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Cancer Research

ट्यूमर-स्ट्रोमा इंटरैक्शन और ड्रग डिस्कवरी का अध्ययन करने के लिए एक उपन्यास स्ट्रोमल फाइब्रोब्लास्ट-मोडलेटेड 3डी ट्यूमर स्फेरॉइड मॉडल

Published: February 28, 2020 doi: 10.3791/60660
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 2, 1
1Department of Surgery, University of Miami School of Medicine, 2Analytical Imaging Core Facility, University of Miami School of Medicine

Summary

ट्यूमर कोशिकाओं और स्ट्रोमल फाइब्रोब्लास्ट की विषम ताक़त पर आधारित एक उपन्यास त्रि-आयामी स्फेरॉइड मॉडल स्थापित किया गया है। यहां, हम स्फेरॉइड के गठन की कल्पना करने के लिए ट्यूमर कोशिकाओं और स्ट्रोमल फाइब्रोब्लास्ट, टाइम-लैप्स इमेजिंग और कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी की सहसंस्कृति पेश करते हैं। यह त्रि-आयामी मॉडल ट्यूमर-स्ट्रोमा इंटरैक्शन का अध्ययन करने और कैंसर चिकित्सा विज्ञान का परीक्षण करने के लिए एक प्रासंगिक मंच प्रदान करता है।

Abstract

ट्यूमर-स्ट्रोमा इंटरैक्शन कैंसर की प्रगति में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं। त्रि-आयामी (3 डी) ट्यूमर स्फेरॉइड मॉडल कैंसर स्टेम/शुरू कोशिकाओं, प्रीक्लिनिकल कैंसर अनुसंधान और दवा स्क्रीनिंग के अध्ययन में विट्रो मॉडल में सबसे व्यापक रूप से उपयोग किए जाते हैं। 3 डी स्फेरॉइड मॉडल पारंपरिक ट्यूमर सेल संस्कृति से बेहतर हैं और वास्तविक ठोस ट्यूमर के कुछ महत्वपूर्ण पात्रों को पुन: पेश करते हैं। हालांकि, पारंपरिक 3 डी ट्यूमर स्फेरॉइड विशेष रूप से ट्यूमर कोशिकाओं से बने होते हैं। वे ट्यूमर स्ट्रोमल कोशिकाओं की भागीदारी की कमी है और अपर्याप्त बाह्युशिकी मैट्रिक्स (ईसीएम) बयान है, इस प्रकार केवल आंशिक रूप से ट्यूमर ऊतकों की वीवो स्थितियों में नकल उतार । हमने ट्यूमर कोशिकाओं और स्ट्रोमल फाइब्रोब्लास्ट से बना एक नया बहुकोशिकीय 3 डी स्फेरॉइड मॉडल स्थापित किया जो वीवो विषम ट्यूमर माइक्रोएनवायरमेंट और इसके मूल डेस्मोप्लासिया में बेहतर नकल करता है। स्फेरॉइड का गठन ट्यूमर स्ट्रोमल फाइब्रोब्लास्ट द्वारा सख्ती से विनियमित किया जाता है और स्ट्रोमल फाइब्रोब्लास्ट में कुछ महत्वपूर्ण इंट्रासेलर सिग्नलिंग मार्ग (जैसे, नॉच सिग्नलिंग) की गतिविधि से निर्धारित होता है। इस लेख में, हम ट्यूमर कोशिकाओं के सहसंस्कृति के लिए तकनीक-स्ट्रोमल फाइब्रोब्लास्ट, सेल-सेल इंटरैक्शन की कल्पना करने के लिए समय-चूक इमेजिंग, और स्फेरॉइड की 3 डी वास्तुशिल्प विशेषताओं को प्रदर्शित करने के लिए माइक्रोस्कोपी प्रस्तुत करते हैं। हम इस 3डी स्फेरॉइड मॉडल के व्यावहारिक अनुप्रयोग के दो उदाहरण भी दिखाते हैं। यह उपन्यास बहुकोशिकीय 3 डी स्फेरॉइड मॉडल ट्यूमर-स्ट्रोमा इंटरैक्शन का अध्ययन करने के लिए एक उपयोगी मंच प्रदान करता है, यह स्पष्ट करता है कि स्ट्रोमल फाइब्रोब्लास्ट कैंसर स्टेम/शुरू करने वाली कोशिकाओं को कैसे विनियमित करते हैं, जो ट्यूमर की प्रगति और आक्रामकता का निर्धारण करते हैं, और कैंसर की दवा संवेदनशीलता और प्रतिरोध में स्ट्रोमल प्रतिक्रिया की भागीदारी की खोज करते हैं । यह प्लेटफॉर्म ड्रग डिस्कवरी के लिए एक प्रासंगिक इन विट्रो मॉडल भी हो सकता है।

