Summary
Un protocole pour l'induction de l'éryptose, la mort cellulaire programmée dans les érythrocytes, utilisant l'ionophore de calcium, l'ionomycine, est fourni. L'éryptose réussie est évaluée en surveillant la phosphatidylserine de localisation dans le foliole externe de membrane. Les facteurs qui influent sur le succès du protocole ont été examinés et des conditions optimales ont été fournies.
Abstract
L'éryptose, érythrocyte programmé la mort cellulaire, se produit dans un certain nombre de maladies hématologiques et pendant les dommages aux érythrocytes. Une caractéristique des cellules éryptotiques est la perte de l'asymétrie compositionnelle de la membrane cellulaire, conduisant à la translocation de la phosphatidylserine à la foliole externe de membrane. Ce processus est déclenché par une concentration intracellulaire accrue de Ca2,qui active la scramblase, une enzyme qui facilite le mouvement bidirectionnel des phospholipides entre les folioles membranaires. Compte tenu de l'importance de l'éryptose dans diverses conditions malades, il ya eu des efforts pour induire l'éryptose in vitro. Ces efforts ont généralement compté sur l'ionophore de calcium, l'ionomycine, pour augmenter la concentration intracellulaire de Ca2 et induire l'éryptosis. Cependant, beaucoup d'écarts ont été rapportés dans la littérature concernant la procédure pour induire l'éryptosis utilisant l'ionomycine. Ici, nous rapportons un protocole étape par étape pour l'éryptosis induit par l'ionomycine dans les érythrocytes humains. Nous nous concentrons sur les étapes importantes dans la procédure, y compris la concentration d'ionophore, le temps d'incubation, et l'épuisement de glucose, et fournissons le résultat représentatif. Ce protocole peut être utilisé pour induire une éryptose reproductible en laboratoire.
Introduction
La mort cellulaire programmée dans les érythrocytes, également connu sous le nom d'éryptosis, est commune dans beaucoup d'conditions cliniques et de désordres hématologiques. L'éryptose est associée au rétrécissement cellulaire et à la perte d'asymétrie phospholipide dans la membrane plasmatique cellulaire1,2. La perte d'asymétrie entraîne la translocation de la phosphatidylserine (PS), un lipide normalement localisé dans le dépliant intérieur3,4, à la foliole externe de la cellule, qui signale aux macrophages de phagocytose et d'enlever les érythrocytes défectueux5,6,7,8. À la fin de la durée de vie normale des érythrocytes, l'ablation des cellules éryptotiques par macrophages assure l'équilibre des érythrocytes en circulation. Cependant, dans les conditions malades, telles que la drépanocytose et la thalassémie9,10,11, éryptose améliorée peut entraîner une anémie sévère2. En raison de son importance dans les maladies hématologiques, il y a un intérêt significatif dans l'examen des facteurs induisant ou inhibant l'éryptosis et les mécanismes moléculaires sous-jacents à ce processus.
La membrane plasmatique des érythrocytes sains est asymétrique, avec différents phospholipides localisés aux folioles extérieures et intérieures. L'asymétrie membranaire est principalement régulée par l'action des enzymes membranaires. La translocase aminophospholipide facilite le transport des aminophospholipides, ps et phosphatidylethanolamine (PE), en dirigeant ces lipides vers le foliole interne de la cellule. D'autre part, le floppase transporte la choline contenant des phospholipides, de la phosphatidylcholine (PC) et de la sphingomyéline (SM), de l'intérieur à la foliole externe de la membrane cellulaire12. Cependant, contrairement aux cellules saines, la membrane des érythrocytes éryptotiques est brouillée. Cela est dû à l'action d'une troisième enzyme, scramblase, qui perturbe l'asymétrie phospholipide en facilitant le transport bidirectionnel des aminophospholipides13,14,15,16. Scramblase est activé par des niveaux intracellulaires élevés de Ca2. Par conséquent, les ionophores de calcium, qui facilitent le transport de Ca2 à travers la membrane cellulaire12,sont des inducteurs efficaces de l'éryptose.
Ionomycin, un ionophore de calcium, a été largement utilisé pour induire l'éryptose dans les érythrocytes12,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26. Ionomycin a à la fois des groupes hydrophiles et hydrophobes, qui sont nécessaires pour lier et capturer Ca2 ion, et le transporter à l'espace cytosolique27,28,29. Cela conduit à l'activation de la broussase et la translocation de PS à la foliole externe, qui peut être facilement détectée à l'aide de l'annexine-V, une protéine cellulaire avec une forte affinité à PS12. Bien que l'éryptose de déclenchement par ionomycine soit généralement rapportée, il y a l'écart considérable de méthode dans la littérature (tableau 1). La population d'érythrocytes subissant l'éryptosis dépend de différents facteurs tels que la concentration d'ionophore, le temps de traitement avec l'ionophore, et la teneur en sucre de l'environnement extracellulaire (l'épuisement de glucose active des canaux de cation et facilite l'entrée de Ca2 dans l'espace cytosolique)30,31. Cependant, il y a peu de cohérence dans ces facteurs dans la littérature, ce qui rend difficile d'effectuer l'éryptose reproductiblement in vitro.
