En ny tre-dimensionel sfænode model baseret på den heterotypic interaktion af tumorceller og stromale fibroblaster er etableret. Her præsenterer vi coculture af tumorceller og stromale fibroblaster, time-lapse imaging, og konfokal mikroskopi til at visualisere dannelsen af sfæller. Denne tre-dimensionelle model tilbyder en relevant platform til at studere tumor-stroma interaktioner og teste kræft terapeutiske.
Tumor-stroma interaktioner spiller en vigtig rolle i kræft progression. Tre-dimensionelle (3D) tumor sfænoide modeller er de mest udbredte in vitro model i studiet af kræft stamceller / indlede celler, præklinisk kræft forskning, og narkotika screening. 3D sfænoide modeller er bedre end konventionelle tumor celle kultur og gengive nogle vigtige tegn på reelle solide tumorer. Men, konventionelle 3D tumor sfænoider består udelukkende af tumorceller. De mangler deltagelse af tumor stromale celler og har utilstrækkelig ekstracellulær matrix (ECM) deposition, således kun delvist efterligne in vivo betingelser for tumorvæv. Vi etablerede en ny multicellulær 3D sfærisk model bestående af tumorceller og stromale fibroblaster, der bedre efterligner in vivo heterogene tumor mikromiljø og dens indfødte desmoplasi. Dannelsen af sfæroider er strengt reguleret af tumor stromale fibroblaster og bestemmes af aktiviteten af visse afgørende intracellulære signalering veje (f.eks Notch signalering) i stromale fibroblaster. I denne artikel præsenterer vi teknikker ne til samkultur af tumorceller-stromale fibroblaster, time-lapse billeddannelse for at visualisere cellecelleinteraktioner og konfokale mikroskopi for at vise 3D-arkitektoniske træk ved sfællerne. Vi viser også to eksempler på den praktiske anvendelse af denne 3D sfænode model. Denne nye multicellulære 3D sfærisk e-model tilbyder en nyttig platform for at studere tumor-stroma interaktion, belyse, hvordan stromale fibroblaster regulere kræft stamceller / indlede celler, som bestemmer tumor progression og aggressivitet, og udforske inddragelse af stromale reaktion i kræft narkotika følsomhed og resistens. Denne platform kan også være en relevant in vitro model for narkotika opdagelse.
Solide tumorer repræsenterer komplekse væv bestående af neoplastiske celler og et stort udvalg af stromale celler1,2,3,4. Stromal fibroblaster, eller kræft-associerede fibroblaster (CAF), er en af de fremtrædende stromale cellepopulationer i de fleste typer af faste tumorer. De er kritisk involveret i reguleringen af tumorvækst, stængelitet, metastase, angiogenese, og resistens gennem produktion af vækstfaktorer, cytokiner / chemokiner, syntese af ECM og remodeling enzymer (f.eks kollagen, fibronectin, og matrix metalloproteases), frigivelse af exosomer, og direkte heterotypic cellecelle interaktion5,6,7,8,9,10 11,11 . CAF deltager også i fastsættelsen af kræft organspecifikke metastase ved at forhåndsvælge en delmængde af tumor kloner fra heterogene tumor celle populationer i den primære læsion og fremme disse udvalgte kloner, der skal primes for metastase til en bestemt fjern organ, hvis mikromiljø er optimal til genkolonisering af udvalgte kloner12. Desuden fibroblaster og deres udskillede opløselige faktorer og ECM deltage i graduering af tumor angiogenese13,14, anti-tumor immunrespons15,og er endda involveret i resistens over for lægemidler og tumor gentagelse16,17.