Introduction

ठोस ट्यूमर नियोप्लास्टिक कोशिकाओं और स्ट्रोमल कोशिकाओं की एक बड़ी विविधता1,2,3,4से बने जटिल ऊतकों का प्रतिनिधित्व करते हैं । स्ट्रोमल फाइब्रोब्लास्ट, या कैंसर से जुड़े फाइब्रोब्लास्ट (सीएएफ), अधिकांश प्रकार के ठोस ट्यूमर में प्रमुख स्ट्रोमल सेल आबादी में से एक हैं। वे ट्यूमर के विकास को विनियमित करने में गंभीर रूप से शामिल हैं, विकास कारकों के उत्पादन के माध्यम से स्टेमनेस, मेटास्टेसिस, एंजियोजेनेसिस और दवा प्रतिरोध, साइटोकिन्स/केमोकिन्स, ईसीएम और रीमॉडलिंग एंजाइमों का संश्लेषण (उदाहरण के लिए, कोलेजन, फाइब्रोनेक्टिन, और मैट्रिक्स मेटललोप्रोटेक्ट्स), एक्सोसोम की रिहाई,और प्रत्यक्ष हेट्रोटिपिक सेल-सेल इंटरैक्शन5,6,7,8,10, . सीएएफ प्राथमिक घाव में विषम ट्यूमर कोशिका आबादी से ट्यूमर क्लोन के सबसेट का पूर्वचयन करके कैंसर अंग-विशिष्ट मेटास्टेसिस का निर्धारण करने में भी भाग लेता है और इन चयनित क्लोन को एक विशिष्ट दूर के अंग को मेटास्टेसिस के लिए प्रिमेड करने के लिए बढ़ावा देता है जिसका सूक्ष्म वातावरण चयनित क्लोन12के पुनर्उपनिवेशीकरण के लिए इष्टतम है । इसके अलावा, फाइब्रोब्लास्ट और उनके स्रावित घुलनशील कारक और ईसीएम ट्यूमर एंजियोजेनेसिस13,14,एंटी-ट्यूमर प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया15के मॉड्यूलेशन में भाग लेते हैं, और यहां तक कि दवा प्रतिरोध और ट्यूमर पुनरावृत्ति16,17में भी शामिल हैं।

इन विट्रो 3डी ट्यूमर स्फेरॉइड मॉडल विकसित किए गए हैं और कैंसर अनुसंधान में इन विट्रो कैंसर कोशिका संस्कृतियों और वीवो ट्यूमर मॉडल18,19,20,21के बीच एक मध्यवर्ती मॉडल के रूप में उपयोग किया गया है । 3 डी ट्यूमर स्फेरॉइड मॉडल कैंसर स्टेम सेल अनुसंधान, पूर्व नैदानिक कैंसर अनुसंधान, और दवा स्क्रीनिंग में लोकप्रियता प्राप्त की है क्योंकि इन मॉडलों असली ट्यूमर है कि पारंपरिक 2 डी मोनोलेयर22में अनुपस्थित है की कुछ महत्वपूर्ण विशेषताओं पुन: पेश । कई मौजूदा 3 डी ट्यूमर स्फेरॉइड मॉडल पूरी तरह से ट्यूमर कोशिकाओं का गठन कर रहे हैं और ट्यूमर स्ट्रोमल कोशिकाओं की भागीदारी की कमी है। इसके परिणामस्वरूप अक्सर ट्यूमर स्फेरॉइड अपर्याप्त ईसीएम जमाव और विषम कोशिका-कोशिका इंटरैक्शन की अनुपस्थिति होती है। कैंसर कोशिकाओं और समरूप कोशिका-कोशिका आसंजन द्वारा विशेष रूप से गठित पारंपरिक 3 डी स्फेरॉइड केवल आंशिक रूप से ट्यूमर ऊतकों की वीवो स्थितियों में नकल कर सकते हैं। इनमें से कुछ सीमाओं को दूर करने के लिए जांचकर्ताओं ने 3डी कोकल्चर में कई प्रकार की स्ट्रोमल कोशिकाओं को शामिल करने का प्रस्ताव किया है और कई विषमप्रकार 3डी ट्यूमर स्फेरॉइड मॉडल23,24,25,26,27विकसित किए हैं । इसके अलावा, जांचकर्ताओं ने बहिर्जात 3डी मैट्रिस को नियोजित किया है, प्राकृतिक हाइड्रोगेल या सिंथेटिक पॉलिमर जैसे पॉलीथीन ग्लाइकोल, पॉली (लैक्टाइड-सह-ग्लाइकोलाइड), और पॉली (एन-आइसोप्रोपिलैरेलिमाइड) शामिल हैं, मोनोसेलुलर और बहुकोशिकीय स्फेरॉइड मॉडल का एम्बेड करने के लिए, एक सेल-सहायक वातावरण बनाना और सेल-मैट्रिक्स इंटरैक्शन28,29को पुन: उत्पन्न करना, जिससे ये सिस्टम अधिक जैविक रूप से प्रासंगिक30। हालांकि, 3 डी कोकल्चर ्स में कुछ प्रकार की स्ट्रोमल कोशिकाओं, जैसे एंडोथेलियल कोशिकाओं का समावेश एक इन विट्रो सिस्टम के लिए अतिरिक्त जटिलता लाता है और कैंसर सेल-फाइब्रोब्लास्ट इंटरैक्शन जैसे दो विशिष्ट प्रकार की कोशिकाओं के बीच विषम कोशिका-कोशिका बातचीत का अध्ययन करना मुश्किल बनाता है। इसके अलावा, वास्तविक ऊतकों में एंडोथेलियल कोशिकाएं हमेशा सीधे कैंसर कोशिकाओं और अन्य स्ट्रोमल कोशिकाओं के साथ बातचीत नहीं करती हैं क्योंकि केशिकाओं के बाहर लिपटे तहखाने झिल्ली की एक परत होती है जो एंडोथेलियल कोशिकाओं को सीधे कैंसर कोशिकाओं और अन्य स्ट्रोमल कोशिकाओं के साथ बातचीत करने से रोकती है। उन 3 डी स्फेरॉइड मॉडलमें, शामिल एंडोथेलियल कोशिकाएं वास्तव में रक्त वाहिकाओं का गठन नहीं करती हैं, फिर भी कैंसर कोशिकाओं और अन्य स्ट्रोमल कोशिकाओं के साथ सीधे बातचीत करती हैं, कुछ ऐसा जो शायद ही कभी वीवो में होता है। इसी तरह, 3 डी स्फेरॉइड मॉडलमें से कुछ में नियोजित एक्सोजेनस मैट्रिस संरचना और संरचना के मामले में वास्तविक ट्यूमर ऊतकों में ईसीएम के समान नहीं हैं। इन सभी कृत्रिम स्थितियों के परिणामस्वरूप भ्रामक डेटा हो सकता है।