Dans ce protocole, nous présentons une procédure étape par étape pour induire l'éryptosis dans les érythrocytes humains. Les facteurs affectant l'éryptose réussie, y compris la concentration de Ca2, la concentration d'ionophore, le temps de traitement, et la pré-incubation dans le tampon glucose-appauvri sont examinés et des valeurs optimales sont rapportées. Cette procédure démontre que la pré-incubation des érythrocytes dans un tampon sans glucose augmente considérablement le pourcentage d'éryptosis par rapport au tampon contenant du glucose. Ce protocole peut être utilisé en laboratoire pour produire des érythrocytes éryptotiques pour diverses applications.
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Protocol
Tous les échantillons de sang humain utilisés dans le protocole décrit ci-dessous ont été achetés comme échantillons dé-identifiés. Aucun sujet humain n'a été directement impliqué ou recruté pour cette étude. Les lignes directrices de la Déclaration d'Helsinki devraient être utilisées lorsque la recherche porte sur des sujets humains.
1. Isolement d'érythrocyte du sang entier
- Ajouter 500 ll de sang entier dans du dextrose de citrate acide (ACD) (stocké à 4 oC) dans un tube de microcentrifuge.
REMARQUE : Le sang entier a été acheté dans ACD. Selon la société, 1,5 mL d'ACD est ajouté à 7 ml de sang entier (8,5 mL volume total). - Centrifuger le sang entier à 700 x g pendant 5 min à température ambiante (RT) et enlever le plasma clair et le mince manteau bouffi à l'aide d'une pipette pour laisser la couche d'érythrocyte rouge.
- Préparer 1 L de solution Ringer contenant 125 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM MgSO4, 32 mM HEPES, 5 mM de glucose, et 1 mM CaCl2. Ajustez le pH à 7,4 en ajoutant 2 gouttes de L de 1,0 M NaOH. Pour préparer la solution Ringer sans glucose, suivez le même protocole, mais n'incluez pas de glucose dans la solution.
- Laver les érythrocytes 2x dans la solution Ringer en suspendant la pastille cellulaire dans 1,5 ml de la solution Ringer, en centrifuge à 700 x g pendant 5 min à RT, et en enlevant le supernatant.
- Faire un hematocrit de 0,4 % en rependant 40 l l de granule d'érythrocyte dans 9 960 l de solution Ringer sans glucose pour atteindre un volume final de 10 ml.
REMARQUE: Hematocrit est un terme utilisé pour désigner la fraction de volume des érythrocytes en suspension. Un hematocrit de 0,4 % est une suspension contenant 0,4 % d'érythrocytes. - Incuber la suspension de la cellule à 37 oC pendant 7 jours.
2. Traitement des érythrocytes avec l'ionomycine et mesure de l'hémolyse
- Dissoudre 1 mg de sel de calcium ionomycine dans 630 l de sulfoxide de diméthyle (DMSO) pour atteindre une concentration finale de 2 mM. Aliquot et magasin à -20 oC.
- Prendre 1 ml de l'hématocrit de 0,4 % à partir de l'étape 1,5 et ajouter 0,5 l d'ionomycine de 2 mm pour atteindre une concentration finale de 1 M. Incubate pendant 2 h à 37 oC.
- Utilisez 1 mL de l'hématocrit sans traitement à l'ionomycine comme un contrôle négatif.
- Centrifuger les hématocrits traités par l'ionomycine et non traités à 700 x g pendant 5 min à RT, et enlever leurs supernatants pour laisser les granulés de cellules au fond des tubes.
- Laver les cellules 3x avec la solution Ringer en suspendant les granulés de cellules dans 1,5 ml de la solution Ringer, en centrifuge antà 700 x g pendant 5 min à RT et en jetant les supernatants.
- Pour mesurer l'hémolyse, ajouter 1 ml de l'hématocrit non traité de 0,4 % de l'étape 1,5 à un tube de microcentrifuge et incuber pendant 2 h à 37 oC comme contrôle négatif de l'hémolyse (0 %).
- Ajouter 1 ml de l'hématocrit non traité de 0,4 % de l'étape 1,5 à un tube de microcentrifugeet et centrifugeuse à 700 x g pendant 5 min à RT. Retirez le supernatant et ajoutez 1 ml d'eau distillée à la granule cellulaire et incubez pendant 2 h à 37 oC comme contrôle positif de l'hémolyse (100 %).
- Ajouter 1 mL de l'hématocrit de 0,4 % traité à l'ionomycine à partir de l'étape 2.2 à un tube microcentrifuge.
- Centrifugeles les cellules non traitées, les cellules traitées, et les cellules dans l'eau distillée à 700 x g pendant 5 min à RT.
- Prendre 200 l l des supernatants et ajouter à une assiette de 96 puits.
- Mesurer l'absorption à 541 nm à l'aide d'un lecteur de microplaques.
- Calculez l'hémolyse à l'aide de l'équation 132:
%Hémolyse (AT - A0)/(A100 - A0) 100
où A0 est l'absorption des érythrocytes dans la solution Ringer, A100 est l'absorption des érythrocytes dans l'eau, et AT est l'absorption des érythrocytes traités par l'ionomycine.
