totalt RNA måste komma från mänskliga prover. kan vara intakt eller försämrad (FFPE) RNA. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Representant Immun rapporter. Arbetsflödet genererar två rapporter, en individuell immunrapport (A)för varje bearbetade prov och en biomarkörrapport(B)för definierade patientkohorter. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Protokollet kräver cirka 16 h förberedelsetid (från totalt RNA till bibliotek redo för sekvensering); Det finns dock ett antal valfria stopppunkter, som anges i protokollet. Analysen använder sig av den rika, dynamiska karaktären av transkriptomics att gå bortom äldre single-analyte biomarkörer till flerdimensionella genuttryck modeller, vilket möjliggör omfattande biologisk karakterisering av vävnadsprover med standardiserade reagenser och lättanvända programvaruverktyg. Det ger forskare möjlighet att använda en modern teknik i sitt eget laboratorium, genom att utnyttja maskininlärning och en databas med hälsouttrycksmodeller för att härleda mer exakta, kvantitativa immunprofiler av värdefulla kliniska prover och upptäcka flerdimensionella RNA biomarkörer med fullständig statistisk analys.
Protokollet kräver 20 ng intakt eller 40 ng mycket försämrad (FFPE) RNA. RNA-provet bör vara fritt från DNA, salter(t.ex. Det rekommenderas inte att fortsätta med RNA-prover som har ett DV200 <20%. Användning av in-kit kontroll RNA rekommenderas starkt eftersom dessa kontroller ger ett sätt att utvärdera prestanda i hela protokollet, från bibliotek förberedelse till analys.
Protokollet är utformat för att utföras med 0,2 ml PCR-bandrör. Om det är möjligt kan protokollet också utföras med hjälp av brunnarna i en 96-brunnPCR-platta. Använd helt enkelt brunnarna på en 96-brunnPCR-platta i stället för alla hänvisningar till PCR-rör eller bandrör. Använd PCR-plattor med tydliga brunnar bara, eftersom det är viktigt att visuellt bekräfta fullständig återsuspension av pärlor under pärpreningar och tvättsteg.
I hela protokollet, hålla reagenser frysta eller på is om inte annat anges. Använd inte reagenser förrän de är helt tinade. Var noga med att noggrant blanda alla reagenser före användning.
Håll enzym vid -20 °C tills de är färdiga att använda och återgå till -20 °C snabbt efter användning. Använd endast molekylärt nucleasefritt vatten; Det rekommenderas inte att använda DEPC-behandlat vatten. När pipettering för att blanda, försiktigt aspirera och avstå minst 50% av den totala volymen tills lösningarna är väl blandade. Pipett blanda alla master blandningar som innehåller enzymer. Använda virvel för att blanda enzymer kan leda till denaturering och äventyra deras prestanda. Under beadreningar, använd nygjorda 80% etanol lösningar från molekylär kvalitet etanol. Användning av etanollösningar som inte är färska kan resultera i lägre avkastning. Undvik över torkning av pärlorna, eftersom detta kan minska elution effektivitet (pärlor ser spruckna om över torkade).
Som beskrivs i steg 10 läggs unika indexprimers till varje reaktion. Baserat på sekvenserna i dessa index, för multiplikator på låg nivå, är vissa indexkombinationer optimala. Sekvenserna av dessa index krävs för att demultiplexing data efter sekvensering. Sekvenserna och rekommenderade multiplexningskombinationer finns i kompletterande tabell 3. I samma steg är det viktigt att notera att antalet rekommenderade PCR-cykler varierar beroende på kvaliteten på RNA som används, och, viss optimering kan krävas för att förhindra PCR överförstärkning. För ImmunoPrism Intact Control RNA och andra högkvalitativa RNA, starta optimering med 10 PCR cykler. För ImmunoPrism FFPE Control RNA och andra mycket försämrade/FFPE RNA, starta optimering med 15 PCR cykler. Att producera ett testbibliotek med RNA-representant för det material som ska analyseras för att optimera PCR-cykler rekommenderas. Det minsta antalet PCR-cykler som konsekvent ger tillräckligt förinsamling bibliotek avkastning (> 200 ng) bör användas. En sekundär topp runt 1000 bp på Bioanalyzer spår är ett tecken på över-förstärkning(figur 4). Överförstärkning bör minimeras, men närvaron av en liten sekundär topp kommer inte att störa analysen resultat.
För att minimera provförlust och undvika att byta rör kan steg 13 utföras i PCR-rör, bandrör eller en 96-brunnpcrplatta i stället för 1,5 ml mikrorör, om din vakuumkoncentrator tillåter. Rotorn kan tas bort på många koncentratorer. Detta gör det möjligt för bandrören eller plattorna att passa in i vakuumet. Vakuumkoncentrationen kan sedan köras med hjälp av vattenförinnans uttorkningsinställning utan centrifugering. Se handboken för din vakuumkoncentrator för instruktioner. Om proverna torkas ner i bandrör eller en 96-brunnsplatta kan hybridiseringssteget utföras i samma kärl.
Under steg 17, se till att virvla var 10-12 min för att öka pärp fånga effektivitet. Håll försiktigt locken på de varma bandrören vid blandning för att förhindra att rören öppnas.