हमने हाल ही में ट्यूमर कोशिकाओं और सीएएफ से बना एक नया बहुकोशिकीय 3डी स्फेरॉइड मॉडल बनाया है। हमारे मॉडल में, 3डी ट्यूमर स्फेरॉइड का गठन पूरी तरह से सीएएफ द्वारा निर्धारित किया जाता है। सीएएफ ट्यूमर स्टेम/शुरू कोशिकाओं के फेनोटाइप को प्रेरित और विनियमित करता है। सीएएफ द्वारा उत्पादित ईसीएम प्राकृतिक है और डेस्मोप्लास्टिक संरचना को वीवो ट्यूमर माइक्रोएनवायरमेंट में बेहतर नकल करने की अनुमति देता है। यह उपन्यास 3डी मॉडल कैंसर दवा स्क्रीनिंग के लिए एक उपयोगी उपकरण हो सकता है और ट्यूमर-स्ट्रोमा इंटरैक्शन का अध्ययन करने के लिए एक अनूठा मंच प्रदान करता है, यह स्पष्ट करता है कि सीएएफ कैंसर स्टेम/शुरू कोशिकाओं को कैसे विनियमित करता है, और कैंसर की दवा संवेदनशीलता और प्रतिरोध में स्ट्रोमल इंटरैक्शन की भागीदारी का पता लगाता है ।

Protocol

1. मेलानोमा कोशिकाओं और त्वचा फाइब्रोब्लास्ट की गणना

  1. मानव मेलानोमा कोशिकाओं की संसंस्कृति
    1. संस्कृति मानव मेलानोमा कोशिकाओं, C816131 पारंपरिक अनुयायी सेल संस्कृति की स्थिति के तहत पूर्ण W489 मध्यम में (चरण 1.2 देखें) में 5% सीओ2 के साथ आपूर्ति की गई एक 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में जैसा कि पहले32वर्णित था। कोशिकाओं को 1:5 अनुपात में विभाजित करें जब वे ~ 90% कन्फ्लोरेंसी तक पहुंचते हैं।
  2. मेलानोमा सेल संस्कृति माध्यम (W489)
    1. पूर्ण W489 मध्यम के लिए, 80% MCDB153 मध्यम, 20% एल-15 माध्यम (सामग्री की तालिकादेखें), 2% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS), 5 μg/mL इंसुलिन, 1.68 m M CaCl2,और 0.11% सोडियम बाइकार्बोनेट का उपयोग करें। सहसंस्कृति के लिए, एफबीएस, इंसुलिन और सीएसीएल2न जोड़ें।
  3. माउस त्वचा फाइब्रोब्लास्ट अलगाव
    1. संस्था की एनिमल केयर एंड यूज कमेटी (आईएसीयूसी) के प्रासंगिक दिशा-निर्देशों और विनियमों के अनुसार माउस से 1 सेमी x 1 सेमी त्वचा के टुकड़े को काटें।
    2. रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर dispase (सामग्री की तालिकादेखें) द्वारा त्वचा को पचाएं। एपिडर्मिस से डर्मिस को पट्टी करें और रात भर कमरे के तापमान (आरटी) पर कोलेजेनेज (डीएमईएम में 1 मिलीग्राम/mL) के साथ आगे पचाएं।
  4. माउस त्वचा फाइब्रोब्लास्ट पुलिया
    1. ऊतक छर्रों को पीबीएस से धोएं और उन्हें डीएमईएम में 10% एफबीएस और 37 डिग्री सेल्सियस/5% सीओ2में 1% पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन के साथ संस्कृति करें। कोशिकाओं को 1:2 अनुपात में विभाजित करें जब वे ~ 90% कन्फ्लोरेंसी तक पहुंचते हैं।
    2. सहसंस्कृति से पहले मानक तरीकों का उपयोग करके जीएफपी/लेंटिवायरस के साथ त्वचा फाइब्रोब्लास्ट को पार करें।
  5. इम्यूनोस्टेनिंग द्वारा माउस त्वचा फाइब्रोब्लास्ट का लक्षण वर्णन
    1. धुंधला करने के लिए सेल की तैयारी
      1. 2 x 104 कोशिकाओं/अच्छी तरह से एक घनत्व पर 24 अच्छी तरह से थाली में त्वचा फाइब्रोब्लास्ट बीज । दूसरे दिन, पीबीएस 2x के साथ कोशिकाओं को धोएं और उन्हें 10 00 के लिए 2% तटस्थ बफर फॉर्मेलिन में ठीक करें। फॉर्मेलिन को हटा दें और दो बार पीबीएस के साथ निश्चित कोशिकाओं को धोएं।
    2. इम्यूनोस्टेनिंग
      1. प्रत्येक अच्छी तरह से समाधान अवरुद्ध करने के 200 μL जोड़ें और आरटी में 30 min के लिए थाली इनक्यूबेट, तो माउस विरोधी α-SMA 1:200 पर पतला और 1 एच के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट जोड़ें पीबीएस 3x, 5 मिन प्रत्येक के साथ धोएं।
      2. 1:400 कमजोर पड़ने पर एलेक्स फ्लोर 488 बकरी विरोधी माउस आईजीजी जोड़ें और 1 घंटे के लिए आरटी पर इनक्यूबेट करें। पीबीएस, 5 मिन प्रत्येक के साथ एंटीबॉडी 3x को धो लें।
      3. 2 मिन के लिए आरटी पर 1 μg/mL DAPI और इनक्यूबेट जोड़ें । DAPI समाधान निकालें और प्रत्येक अच्छी तरह से PBS के ५०० μL जोड़ें ।
      4. कोशिकाओं का निरीक्षण करें और उल्टे फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप का उपयोग करके छवियां लें।
  6. प्रीलेबलिंग फाइब्रोब्लास्ट और मेलानोमा कोशिकाएं
    1. 1 दिन में 100 मिमी पकवान में बीज फाइब्रोब्लास्ट ताकि सेल कन्फ्रिलेशन अगले दिन ~ 60% तक पहुंच जाए। दूसरे दिन, संस्कृति माध्यम को हटा दें और पॉलीब्रेन के 4 μg/mL के साथ नियमित संस्कृति माध्यम में GFP/lentivirus (~ 1:3-1:5 स्टॉक से पतला) जोड़ें । 6 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में इनक्यूबेट कोशिकाएं, माध्यम को हटा दें और ताजा नियमित संस्कृति माध्यम से बदलें। 2 दिनों के बाद, फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप का उपयोग करके कोशिकाओं से जीएफपी सिग्नल का निरीक्षण करें। इसी तरह की परिस्थितियों में DsRed/lentivirus के साथ C8161 कोशिकाओं को ट्रांसड्यूस करें । जीएफपी/लेंटिवायरस और डीएसरेड/लेंटिवायरस तैयार करने के प्रोटोकॉल पहले14,34बताए गए हैं .