3. L'anxination de liaison Annexe-V
- Diluer 2 ml du tampon de liaison 5x annexe V dans 8 ml de saline tampontampon tamponde de phosphate (PBS) pour obtenir un tampon de liaison 1x.
- Resuspendre les granulés cellulaires traités et non traités à l'ionomycine à partir de l'étape 2,4 dans 1 ml de tampon de liaison 1x.
- Prenez 235 l de suspensions cellulaires dans le tampon de liaison et ajoutez 15 l de la farine 488 d'Annexin V-Alexa.
- Incuber les cellules à RT pendant 20 min dans un endroit sombre. Centrifugeuse à 700 x g pendant 5 min à RT et retirez le supernatant.
- Laver les cellules 2x avec un tampon de liaison 1x, en suspendant la pastille cellulaire dans 1,5 ml du tampon de liaison, en centrifuge à 700 x g pendant 5 min à RT et en enlevant le supernatant.
- Resuspendre les granulés cellulaires dans 250 l de tampon de liaison 1x pour les mesures de cytométrie du débit.
4. Cytométrie de flux
- Transférer 200 l des érythrocytes tachés d'annexine-V dans des tubes de polystyrène ronds de 1 ml compatibles avec la cytométrie du débit.
- Connectez-vous au logiciel de cytométrie de flux et cliquez sur le nouveau bouton d'expérience. Cliquez sur le nouveau bouton tube. Sélectionnez la feuille globale et choisissez l'analyse d'application pour mesurer l'intensité de fluorescence avec une longueur d'onde d'excitation de 488 nm et une longueur d'onde d'émission de 530 nm.
- Définir le nombre de cellules à 20 000 à recueillir pour l'analyse du tri cellulaire activé par la fluorescence (FACS).
- Sélectionnez le tube désiré et cliquez sur le bouton de chargement. Cliquez sur le bouton d'enregistrement pour les mesures de diffusion vers l'avant et de dispersion latérale. Répéter l'opération pour tous les échantillons.
- Cliquez à droite sur le bouton spécimen et cliquez sur appliquer l'analyse par lots pour générer le fichier de résultat.
- Cliquez à droite sur le bouton spécimen et cliquez sur générer des fichiers FSC.
- Ajoutez les données de cytométrie de flux (fichiers FSC) dans le lieu de travail du logiciel de cytométrie de flux.
- Analyser les données de contrôle en sélectionnant la population cellulaire d'intérêt et en ajoutant des statistiques pour la valeur de l'éryptose.
- Double clic sur le contrôle et sélectionnez l'histogramme par rapport à l'intensité de fluorescence.
- Cliquez sur le bouton de la porte pour dessiner une porte sur l'histogramme qui indique le pourcentage d'éryptose.
- Appliquer les mêmes statistiques pour tous les autres tubes expérimentaux pour obtenir les valeurs de l'éryptose. Cliquez à droite sur le contrôle et sélectionnez l'analyse de copie pour le groupe.
- Après avoir correctement gating tous les échantillons, transférer les données analysées en les faisant glisser et en les laissant tomber dans l'éditeur de mise en page.
- Regroupez les données analysées avec le contrôle de l'éditeur de mise en page.
- Définiz les histogrammes et les intensités souhaités en changeant l'axe x et y des graphiques superposés.
- Exportez des fichiers d'images en cliquant sur le bouton d'exportation et enregistrez les graphiques à l'emplacement souhaité.
5. Microscopie confocale
- Transférer 5 ll de cellules tachées d'annexine-V sur une lame de microscope et la recouvrir d'une feuille de couverture. Garder dans un endroit sombre pour éviter le photoblanchiment.
- Utilisez le laser Argon du microscope à fluorescence confocale pour observer les cellules excitées à 488 nm avec les grossissements désirés.
REMARQUE : Un microscope confocal n'est pas nécessairement nécessaire et n'importe quel microscope avec des capacités de fluorescence peut être employé pour obtenir des images de fluorescence qui démontrent la liaison d'annexin-V. - Obtenir des images de fluorescence du contrôle (cellules non traitées) et des cellules traitées.
REMARQUE : On s'attend à ce que les cellules non traitées montrent des signaux de fluorescence très faibles, tandis que les cellules traitées devraient montrer la fluorescence vert vif sur leurs membranes.
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Representative Results
Optimisation de la concentration d'ionomycine
Tandis que l'ionomycine est exigée pour induire l'éryptosis, les concentrations accrues d'ionomycine peuvent mener à l'hémolyse (c.-à-d. lysis des érythrocytes et à la libération de l'hémoglobine), qui doit être évitée. Le traitement des érythrocytes avec 1 ionomycine m dans la solution Ringer pendant 2 h suffit à induire l'éryptose, comme en témoigne l'étiquetage réussi avec annexin-V Alexa Flour 488 conjugué et quantification par l'analyse FACS (Figure 1A). Des concentrations plus élevées d'ionomycine (5 et 10 M) entraînent une légère augmentation de l'éryptose(figure 1A-D). Cependant, de telles concentrations augmentent également l'hémolyse (figure 1E), ce qui n'est pas souhaité. Afin de rester en dessous de 5% d'hémolyse, 1 ionomycine m doit être utilisé.