In vitro 3D tumor sfænoide modeller er blevet udviklet og brugt i kræftforskning som en mellemliggende model mellem in vitro kræft celle kulturer og in vivo tumor modeller18,19,20,21. 3D tumor sfænoide modeller har vundet popularitet i kræft stamcelleforskning, præklinisk kræft forskning, og narkotika screening, fordi disse modeller reproducere nogle vigtige funktioner i reelle tumorer, der er fraværende i traditionelle 2D monolag22. Mange eksisterende 3D tumor sfænoide modeller er udelukkende består af tumorceller og mangler deltagelse af tumor stromale celler. Dette resulterer ofte i tumor sfænoider har utilstrækkelig ECM deposition og fravær af heterotypic celle-celle interaktioner. Konventionelle 3D sfænoider dannet udelukkende af kræftceller og enslypisk celle-celle vedhæftning kan kun delvist efterligne in vivo betingelser for tumorvæv. For at overvinde nogle af disse begrænsninger, efterforskere har foreslået at indarbejde flere typer af stromale celler i 3D cocultures og udviklet flere heterotype 3D tumor sfænode modeller23,24,25,26,27. Desuden har efterforskere ansat udefrakommende 3D matricer, herunder naturlige hydrogels eller syntetiske polymerer såsom polyethylen glycol, poly (lactide-co-glycolide), og poly (N-isopropylacrylamid), at integrere monocellulære og flercellede sfænode modeller, skabe en celle-støttende miljø og reproducere celle-matrix interaktioner28,29, hvilket gør disse systemer mere biologisk relevante30. Men inkorporering af visse typer af stromale celler, såsom endotelceller, i 3D-cokulturer medfører yderligere kompleksitet for et in vitro-system og gør det vanskeligt at studere heterotypic cellecelle interaktioner mellem to specifikke typer af celler, såsom kræft celle-fibroblast interaktioner. Desuden, endotelceller i virkelige væv ikke altid direkte interagere med kræftceller og andre stromale celler, fordi der er et lag af kælderen membran indpakket uden for kapillærer, der forhindrer endotelceller fra direkte interagere med kræftceller og andre stromale celler. I disse 3D sfæroide modeller, indarbejdet endotelceller faktisk ikke danner blodkar, men interagerer direkte med kræftceller og andre stromale celler, noget, der sjældent forekommer in vivo. Tilsvarende, udefrakommende matricer ansat i nogle af de 3D sfænode modeller er ikke identiske med ECM i reelle tumorvæv med hensyn til struktur og sammensætning. Alle disse kunstige tilstande kan resultere i vildledende data.
Vi har for nylig skabt en ny multicellulær 3D sfænode model bestående af tumorceller og CAF. I vores model, dannelsen af 3D tumor sfænoider er helt bestemt af CAF. CAF fremkalde og regulere fænotype af tumor stamceller / indlede celler. Den ECM produceret af CAF er naturligt og gør det muligt for desmoplastiske struktur til bedre at efterligne in vivo tumor mikromiljø. Denne nye 3D-model kan være et nyttigt redskab til kræft stof screening og tilbyder en unik platform til at studere tumor-stroma interaktion, belyse, hvordan CAF regulere kræft stamceller / indlede celler, og udforske inddragelsen af stromale interaktioner i kræft narkotika følsomhed og resistens.
In vitro 3D celle kultur teknikker har været meget anvendt i årtier i kræftforskning. Sammenlignet med konventionelle 2D celle kultursystemer, 3D mikromiljø opsummerer celle-celle og / eller celle-matrix interaktioner og gør det muligt efterligne de ægte betingelser observeret i tumorvæv. Men, et 3D-system dannet kun af kræftceller og enslydecelle-celle interaktioner tager ikke hensyn til betydningen af heterotypic cross talk og kan give unøjagtige resultater i forskning. Vi har for nylig udviklet et nyt 3D-system, der kombinerer kræftceller og CAF til bedre at efterligne in vivo heterogene tumor mikromiljø og dens indfødte og stive desmoplastiske reaktion.