2. सेल सहसंस्कृति

  1. सी8161-फाइब्रोब्लास्ट सहसंस्कृति बीज।
    1. स्फेरॉइड गठन परख के 0 दिन, C8161 और त्वचा फाइब्रोब्लास्ट दोनों को 0.25% ट्राइप्सिन-ईडीटीए का उपयोग करके अलग करें। आरटी में 5 मिन के लिए 250 ग्राम पर कोशिकाओं को नीचे स्पिन करें और पीबीएस के साथ एक बार धोलें।
    2. सेल सहसंस्कृति माध्यम (सीरम मुक्त, इंसुलिन मुक्त, और कैल्शियम मुक्त W489 मध्यम सीरम मुक्त DMEM के साथ मिश्रित 1:1 अनुपात में) में कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें। सेल एकाग्रता को 2 x 104 कोशिकाओं/mL में समायोजित करें।
    3. C8161 कोशिकाओं को 1:1 अनुपात में फाइब्रोब्लास्ट के साथ मिलाएं और 24 अच्छी प्लेट के प्रत्येक कुएं में कोशिका मिश्रण का 2 मिलील जोड़ें। प्रत्येक कुएं में प्रत्येक प्रकार की कोशिकाओं का 2 x 104 होना चाहिए। प्रत्येक शर्त ट्रिपलेट में की जानी चाहिए।
      नोट: यह एक गैर ऊतक संस्कृति इलाज प्लेट का उपयोग करने के लिए महत्वपूर्ण है (सामग्री की तालिकादेखें) । अन्यथा, कोशिकाएं दृढ़ता से एक प्लेट से जुड़ जाएंगी और स्फेरॉइड को निलंबित करने में असमर्थ होंगी।
  2. 4 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट कोशिकाओं को तब तक इनक्यूबेट करें जब तक कि कोशिकाएं प्लेट से जुड़न न करें, और फिर प्रत्येक परख के लिए इंगित समय बिंदुओं पर समय-चूक इमेजिंग या कॉन्फोकल स्कैनिंग करें।

3. लाइव सेल समय-चूक इमेजिंग

  1. सहसंस्कृति से पहले, निर्माता के निर्देशों का पालन करते हुए समय-चूक इमेजिंग सिस्टम (सामग्री की तालिकादेखें) चालू करें और इनक्यूबेटर को 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2तक पहुंचने दें। यह आमतौर पर संतुलन तक पहुंचने के लिए प्रणाली के लिए 1 घंटे लेता है । ध्यान से इनक्यूबेटर के अंदर माइक्रोस्कोप के मंच पर संस्कृति प्लेट रखें और सुरक्षित रूप से दरवाजा बंद करें।
  2. समय-चूक इमेजिंग सिस्टम (सामग्री की तालिकादेखें) के सॉफ्टवेयर खोलें और प्लेट प्रकार और निर्माता चुनें ताकि माइक्रोस्कोप स्कैनिंग क्षेत्र का सही पता लगा सके। ब्याज के कुओं और एक 10x उद्देश्य लेंस चुनें। स्कैनिंग क्षेत्र के लिए सेटिंग्स चुनें, स्कैन के बीच अंतराल समय, और एक शुरुआत ी के साथ-साथ एक अंत समय भी। इस प्रोटोकॉल में, 1 अच्छी तरह से स्कैनिंग क्षेत्र के लिए अधिकतम प्रारूप संख्या 36 है और अंतराल का समय 1 घंटा है।
  3. 4-52 घंटे से रिकॉर्ड समय चूक इमेजिंग।
    नोट: शुरुआती समय, समाप्त समय और अवधि को सेल प्रकार और प्रयोग के उद्देश्य से अनुकूलित किया जाना चाहिए।
  4. इमेज रिकॉर्डिंग को पूरा करते समय, डेटा को पुनः प्राप्त करने और वीडियो या छवि सेट को पुनः प्राप्त करने के लिए समय-चूक इमेजिंग सिस्टम सॉफ्टवेयर का उपयोग करें।

4. कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी और 3डी मूवीज

  1. सेल कोकल्चर प्लेट को एक उल्टे फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप (सामग्री की तालिकादेखें) के चरण पर रखें और लाल और हरे रंग के लेजर बीम का उपयोग करें। 5x या 10x ऑब्जेक्टिव लेंस के नीचे कोशिकाओं का निरीक्षण करें और स्कैनिंग शुरू करने के लिए एक स्फेरॉइड चुनें।
  2. स्फेरॉइड के नीचे से ऊपर तक स्कैन करने के लिए 1 माइक्रोन जेड-स्टेप का उपयोग करें। 3डी इमेज को पुनर्निर्माण के लिए इमेज प्रोसेसिंग सॉफ्टवेयर (टेबल ऑफ मैटेरियल्स)का उपयोग करके डेटा प्रोसेस करें जिसे 3डी फिल्म के रूप में आगे घुमाया और सहेजा जा सकता है।

5. मेलानोमा कोशिकाओं की एकल संस्कृति और 2डी क्लस्टर/एग्रीगेटका गठन

  1. बीज 2 x 104 C8161 मेलानोमा कोशिकाओं को 24 अच्छी तरह से प्लेट के प्रत्येक कुएं में वर्णित है जैसा कि धारा 2.1 में वर्णित है। 7-10 दिनों के लिए कोशिकाओं को संस्कृति और उन्हें एक उल्टे फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप का उपयोग कर तस्वीर।

6. जांच अगर 3 डी स्फेरॉइड और 2 डी सेल क्लस्टर/कुल्थ मध्यम में निलंबित कर रहे है या प्लेटों से जुड़े

  1. सेल सहसंस्कृति के लिए, 7 दिन पर गठित 3डी स्फेरॉइड की जांच करें। एकल सेल संस्कृति के लिए, 10 दिन पर गठित 2डी समूहों/समुचित की जांच करें ।
  2. एक उल्टे फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप के मंच पर सेल संस्कृति प्लेटें सेट करें। एक सिरिंज के साथ एक तुला सुई को कुएं में संस्कृति माध्यम को परेशान करने के लिए और बाहर संस्कृति माध्यम को धीरे से एस्पिरेट करें। फिल्म सॉफ्टवेयर के मूवी मोड का उपयोग करके इस प्रक्रिया को रिकॉर्ड करें (सामग्री की तालिकादेखें)। 3डी स्फेरॉइड मोबाइल होंगे, लेकिन 2डी सेल क्लस्टर/एग्रीगेट दृढ़ रहेंगे ।

7. 3डी स्फेरॉइड की कॉन्फोकल इमेज

नोट: कोकल्चर्ड कोशिकाएं उपयोग किए गए फाइब्रोब्लास्ट के प्रकार के आधार पर 48-72 घंटे से स्फेरॉइड बनाना शुरू कर देते हैं। आम तौर पर, स्फेरॉइड समय के साथ धीरे-धीरे बड़ा होते हैं। छोटे स्फेरॉइड 7 दिन तक बड़े स्फेरॉइड बनाने के लिए फ्यूज कर सकते हैं। स्फेरॉइड आकार में स्थिर होने के बाद, वे 10 दिनों से अधिक समय तक चल सकते हैं। उसके बाद, स्फेरॉइड अक्सर संस्कृति प्लेट के नीचे से अलग होते हैं और कुओं के केंद्र में एकत्र होते हैं। स्फेरॉइड के बढ़ने के दौरान, केंद्र में कोशिकाएं आमतौर पर अपर्याप्त पोषण और/या विषाक्त माइक्रोएनवायरमेंट के कारण मर जाती हैं । इसलिए, परिपक्व स्फेरॉइड की छवि के लिए 3डी स्फेरॉइड गठन और समय के शिखर को पायलट प्रयोगों का उपयोग करके अनुकूलित किया जाना चाहिए। इस प्रोटोकॉल के लिए, कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी 7 दिन के आसपास प्रदर्शन किया गया था जब स्फेरॉइड परिपक्व थे और स्फेरॉइड के केंद्र में कोशिकाएं अभी भी केंद्र में कोशिकाओं की फ्लोरेसेंस और आकृति विज्ञान के अनुसार जीवित थीं।

  1. कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी करने के लिए, स्फेरॉइड को स्कैन करने के लिए हरे और लाल लेजर का उपयोग करें। एक 10x उद्देश्य के तहत स्कैनिंग क्षेत्र निर्धारित करें और 1 μm z-कदम के साथ स्फेरॉइड के नीचे से ऊपर तक जाएं।
  2. इमेज प्रोसेसिंग सॉफ्टवेयर (जैसे, इमेजजे) के 3डी-प्रोजेक्शन फ़ंक्शन का उपयोग करके 3डी स्फेरॉइड फॉर्मेशन और रोटेशन वीडियो जेनरेट करें।

8. कैंसर स्टेम/शुरू कोशिकाओं के स्ट्रोमल विनियमन का निर्धारण करने में इंट्रासेल्युलर Notch1 सिग्नलिंग पाथवे गतिविधि