Temps de traitement avec ionomycine
L'incubation d'érythrocytes avec de l'ionomycine dans la solution Ringer pour aussi peu que 30 min suffit à induire l'éryptose (Figure 2A). L'augmentation du temps d'incubation augmente le niveau d'éryptose, mesuré par l'assiduien de liaison V de l'annexine, jusqu'à 2 h (Figure 2B,C). Cependant, un temps d'incubation supplémentaire entraîne une légère diminution du niveau d'éryptose(figure 2D). L'éryptose maximale a été obtenue après 2 h de traitement avec 1 'M ionomycine, et pour tous les autres temps de traitement, l'éryptose inférieure a été obtenue (figure 2E). Les histogrammes de cytométrie de flux représentatifs sont présentés à la figure 2A-D. En outre, le pourcentage moyen d'éryptose et d'hémolyse, pour diverses périodes de traitement avec 1 'M d'ionomycine, sont présentés dans la figure 2E et la figure 2F, respectivement. La valeur plus élevée de l'hémolyse après 180 min explique la réduction de l'éryptose après la même quantité d'incubation (Figure 2E) que les cellules moins viables existent sur 180 min de traitement avec l'ionomycine.
De plus, les cellules ont été traitées avec de faibles concentrations d'ionomycine, y compris 0, 0,25, 0,5 et 1 M pour des temps de traitement plus longs, y compris 6 et 12 h, et l'éryptose a été mesurée (figure 3). Les cellules traitées avec des concentrations d'ionomycine inférieures de 1 M pour 6 et 12 h montrent une éryptose inférieure par rapport aux cellules traitées avec 1 'M ionomycine (Figure 3). Étant donné que la diminution de la concentration et l'augmentation du temps d'exposition n'ont pas amélioré l'éryptose, 1 M a été utilisé pour déclencher l'éryptose.
L'éryptose dépend du temps d'incubation et de la concentration extracellulaire de glucose
La concentration extracellulaire de glucose affecte le résultat du processus. Des valeurs plus élevées d'éryptose sont observées quand les érythrocytes sont pré-incubés dans la solution de sonnerie sans glucose comparée à la solution de ringer glucose-contenante avant l'incubation avec 1 'M ionomycin pendant 2 h. Les valeurs d'éryptose les plus élevées sont obtenues après 7 jours de pré-incubation dans les deux solutions. Cependant, l'éryptose est plus élevée après la pré-incubation dans la solution Ringer sans glucose par rapport à la solution Ringer normale, qui contient 5 mM de glucose (voir la figure 4A pour les parcelles représentatives et la figure 4B pour la comparaison des moyens globaux). De plus, les histogrammes de dispersion vers l'avant indiquent l'effet de l'épuisement du glucose sur le rétrécissement de l'érythrocyte(figure 5A-D). La diffusion vers l'avant est une mesure de la taille des cellules basée sur la réfraction de la lumière, et le niveau de lumière dispersée est directement proportionnel à la taille des cellules33. Les cellules incubées dans la solution Ringer sans glucose montrent moins de diffusion vers l'avant par rapport aux cellules incubées dans un tampon contenant du glucose (Figure 5E), indiquant le rétrécissement cellulaire dans l'environnement sans glucose.
En plus des mesures de cytométrie d'écoulement, des cellules ont été observées sous un microscope de fluorescence confocale pour confirmer l'éryptosis. Les érythrocytes sans traitement (figure 6A) et avec le traitement d'ionomycine (figure 6B) ont été étiquetés avec l'annexin-V Alexa Farine 488 conjugué et observés au microscope. Les cellules traitées ont montré un signal de fluorescence lumineux (figure 6B) en raison de la liaison de l'annexine-V à PS dans le dépliant externe. En revanche, les cellules sans traitement ont montré un signal de fluorescence très faible (figure 6A) indiquant l'éryptose très faible. D'autres exemples d'érythrocytes éryptotiques étiquetés avec l'annexine-V avec le signal de fluorescence élevé sont montrés dans la figure 6C.