Fibroblaster er vigtige komponenter i tumor stroma. CAF er involveret i reguleringen af tumor progression ved at fremkalde opløselige faktorer, ECM / remodeling enzymer10,11,og exosomer. Derudover, CAF spiller en rolle i resistens over for lægemidler og tumor tilbagefald16,17. Vores multicellulære 3D sfærode system kan udnyttes til at udforske molekylære mekanismer af tumor-stromale interaktioner og til at løse resistens over for lægemidler og tumor gentagelse. CAF er primært afledt af aktiverede lokale quiescent fibroblaster og rekrutteret cirkulerende knoglemarv MSC, som gennemgår in situ differentiering i CAF i tumorvæv37,38,39. I den nuværende undersøgelse, vi brugte hud fibroblaster til at skabe en multicellulær 3D sfænode model. Men, anden type fibroblaster (f.eks MSC-DF), også arbejde på en meget lignende måde som hud fibroblaster til at regulere tumorcelle 3D sfænode dannelse34. MSC-DF kan genereres fra murine knoglemarv MSC, som er beriget med dyrkning knoglemarvmononukleare celler i MSC celle kultur medium for omkring 10 dage med periodiske medium ændringer hver 3 dage. Disse MSC er karakteriseret som CD73+/CD105+/Lin–. For at differentiere MSC i fibroblaster, MSC er efterfølgende dyrket med komplet DMEM i yderligere 2 uger. MSC-DF er karakteriseret som α-SMA+/Vimentin+/FSP-1+ celler36. MSC-DF kan være vigtige tumor regulatorer. Fordi en brøkdel af CAF i mange typer af faste tumorer er differentieret fra rekrutteret cirkulerende MSC frigivet fra knoglemarv36,MSC-DF kan være lovende behandlingsmål. De er også meget lettere terapeutisk manipuleret eller målrettet, før de rekrutteres til tumorvæv og differentieret i CAF. Således tilbyder vores 3D-model et ideelt system til at studere og teste ikke kun kræftceller, men også forskellige fraktioner eller delpopulationer af CAF. Metoden til 3D sfærode dannelse er ligetil. De kritiske trin omfatter brug af serum fri medium for coculture, anvende det rigtige forhold mellem fibroblaster til tumorceller, og ved hjælp af de rigtige kulturplader til coculture. Den potentielle begrænsning af vores metode er, at dannelsen af 3D sfæroider er stort set kræft celle linje-afhængige. Vores sfænode dannelse protokol kan kræve optimering af forholdet mellem fibroblaster og kræftceller, hvis forskellige kræft cellelinjer er ansat. Det skal bemærkes, at vi brugte en menneskelig melanom celle og mus fibroblast celle coculture model til dannelsen af 3D sfænoider, fordi det er meget lettere at skabe GOF eller LOF celler i mus fibroblaster til undersøgelse af den rolle, et molekyle eller signalering vej i reguleringen tumor sfænode dannelse. Evnen af menneskelige melanom celler og mus fibroblaster til at danne sfæroider indikerer, at molekyler, der kræves for celle-celle kommunikation arbejde på tværs af arter. Vi har for nylig testet cokultur af menneskelige fibroblaster med menneskelige melanom celler og fandt, at menneskelige fibroblaster også kan regulere menneskelige melanom celler til at danne 3D sfænoider.
Vi anvendte humane metastatiske melanomceller, C8161, i vores multicellulære 3D sfænode model. Vi har også testet andre humane melanom celler, for eksempel, 1205Lu32, som bærer BRAFV600E mutation, og MeWo, som udtrykker høje niveauer af CDK4/ Kit (ATCC HTB-65), og fandt, at de også er i stand til at danne 3D sfænoider i coculture. Dette indikerer, at dannelsen af 3D sfænoider af tumorceller er uafhængig af de typer af onkogenmutationer. Selv om vi ikke har testet, om andre typer af ikke-melanom tumorceller er i stand til at danne 3D sfænoider med fibroblaster, vores resultater viser, at dannelsen af 3D sfænoider ikke er begrænset til en melanom cellelinje og kan ikke afhænge af en bestemt kræft cellelinje.