  1. लाभ और हानि के समारोह Notch1 चूहों से त्वचा फाइब्रोब्लास्ट के अलगाव और लक्षण वर्णन
    1. आनुवंशिक रूप से संशोधित चूहों के दो जोड़े से त्वचा फाइब्रोब्लास्ट को अलग करें: लाभ-ऑफ-फंक्शन नॉच1 (GOFNotch1: Fsp1.Cre+/-; रोजाLSL-N1IC +/+चूहों बनाम उनके समकक्ष नियंत्रण (GOFctrl: FSP1 । क्रे-/- रोजाLSL-N1IC+/+चूहों और नुकसान के समारोह Notch1 (LOFNotch1: Fsp1.Cre+/-; Notch1LoxP/LoxP+/+) चूहों बनाम उनके समकक्ष नियंत्रण (LOFctrl: FSP1 । क्रे-/- Notch1LoxP/LoxP+/+) चूहों31,क्रमशः । धारा 1.3-1.5 में वर्णित प्रोटोकॉल का उपयोग करके त्वचा फाइब्रोब्लास्ट को अलग और चित्रित करें।
  2. माउस स्किन फाइब्रोब्लास्ट को जीएफपी/लेंटिवायरस के साथ ट्रांसड्यूस करें ।
    1. लेंटिवायरल वेक्टर के साथ कोशिकाओं को स्थानांतरित करने की विधि के लिए धारा 1 देखें।
  3. फाइब्रोब्लास्ट और मेलानोमा कोशिकाओं का सहसंस्कृति
    1. धारा 2 में वर्णित सेल सहसंस्कृति प्रयोग का संचालन करें।
  4. 3 डी स्फेरॉइड के आकार को मापकर कैंसर स्टेम/शुरू कोशिकाओं के स्ट्रोमल नियमन का निर्धारण करने पर फाइब्रोब्लास्ट में इंट्रासेल्युलर नॉच 1 पाथवे गतिविधि के प्रभाव का आकलन करना
    1. उस समय स्फेरॉइड की फोटो खींचकर प्रत्येक स्थिति के तहत स्फेरॉइड गठन की मात्रा को पूरा करें जब स्फेरॉइड परिपक्व होते हैं (फाइब्रोब्लास्ट के प्रकारों के आधार पर 5-7 दिन के आसपास विकास के रुकने से इंगित किया जाता है)। इमेज प्रोसेसिंग सॉफ्टवेयर का उपयोग करके 3डी स्फेरॉइड के आकार को मापें।

9. 3 डी स्फेरॉइड परख का उपयोग कर कैंसर स्टेम/शुरू कोशिकाओं की दवा प्रतिक्रिया का परीक्षण

नोट: सीएएफ कैंसर विषमता को विनियमित कर सकते हैं और कैंसर स्टेम/शुरू कोशिकाओं के फेनोटाइप को प्रेरित कर सकते हैं । सीएएफ भी कैंसर स्टेम का समर्थन/नैदानिक उपचार सहना कोशिकाओं की शुरुआत । कैंसर स्टेम सेल को ड्रग रेजिस्टेंस के लिए जिम्मेदार दिखाया गया है। इसलिए, हमने कैंसर स्टेम/शुरू करने वाली कोशिकाओं की दवा प्रतिक्रिया का मूल्यांकन करने के लिए इस 3डी स्फेरॉइड मॉडल का उपयोग किया। परिणाम कैंसर विरोधी दवा की संभावित नैदानिक प्रभावकारिता का अच्छी तरह से आकलन कर सकते हैं ।

  1. औषधि प्रशासन
    1. 24 अच्छी प्लेट में कोशिकाओं को coculturing के बाद, संस्कृति माध्यम में एक धारावाहिक कमजोर पड़ने में दवाओं को तैयार करने के लिए पायलट प्रयोगों के आधार पर सांद्रता की एक वांछित रेंज के 5x तक पहुंचने (यानी, 1 एनएम, २.५ एनएम, 5 एनएम, 10 एनएम, और 25 एनएम) ।
      कोकल्चर्ड कोशिकाओं के प्रत्येक कुएं में संबंधित दवा समाधानों का 0.5 मिलील जोड़ें। नियंत्रण समूह को नियमित सहसंस्कृति मीडिया के साथ इलाज करें जैसा कि ऊपर उल्लेख किया गया है।
    2. नोट: MEK अवरोधक सेल संस्कृति मीडिया में घुलनशील है । इसलिए, खाली नियंत्रण सेल संस्कृति माध्यम के 2.5 मिलील हैं। हालांकि, यदि दवा जलीय समाधान में घुलनशील नहीं है और DMSO जैसे सॉल्वैंट्स की आवश्यकता होती है, तो डीएमएसओ की एक ही एकाग्रता के साथ सेल संस्कृति मीडिया को नियंत्रण समूह पर लागू किया जाना चाहिए।
  2. स्फेरॉइड की गिनती करके दवा प्रतिक्रिया का परिमाणीकरण
    1. एक फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप का उपयोग कर इलाज कोशिकाओं और अनुपचारित कोशिकाओं का निरीक्षण करें और हर दिन कोशिकाओं की तस्वीर। विभिन्न प्रयोगात्मक समूहों में स्फेरॉइड गठन की मात्रा निर्धारित करें और विभिन्न दवा सांद्रता के तहत कोशिका संस्कृतियों की स्फेरॉइड बनाने की क्षमता की तुलना करें।
      नोट: स्फेरॉइड सहसंस्कृति के बाद ~ 5−7 दिन दिखाई देते हैं। दवा प्रभाव उस समय बिंदु पर ध्यान देने योग्य हो जाएगा।
    2. कुओं में स्फेरॉइड और कोशिकाओं की छवि/फोटोग्राफ के लिए फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप का उपयोग करें और फिर समय के साथ प्रत्येक उपचार समूह में स्फेरॉइड के औसत आकार और प्रति निम्न बिजली क्षेत्र (एलपीएफ एक्स 4) बनने वाले स्फेरॉइड की संख्या की गणना करने के लिए छवि सॉफ्टवेयर का उपयोग करें ।
      नोट: प्रभावी दवा उपचार प्राप्त करने वाली कोशिकाओं को नियंत्रण समूह की तुलना में कम या कोई स्फेरॉइड नहीं होना चाहिए। यह कैंसर स्टेम कोशिकाओं को दबाने पर परीक्षण दवा की प्रभावशीलता का एक संकेत है ।