Figure 1 : Graphiques représentatifs de l'effet de diverses concentrations d'ionomycine sur l'éryptose et l'hémolyse. Histométrie de flux d'érythrocytes traités avec (A) 1 M,( B) 5 M, et (C) 10 'M ionomycin (gris) à 37 oC à 0,4% hématocrit dans la solution Ringer pour 2 h. La ligne noire indique les cellules non traitées. Le pourcentage d'éryptose est indiqué dans chaque figure. L'exposition à la phosphatidylserine a été mesurée à l'aide de la liaison annexine-V. (D) Arithmétique signifie - SD (n - 3) du pourcentage d'éryptosis des cellules traitées avec différentes concentrations d'ionomycine après 2 h de traitement, et (E) signifie arithmétique - SD (n - 3) de l'hémolyse des érythrocytes par différentes concentrations d'ionomycine dans les mêmes conditions. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2 : Chiffres représentatifs sur l'effet de divers temps de traitement de l'ionomycine sur l'éryptose. Histométrie de flux d'érythrocytes traités avec 1 'M ionomycine (gris) à 37 oC pour (A) 30 min, (B) 60 min, (C) 120 min, et (D) 180 min à 0,4% d'hématocrit dans la solution Ringer. La ligne noire indique les cellules non traitées. Le pourcentage d'éryptose est indiqué dans chaque figure. L'exposition de Phosphatidylserine a été mesurée par la liaison d'annexine-V. (E) Arithmétique signifie - SD (n - 3) de pourcentage d'éryptosis des cellules traitées avec 1 'M ionomycine pour des moments différents. L'éryptose la plus élevée a été obtenue après 120 min traitement. (F) Arithmétique signifie - SD (n - 3) de pourcentage d'hémolyse des cellules traitées avec 1 'M ionomycine pour des moments différents. Pour l'analyse statistique, l'ANOVA non paramétrique à sens unique avec le test Kruskal-Wallis a été effectuée, et l'éryptose après 120 min de traitement était significativement plus élevée que le contrôle, comme indiqué dans le panneau E. - est pour p 'lt; 0.05. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3 : Effet de diverses concentrations d'ionomycine et temps de traitement sur l'éryptose. Arithmétique signifie - SD (n - 3) du pourcentage d'éryptosis des cellules traitées avec différentes concentrations d'ionomycine est montré après diverses périodes de traitement. Les cellules ont été traitées avec de faibles concentrations d'ionomycine, y compris 0, 0,25, 0,5 et 1 M pour une exposition plus longue (6 h et 12 h). Des concentrations plus élevées et des traitements plus longs ont eu comme conséquence des valeurs plus élevées d'éryptosis. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 4 : Effet de l'épuisement énergétique sur l'éryptose. (A) Histogram de cytométrie de flux pour les érythrocytes traités avec 1 'M ionomycine (gris) à 37 oC pour 2 h à 0,4% d'hématocrit, après pré-incubation dans la solution Ringer sans glucose (chiffres supérieurs) et la solution Ringer (chiffres inférieurs) de 1 à 7 jours, révèle que l'épuisement de l'énergie facilite l'éryptose. La ligne noire indique les cellules non traitées. Les pourcentages d'éryptose sont indiqués dans les graphiques pour chaque jour. (B) Arithmétique signifie - SD (n - 3) du pourcentage d'éryptères traités avec 1 'M ionomycine à 37 oC pour 2 h à 0,4% d'hématocrit, après pré-incubation dans la solution Ringer (barres noires) et sans glucose Solution Ringer (barres blanches) de 1 à 7 jours. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 5 : Effet de l'épuisement énergétique sur la taille des cellules. Histogramme de dispersion vers l'avant pour les érythrocytes traités à 1 m ionomycine à 37 oC pour 2 h à 0,4 % d'hématocrit, après pré-incubation dans la solution Ringer sans glucose (gris) et la solution Ringer (ligne noire) pour (A) 1 jour, (B) 3 jours, (C) 5 jours, et (D) 7 jours. L'histogramme de diffusion vers l'avant au fil du temps indique le rétrécissement d'érythrocyte dans le tampon sans glucose. (E) Arithmétique signifie - SD (n - 3) des intensités de dispersion vers l'avant des érythrocytes traités avec 1 'M ionomycine à 37 oC pour 2 h à 0,4% hématocrit, après pré-incubation dans la solution Ringer (barres noires) et sans glucose Solution Ringer (barres blanches) de 1 à 7 jours. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 6 : Images de microscopie de fluorescence confocale d'érythrocytes traités par (A) 0 M, (B) et (C) 1 'M ionomycine à 37 oC pour 2 h à 0,4% d'hématocrit. 40x grossissement objectif a été utilisé pour les images dans les panneaux A et B, et 100x grossissement objectif a été utilisé pour prendre des images pour le panneau C. PS dans les érythrocytes sains est situé sur le dépliant interne de la membrane cellulaire, donc il n'y a pas de signal de fluorescence dans le panneau A. Dans les panneaux B et C érythrocytes ont été induits pour l'éryptose et il ya un signal de fluorescence lumineux résultant de la liaison de l'annexine-V à PS translocated à la foliole externe de la membrane cellulaire. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
| Densité cellulaire /hématocrit | Concentration d'ionomycine | Tampon | Pré-incubation | Temps de traitement avec ionomycine | Méthode de détection | Référence |
| 1,65 x 108 cellules/mL | 0,3 mm | Tampon A | 36 h dans le tampon A | 1 h | Annexe V | 12 |
| 0.40% | 1 mM | Solution Ringer | 48 h à Ringer | 1 h | Annexe V | 17 |
| 50% | 10 mM | Tampon B | - | 3 h | Merocyanine 540 | 18 |
| 0.40% | 1 mM | Solution Ringer | 48 h à Ringer | 1 h | Annexe V | 19 |
| 0.40% | 1 mM | Solution Ringer | 48 h à Ringer | 1 h | Annexe V | 20 |
| 2% | 1 mM | Solution Ringer | - | 4 h | Annexe V | 21 |
| 0.40% | 1 mM | Solution Ringer | - | 0,5 h | Annexe V | 22 |
| 10% | 1 mM | Solution Ringer | - | 3 h | Annexe V | 23 |
| 0.40% | 10 mM | Solution Ringer | - | 0,5 h | Annexe V | 24 |
| 0.40% | 1 mM | Solution Ringer | 48 h à Ringer | 0,5 h | Annexe V | 25 |
| 2 x 106 cellules/mL | 1 mM | HePES-tamponné saline (HBS) | - | 0,5 h | Annexe V | 26 |
| -Buffer A: 10 mM HEPES, 150 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM MgCl2'6H2O, 10 mM de glucose, et 1.8 mM CaCl2'2H2O | ||||||
| Tampon B : 5 mM Tris, 100 mM KC1, 60 mM NaCl et 10 mM de glucose | ||||||
Tableau 1 : Divers protocoles utilisés dans la littérature pour induire l'éryptose à l'aide d'ionomycine.