De tvättar som beskrivs i steg 18 är avgörande för att undvika hög ospecifik kontaminering och måste följas noga. Var noga med att helt avbryta pärlorna vid varje tvätt, helt ta bort tvättbuffertarna och under wash buffer 2-tvätten överför du proverna till ett nytt bandrör (steg 18.6.5). Se till att streptavidinpärlorna är helt återsuspenderade och förblir i suspension under hela inkubationstiden. Stänk på rörlocken kommer inte att påverka fångsten negativt. Under rumstemperaturtvättar kan en microplate virvelmixer användas för att virvla proverna under hela den två minuter långa inkubationstiden för enklare återsuspension. Låt inte streptavidinpärlorna torka ut. Om det behövs, utöka inkubationsi buffertarna för att undvika torkning av pärlorna. Om du använder mer än ett bandrör, arbeta med ett bandrör i taget för varje tvätt medan de andra bandrören sitter i termocycler. Detta kan bidra till att undvika över torkning av pärlor eller rusar, vilket resulterar i dålig resuspension eller andra suboptimala tekniker. För första gången rekommenderas det inte att bearbeta mer än 8 biblioteksreaktioner åt gången.
Nuvarande immunprofileringstekniker ger ett kontinuum av information – från tusentals datapunkter som kräver betydande tolkning (RNA-sekvensering) till en individuell, diskret datapunkt (single-plex IHC). Protokollet som beskrivs här representerar en metod som är någonstans i mitten, med ett fokuserat utrymme som möjliggör hög känslighet, men fånga endast en delmängd av kliniskt relevanta transkriptomiska data. På grund av arten av bulk RNA utvinning, detta protokoll ger inte information om de rumsliga relationerna mellan immunceller och tumör mikromiljön, men resultaten kan kompletteras med bildteknik för att lägga till denna information. Det finns en myriad av tillämpningar för de data som genereras av detta protokoll, eftersom det finns mycket att lära om biologi av cancer som en sjukdom, och terapier utvecklas för att behandla det. Som visas i representativa resultat, den individuella immunrapporten är användbar för att förstå hur en patients immunprofil kan förändras som svar på händelser som sjukdomsprogression eller behandling. Även om resultaten som presenteras här ger några exempel användningfall, andra tillämpningar inklusive undersöka verkningsmekanismen för en terapi och identifiera förmodade biomarkörer av kliniska resultat såsom progression slös och total överlevnad är också Praktiska. När du använder detta protokoll för biomarkör upptäckt applikationer, Är det viktigt att öva god studie design för att säkerställa homogena populationer analyseras, tillräckliga prover ingår för statistisk makt, och källor till partiskhet beaktas. På grund av analysens fokuserade, strömlinjeformade natur är det möjligt att föreställa sig en väg mot klinisk validering och nedströms applicering av dessa biomarkörer en gång upptäckt.
The authors have nothing to disclose.
Författarna vill erkänna TriStar Technology Group för att tillhandahålla biologiska exemplar för representativa resultat, liksom hela molekylära, analys, produkt och kommersiella team på Cofactor Genomics för sin tekniska expertis och Stöd.
0.2 mL PCR 8 tube strip | USA Scientific | 1402-2700 | USA Scientific 0.2 mL PCR 8-tube strip |
200 Proof Ethanol | MilliporeSigma | EX0276-1 | Prepare 80% by mixing with nuclease-free water on the day of the experiment |
96-well thermal cyclers | BioRad | 1861096 | |
Solid-phase Reversible Immobilization (SPRI) Beads | Beckman-Coulter | A63882 | Agencourt AMPure XP – PCR Purification beads |
Digital electrophoresis chips and kit | Agilent Technologies | 5067-4626 | Agilent High Sensitivity DNA chips and kit |
Digital electrophoresis system | Agilent Technologies | G2939AA | Agilent 2100 Electrophoresis Bioanalyzer |
Streptavidin Beads | ThermoFisher Scientific | 65306 | Dynabeads M-270 Streptavidin |
ImmunoPrism Kit – 24 reaction | Cofactor Genomics | CFGK-302 | Cofactor ImmunoPrism Immune Profiling Kit – 24 reactions |
Human Cot-1 DNA | ThermoFisher Scientific | 15279011 | Invitrogen brand |
Magnetic separation rack | Alpaqua/Invitrogen | A001322/12331D | 96-well Magnetic Ring Stand |
Microcentrifuge | Eppendorf | 22620701 | |
Microcentrifuge tubes | USA Scientific | 1415-2600 | USA Scientific 1.5 mL low-adhesion microcentrifuge tube |
NextSeq550 | Illumina | SY-415-1002 | Any Illumina sequencer may be used for this protocol |
Nuclease-free water | ThermoFisher Scientific | AM9937 | |
Prism Extraction Kit | Cofactor Genomics | CFGK-401 | Cofactor Prism FFPE Extraction Kit – 24 samples |
Purified RNA | – | – | Purified from human tissue samples |
Fluorometer | ThermoFisher Scientific | Q33226 | Qubit 4 System |
Fluorometric Assay Tubes | Axygen | PCR-05-C | 0.5mL Thin Wall PCR Tubes with Flat Caps |
High Sensitivity Fluorometric Reagent Kit | Life Technologies | Q32854 | Qubit dsDNA HS Assay Kit |
Vacuum concentrator | Eppendorf | 22820001 | VacufugePlus |
Vortex mixer | VWR | 10153-838 | |
Water bath or heating block | VWR/USA Scientific | NA/2510-1102 | VWR water bath/USA Scientific heating block |