Representative Results

हमने एक इन विट्रो हेटेरोटिपिक सेल कोकल्चर सिस्टम के साथ 3डी स्फेरॉइड उत्पन्न करने के लिए एक उपन्यास विधि विकसित की है जो वीवो ट्यूमर माइक्रोएनवायरमेंट में नकल करती है। फाइब्रोब्लास्ट माउस स्किन फाइब्रोब्लास्ट से प्राप्त होते हैं। त्वचा फाइब्रोब्लास्ट ऊपर वर्णित के रूप में उत्पन्न किए गए थे और α-SMA+/Vimentin+/FSP-1+ कोशिकाओं के रूप में विशेषता थी । मानव मेटास्टैटिक मेलानोमा कोशिकाओं (C8161) W489 मध्यम में सुसंस्कृत के रूप मेंवर्णित ३२थे । ट्यूमर कोशिकाओं से फाइब्रोब्लास्ट की कल्पना और भेद करने के लिए, सेल कोकल्चर से पहले क्रमशः३४,३६जीएफपी/लेंटिवायरस और डीरेड/लेंटिवायरस के साथ फाइब्रोब्लास्ट और मेलानोमा कोशिकाओं को प्रीट्रांसड्यूकिया गया था ।

चित्रा 1 मेलानोमा कोशिकाओं और फाइब्रोब्लास्ट को कोक्यूल्चरिंग द्वारा गठित बहुकोशिकीय 3 डी स्फेरॉइड का एक उदाहरण दिखाता है। फाइब्रोब्लास्ट की अनुपस्थिति में सुसंस्कृत मेलानोमा कोशिकाओं ने विशिष्ट 3 डी स्फेरॉइड नहीं बनाए, हालांकि कुछ मेलानोमा कोशिकाएं विस्तारित संस्कृति के साथ 2डी क्लस्टर/एग्रीगेट बनाती हैं। स्फेरॉइड का औसत आकार लगभग 170-360 माइक्रोन व्यास (मतलब = 275, एसडी = 37) दिन में ~ 5−7 था। समय-चूक इमेजिंग का उपयोग करते हुए, हमने देखा कि फाइब्रोब्लास्ट और ट्यूमर कोशिकाओं ने सहसंस्कृति में बातचीत की और वीडियो 1में दिखाए गए लगभग 36 एच के सहसंस्कृति में 3 डी स्फेरॉइड बनाना शुरू कर दिया। टाइम-लैप्स इमेजिंग ने सेल-सेल इंटरैक्शन की गतिशील प्रक्रिया और कोकल्चर के ~ 4-52 एच में स्फेरॉइड गठन के प्रारंभिक चरण को दर्ज किया। 3 डी स्फेरॉइड गठन की चोटी दिन ~5−7 के आसपास हुई। गठित 3 डी स्फेरॉइड फाइब्रोब्लास्ट और मेलानोमा कोशिकाओं से बने थे, जहां बहुमत (~ 80%) ट्यूमर कोशिकाओं थे। वीडियो 2 एकल संस्कृति में ~ 4-52 घंटे से शुरू सेल क्लस्टर/समुचित के गठन में एकल सुसंस्कृत मेलानोमा कोशिकाओं (DsRed +/C8161) की गतिशील प्रक्रिया को दर्शाता है । 2डी क्लस्टर/कुल्एशन का गठन दिन ~7-10 के आसपास नुकीला । वीडियो 3 और वीडियो 4 क्रमशः कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी द्वारा कल्पना किए गए 3डी स्फेरॉइड और 2डी ट्यूमर सेल क्लस्टर की संरचनाओं को दिखाते हैं। सेल कोकल्चर के 7 दिन कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी द्वारा 3डी स्फेरॉइड और 2डी ट्यूमर सेल क्लस्टर्स की जांच की गई । वीडियो 5 से पता चलता है कि 3डी स्फेरॉइड को कल्चर मीडियम और मोबाइल में सस्पेंड कर दिया गया था, जबकि वीडियो 6 से पता चलता है कि 2डी ट्यूमर सेल क्लस्टर कल्चर प्लेट और स्थिर से जुड़ा हुआ था । मीडियम में सस्पेंशन 3डी स्फेरॉइड की एक विशेषता है जो उन्हें 2डी क्लस्टर से अलग करती है। जब सेल कल्चर डिश या अच्छी तरह से माध्यम या तो छोड़ने या धीरे संस्कृति माध्यम पाइपिंग से परेशान है, निलंबित 3 डी स्फेरॉइड कदम है, जबकि 2 डी सेल समूहों स्थिर हैं । केवल कुछ एकल मृत कोशिकाएं मोबाइल हैं।