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Discussion
Le but de cette procédure est de fournir des valeurs optimales pour la concentration d'ionophore, le temps de traitement, et la concentration extracellulaire de glucose, qui sont des facteurs importants en assurant l'induction réussie de l'éryptosis. Une étape critique dans le protocole est l'épuisement du glucose extracellulaire, qui, en dépit de son importance, n'a pas été suffisamment souligné dans la littérature. La teneur en sucre dans la solution Ringer normale (5 mM) a un effet inhibiteur sur l'éryptose. L'épuisement du glucose dans l'environnement extracellulaire induit le stress cellulaire et active la protéine kinase C (PKC), ce qui entraîne l'activation des canaux de calcium et de potassium. Il en résulte une augmentation de l'entrée de Ca2 dans l'espace cytosolique30,31,34 et active finalement la scramblase16, ce qui augmente l'éryptose. L'activation du canal de potassium a également comme conséquence la fuite de chlorure de potassium hors de la cellule, qui mène au rétrécissementérythrocyte 35.
La procédure décrite ci-dessus doit être effectuée avec une attention particulière à l'hémolyse. Il est important d'utiliser une concentration d'ionophore optimisée, qui est assez élevée pour induire l'éryptose, et assez basse pour empêcher l'hémolyse. De même, l'incubation d'érythrocytes avec de l'ionomycine pendant une courte période de temps entraîne une faible éryptose tandis que l'incubation très longue peut conduire à une perturbation de la membrane cellulaire et l'hémolyse. Il convient également de noter que bien que le protocole présenté soit très fiable lorsqu'il est réalisé sur le même échantillon d'érythrocytes, les cellules de différentes personnes réagissent différemment à l'ionomycine et il pourrait y avoir une variabilité inter-sujets entre différents échantillons.
Une attention particulière devrait être accordée à l'analyse des données de la cytométrie des flux. Le pourcentage d'éryptose obtenue à partir du cytomètre de débit indique le pourcentage de population cellulaire avec PS sur leur feuilleté externe. Cependant, les cellules avec différentes intensités de liaison annexe-V ne peuvent pas être distinguées sur la base de ce nombre. L'annexe-V se lie au PS exposé sur la surface cellulaire, avec une très grande affinité et une grande spécificité à PS36,37,38. Cependant, comme le montrent les images de microscopie de ce rapport, différentes cellules montrent des différences dans l'intensité de liaison annexe-V. Les cellules avec le BAS PS sur leurs membranes ont l'intensité basse de fluorescence, alors que l'occupation plus élevée de PS sur la membrane cellulaire a comme conséquence des intensités plus élevées de fluorescence.
Le protocole présenté dans cet article peut être modifié en augmentant la concentration extracellulaire de Ca2. Dans ce protocole, l'ionomycine a été utilisée pour induire l'éryptose en présence de 1 mM CaCl2; des concentrations plus élevées de Ca2 MD pourraient entraîner une augmentation des niveaux de calcium intracellulaire et entraîner plus d'éryptose. En outre, différents ionophores de calcium, tels que le selectophore et la calcimycine, pourraient avoir la capacité différente d'augmenter la concentration intracellulaire de Ca2,comparé à l'ionomycine, et pourraient avoir comme conséquence les valeurs différentes d'éryptosis. Cependant, l'éryptose cohérente des érythrocytes peut être réalisée utilisant l'ionomycine avec le protocole décrit et peut être employée dans le laboratoire pour examiner les mécanismes moléculaires de l'éryptosis, imitent des conditions malades39,40in vitro,et les thérapies potentielles d'écran qui empêchent l'éryptosis, entre autres applications.