Vi viste to eksempler på praktiske anvendelser af vores 3D sfænode model. Et eksempel var at belyse den intracellulære Notch signalering vej aktivitet i reguleringen af kræft stilken / indlede celle fænotype og 3D sfænode dannelse. Vi viste, at den intracellulære Notch signalering vej i CAF er en molekylær switch, der styrer fænotype af kræft stamceller / indlede celler ved hjælp af denne 3D sfænode model. Vores resultater ikke kun afdække en molekylær mekanisme underliggende stromal regulering af kræft stamceller / indlede celler og kræft heterogenicity, men også fremhæve, at Notch vej i CAF er et kritisk mål for melanom terapeutiske. Dette eksempel viser, at vores 3D sfærode model er meget nyttigt at studere mekanismerne for kræft celle-stromale fibroblast interaktioner og identificere potentielle terapeutiske mål. Et andet eksempel var at teste lægemiddelrespons af kræft stamceller / indlede celler i overværelse af CAF. Det er velkendt, at lægemiddelrespons af kræftceller, herunder kræft stamceller / indlede celler, varierer i nærvær og fravær af CAF. Tilstedeværelsen af CAF i dette in vitro-system gør denne model mere klinisk relevant og genererede testresultater mere pålidelige. Desuden er vores 3D-sfænode system alsidigt. Det kan bruges til forskellige formål. For eksempel, hvis resistente kræftceller er ansat i denne 3D-model, Det kan ændres til at løse resistens over for lægemidler og måske tumor recidiv. Det kan også ændres til at teste eller screene lægemidler, der primært målrette CAF for kræftbehandling. CAF er for nylig blevet lovende terapeutiske mål. Der er fordele ved at målrette CAF. For det første, sammenlignet med tumorceller, der er unormale (ofte med genetiske ændringer) og smart (let få resistens over for kemo- og strålebehandlinger), CAF i tumorvæv er normale celler og genetisk mere stabil, så de er mindre tilbøjelige til at udvikle resistens over for behandlingerne. For det andet, målretning CAF afhænger ikke af typen af onkogenmutationer i tumorcellerne. For det tredje, målretning CAF kan opnå flere hit effekter gennem fibroblaster-afhængige anti-tumor, anti-angiogenese, og / eller modulerende kræft immunrespons. Vores 3D sfænode model er et kraftfuldt værktøj til opdagelse af forskellige sæt af kræft terapeutiske strategier.
The authors have nothing to disclose.
Vi takker Dr. Omaida C. Velazquez (University of Miami) for nyttigt samarbejde, høring og diskussion; Dr. Jie Li (University of Miami) for at give MeWo celler; og Dr. Meenhard Herlyn (The Wistar Institute) for at give alle andre melanom celler. Vi takker også Dr. Marcia Boulina, direktør for Analytical Imaging Core Facility, University of Miami, for billeddannelse analyse. Zhao-Jun Liu blev støttet af tilskud fra Bankhead-Coley Cancer Research Program (Award# 09BN-11), Women’s Cancer Association (den 53rd årlige tilskud) og interne midler fra University of Miami.
0.25% Trypsin-EDTA | Corning | 25-253-CI | |
24-well plate | Corning | 351147 | Non-tissue culture treated plate, 24-well, flat bottom with low evaporation lid |
Alex Fluor 488 goat anti-mouse IgG | Life Technology | A21202 | |
CaCl2 1.5 M | Sigma-Aldrich | C5670-500G | |
Collagenase, Type 1A | Sigma-Aldrich | C-2674 | 500 mg, 1 mg/mL concentration in DMEM. |
DakoCytomation | Dako | x0909 | |
DAPI | |||
Dispase Grade II | Roche Diagnostics | 165859 | |
Dulbecco's Modified Eagle's Medium(DMEM) | Corning | 10-013-CV | |
Fetal Bovine Serum | VMR | 97068-085 | Premium Grade |
Fiji (ImageJ) | NIH | Free for downloading, no license needed. | |
IncuCyte Zoom 2016A | Essen Bioscience | ||
IncuCyte Zoom System | Essen Bioscience | ||
Insulin | Sigma-Aldrich | I1882 | |
L-15 Medium (Leibovitz) | Sigma-Aldrich | L1518 | |
Leica SP5 Inverted Confocal Microscope | Leica | ||
MCDB 153 Medium | Sigma-Aldrich | M7403-10X1L | |
Mouse anti α-SMA (smooth muscle actin), monoclone | Abcam | ab18640 | |
Olympus IX51 Inverted Fluorescence Microscope | Olympus | IX51 | |
Olymupus CellSens | Olympus | ||
PD0325901 | Selleckchem Chemicals | S1036 | |
Penicillin Streptomycin Solution | Corning | 30-002- CI | 100 X |
Sodium Bicarbonate 7.5% | Corning | 25-035-CI |