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Disclosures
Les auteurs n'ont rien à révéler.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par la subvention des NIH R15ES030140 et la subvention DE nSF CBET1903568. Le soutien financier du Russ College of Engineering and Technology et du Département de génie chimique et biomoléculaire de l'Université de l'Ohio est également reconnu.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96-well plate | Fisher Scientific | 12-565-331 | |
| Annexin V Alexa Fluor 488 - apoptosis kit | Fisher Scientific | A10788 | Store at 4 °C |
| BD FACSAria II flow cytometer | BD Biosciences | 643177 | |
| CaCl2 | Fisher Scientific | C79-500 | |
| Centrifuge | Millipore Sigma | M7157 | Model Eppendorf 5415C |
| Confocal fluorescence microscopy | Zeiss, LSM Tek Thornwood | Model LSM 510, Argon laser excited at 488 nm for taking images | |
| Cover glasses circles | Fisher Scientific | 12-545-100 | |
| Disposable round bottom flow cytometry tube | VWR | VWRU47729-566 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | 472301-100ML | |
| DPBS | VWR Life Science | SH30028.02 | |
| Glucose monohydrate | Sigma-Aldrich | Y0001745 | |
| HEPES Buffer (1 M) | Fisher Scientific | 50-751-7290 | Store at 4 °C |
| Ionomycin calcium salt | EMD Milipore Corp. | 407952-1MG | Dissolve in DMSO to reach 2 mM. Store at -20 °C |
| KCl | Fisher Scientific | P330-500 | |
| MgSO4 | Fisher Scientific | M65-500 | |
| Microcentrifuge tube | Fisher Scientific | 02-681-5 | |
| NaCl | Fisher Scientific | S271-500 | |
| Plain glass microscope slides | Fisher Scientific | 12-544-4 | |
| Synergy HFM microplate reader | BioTek | ||
| Whole blood in ACD | Zen-Bio | Store at 4 °C and warm to 37 °C prior to use |
References
- Bratosin, D., et al. Programmed Cell Death in Mature Erythrocytes: A Model for Investigating Death Effector Pathways Operating in the Absence of Mitochondria. Cell Death and Differentiation. 8 (12), 1143-1156 (2001).
- Lang, E., Lang, F. Mechanisms and Pathophysiological Significance of Eryptosis, the Suicidal Erythrocyte Death. Seminars in Cell and Developmental Biology. 39, 35-42 (2015).
- Garnier, M., et al. Erythrocyte Deformability in Diabetes and Erythrocyte Membrane Lipid Composition. Metabolism. 39 (8), 794-798 (1990).
- Verkleij, A. J., et al. The Asymmetric Distribution of Phospholipids in the Human Red Cell Membrane. A Combined Study Using Phospholipases and Freeze-Etch Electron Microscopy. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) Biomembranes. 323 (2), 178-193 (1973).
- de Back, D. Z., Kostova, E. B., van Kraaij, M., van den Berg, T. K., van Bruggen, R. Of Macrophages and Red Blood Cells; A Complex Love Story. Frontiers in Physiology. 5, 9 (2014).
- Fadok, V. A., et al. A Receptor for Phosphatidylserine-Specific Clearance of Apoptotic Cells. Nature. 405 (6782), 85-90 (2000).
- Henson, P. M., Bratton, D. L., Fadok, V. A. The Phosphatidylserine Receptor: A Crucial Molecular Switch. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 2 (8), 627-633 (2001).
- Messmer, U. K., Pfeilschifter, J. New Insights into the Mechanism for Clearance of Apoptotic Cells. BioEssays. 22 (10), 878-881 (2000).
- Basu, S., Banerjee, D., Chandra, S., Chakrabarti, A. Eryptosis in Hereditary Spherocytosis and Thalassemia: Role of Glycoconjugates. Glycoconjugate Journal. 27 (9), 717-722 (2010).
- Kuypers, F. A., et al. Detection of Altered Membrane Phospholipid Asymmetry in Subpopulations of Human Red Blood Cells Using Fluorescently Labeled Annexin V. Blood. 87 (3), 1179-1197 (1996).
- Lang, F., Lang, E., Fller, M. Physiology and Pathophysiology of Eryptosis. Transfusion Medicine and Hemotherapy. 39 (5), 308-314 (2012).
- Wróbel, A., Bobrowska-Hägerstrand, M., Lindqvist, C., Hägerstrand, H. Monitoring of Membrane Phospholipid Scrambling in Human Erythrocytes and K562 Cells with FM1-43 - a Comparison with Annexin V-FITC. Cellular and Molecular Biology Letters. 19 (2), 262-276 (2014).
- Mohandas, N., Gallagher, P. G. Red Cell Membrane: Past, Present, and Future. Blood. 112 (10), 3939-3948 (2008).
- Barber, L. A., Palascak, M. B., Joiner, C. H., Franco, R. S. Aminophospholipid Translocase and Phospholipid Scramblase Activities in Sickle Erythrocyte Subpopulations. British Journal of Haematology. 146 (4), 447-455 (2009).
- Pretorius, E., Du Plooy, J. N., Bester, J. A. A Comprehensive Review on Eryptosis. Cellular Physiology and Biochemistry. 39 (5), 1977-2000 (2016).
- Suzuki, J., Umeda, M., Sims, P. J., Nagata, S. Calcium-Dependent Phospholipid Scrambling by TMEM16F. Nature. 468 (7325), 834-838 (2010).
- Bhuyan, A. A. M., Haque, A. A., Sahu, I., Coa, H., Kormann, M. S. D., Lang, F. Inhibition of Suicidal Erythrocyte Death by Volasertib. Cellular Physiology and Biochemistry. 43 (4), 1472-1486 (2017).
- Chandra, R., Joshi, P. C., Bajpai, V. K., Gupta, C. M. Membrane Phospholipid Organization in Calcium-Loaded Human Erythrocytes. Biochimica et Biophysica Acta. 902 (2), 253-262 (1987).
- Alzoubi, K., Calabrò, S., Egler, J., Faggio, C., Lang, F. Triggering of Programmed Erythrocyte Death by Alantolactone. Toxins (Basel). 6 (12), 3596-3612 (2014).
- Jacobi, J., et al. Stimulation of Erythrocyte Cell Membrane Scrambling by Mitotane. Cellular Physiology and Biochemistry. 4 (33), 1516-1526 (2014).
- Totino, P. R. R., Daniel-Ribeiro, C. T., Ferreira-da-Cru, M. Refractoriness of Eryptotic Red Blood Cells to Plasmodium Falciparum Infection: A Putative Host Defense Mechanism Limiting Parasitaemia. PLoS One. 6 (10), e26575 (2011).
- Borst, O., et al. Dynamic Adhesion of Eryptotic Erythrocytes to Endothelial Cells via CXCL16/SR-PSOX. American Journal of Physiology - Cell Physiology. 302 (4), C644-C651 (2011).
- Tagami, T., Yanai, H., Terada, Y., Ozeki, T. Evaluation of Phosphatidylserine-Specific Peptide-Conjugated Liposomes Using a Model System of Malaria-Infected Erythrocytes. Biological and Pharmaceutical Bulletin. 38 (10), 1649-1651 (2015).
- Mahmud, H., et al. Suicidal Erythrocyte Death, Eryptosis, as a Novel Mechanism in Heart Failure-Associated Anaemia. Cardiovascular Research. 98 (1), 37-46 (2013).
- Signoretto, E., Castagna, M., Lang, F. Stimulation of Eryptosis, the Suicidal Erythrocyte Death by Piceatannol. Cellular Physiology and Biochemistry. 38 (6), 2300-2310 (2016).
- Lange, Y., Ye, J., Steck, T. L. Scrambling of Phospholipids Activates Red Cell Membrane Cholesterol. Biochemistry. 46 (8), 2233-2238 (2007).
- Lang, F., et al. Eryptosis, a Window to Systemic Disease. Cellular Physiology and Biochemistry. 22 (6), 373-380 (2008).
- Gil-Parrado, S., et al. Ionomycin-Activated Calpain Triggers Apoptosis. A Probable Role for Bcl-2 Family Members. Journal of Biological Chemistry. 277 (30), 27217-27226 (2002).
- Liu, C. M., Hermann, T. E. Characterization of Ionomycin as a Calcium Ionophore. Journal of Biological Chemistry. 253 (17), 5892-5894 (1978).
- Klarl, B. A., et al. Protein Kinase C Mediates Erythrocyte "Programmed Cell Death" Following Glucose Depletion. American Journal of Physiology - Cell Physiology. 290 (1), C244-C253 (2006).
- Danilov, Y. N., Cohen, C. M. Wheat Germ Agglutinin but Not Concanavalin A Modulates Protein Kinase C-Mediated Phosphorylation of Red Cell Skeletal Proteins. FEBS Letters. 257 (2), 431-434 (1989).
- Nazemidashtarjandi, S., Farnoud, A. M. Membrane Outer Leaflet Is the Primary Regulator of Membrane Damage Induced by Silica Nanoparticles in Vesicles and Erythrocytes. Environmental Science Nano. 6 (4), 1219-1232 (2019).
- Jaroszeski, M. J., Heller, R. Flow Cytometry Protocols. , Humana Press. Totowa, NJ. (2003).
- Ghashghaeinia, M., et al. The Impact of Erythrocyte Age on Eryptosis. British Journal of Haematology. 157 (5), 1365 (2012).
- Repsold, L., Joubert, A. M. Eryptosis: An Erythrocyte's Suicidal Type of Cell Death. Biomed Research International. 2018 (5), 9405617 (2018).
- Tait, J. F., Gibson, D., Fujikawa, K. Phospholipid Binding Properties of Human Placental Anticoagulant Protein-I, a Member of the Lipocortin Family. Journal of Biological Chemistry. 264 (14), 7944-7949 (1989).
- Andree, H. A. M., et al. Binding of Vascular Anticoagulant α (VACα) to Planar Phospholipid Bilayers. Journal of Biological Chemistry. 265 (9), 4923-4928 (1990).
- Tait, J. F., Gibson, D. F., Smith, C. Measurement of the Affinity and Cooperativity of Annexin V-Membrane Binding under Conditions of Low Membrane Occupancy. Analytical Biochemistry. 329 (1), 112-119 (2004).
- Jiang, P., et al. Eryptosis as an Underlying Mechanism in Systemic Lupus Erythematosus-Related Anemia. Cellular Physiology and Biochemistry. 40 (6), 1391-1400 (2016).
- Chakrabarti, A., Halder, S., Karmakar, S. Erythrocyte and Platelet Proteomics in Hematological Disorders. Proteomics - Clinical Applications. 10 (4), 403-414 (2016).