चित्रा 2ए ट्यूमर-स्ट्रोमा इंटरैक्शन का अध्ययन करने के लिए एक अद्वितीय मंच के रूप में सेवारत इस 3डी मॉडल का एक उदाहरण दिखाता है और यह स्पष्ट करने के लिए कि सीएएफ में इंट्रासेल्युलर नॉच1 सिग्नलिंग पाथवे गतिविधि कैंसर स्टेम/शुरू करने वाली कोशिकाओं और स्फेरॉइड गठन को कैसे नियंत्रित करती है। फाइब्रोब्लास्ट (एफबी) के दो जोड़े लाभ की त्वचा से अलग-थलग-समारोह Notch1 (GOFNotch1: Fsp1.Cre+/-; रोजाLSL-N1IC +/+चूहों बनाम उनके समकक्ष नियंत्रण (GOFctrl: FSP1 । क्रे-/- रोजाLSL-N1IC+/+चूहों और नुकसान के समारोह Notch1 (LOFNotch1: Fsp1.Cre+/-; Notch1LoxP/LoxP+/+) चूहों बनाम उनके समकक्ष नियंत्रण (LOFctrl: FSP1 । क्रे-/- Notch1LoxP/LoxP+/+) चूहों३५,क्रमशः । सभी फाइब्रोब्लास्ट को जीएफपी/लेंटिवायरस द्वारा ट्रांसड्यू किया गया था और C8161 मेलानोमा कोशिकाओं के साथ कोकल्चर किया गया था जो DsRed/lentivirus के साथ परिट्रांसड्यूकिया गया था । टाइम-लैप्स इमेजिंग से पता चलता है कि एफबी-जीओएफनॉच1 ने सेल कोकल्चर के पहले ~ 4-52 एच के दौरान एफबी-जीओएफसीटीआरएल की तुलना में 3डी स्फेरॉइड बनाने से C8161 मेलानोमा कोशिकाओं को रोक दिया। इसके विपरीत, एफबी-एलओएफनॉच 1 ने एफबी-एलओएफसीटीआरएलकी तुलना में C8161 मेलानोमा कोशिकाओं द्वारा 3डी स्फेरॉइड के गठन को बढ़ावा दिया। चित्रा 2बी,शीर्ष, विभिन्न पायदान मार्ग गतिविधियों को अंजाम देने वाले विभिन्न फाइब्रोब्लास्ट के साथ सेल कोकल्चर के 7 दिन में गठित 3डी स्फेरॉइड की प्रतिनिधि छवियों को दिखाता है। चित्रा 2बी,नीचे, विभिन्न पायदान मार्ग गतिविधियों को ले जाने वाले विभिन्न फाइब्रोब्लास्ट के साथ सेल कोकल्चर के 7 दिन पर गठित 3डी स्फेरॉइड के औसत आकार पर मात्रात्मक डेटा दिखाता है।

चित्रा 3 कैंसर स्टेम/शुरू कोशिकाओं की दवा प्रतिक्रिया का परीक्षण करने के लिए इस्तेमाल किया जा रहा इस 3 डी मॉडल का एक उदाहरण दिखाता है । कैंसर स्टेम/शुरू करने वाली कोशिकाओं को ड्रग रेजिस्टेंस और कैंसर ऑड-ईवन के लिए जिम्मेदार दिखाया गया है । इसलिए, इस 3 डी मॉडल का उपयोग करदवा प्रतिक्रिया का मूल्यांकन बेहतर कैंसर के इलाज के लिए एक संभावित दवा की नैदानिक प्रभावकारिता प्रकट कर सकते हैं । C8161 मेलानोमा कोशिकाएं सेल विकास और आक्रमण के लिए सक्रिय MAPK सिग्नलिंग पर भरोसा करती हैं। वे सीडीके4/किट के उच्च स्तर को भी व्यक्त करते हैं, लेकिन BRAF उत्परिवर्तन नहीं ले जाते हैं । इस 3 डी मॉडल का उपयोग करके MAPK अवरोधक की ओर कैंसर स्टेम/शुरू कोशिकाओं की दवा प्रतिक्रिया का परीक्षण करने के लिए, हमने 24 अच्छी प्लेटों में C8161 मेलानोमा कोशिकाओं और फाइब्रोब्लास्ट को cocultured । PD0325901 (सामग्री की तालिकादेखें), एक MAPK अवरोधक, 1 एनएम, 2.5 एनएम, 5 एनएम, 10 एनएम, और 25 एनएम से सांद्रता की एक श्रृंखला में एक धारावाहिक कमजोर पड़ने में तैयार किया गया था। सेल मिश्रण चढ़ाया गया था जब उसे सेल कोकल्चर ्स में जोड़ा गया था। अनुपचारित सहसंस्कारी कोशिकाओं को नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया गया । हमने विभिन्न दवा सांद्रता के तहत सेल कोकल्चर की स्फेरॉइड-फॉर्मिंग क्षमता का मूल्यांकन किया और इसकी तुलना अनुपचारित नियंत्रण से की। चित्रा 3ए विभिन्न दवा सांद्रता के तहत सेल सहसंस्कृति के दिन 5 पर गठित 3डी स्फेरॉइड की प्रतिनिधि छवियों को दिखाता है। चित्रा 3बी विभिन्न दवा सांद्रता के तहत सेल सहसंस्कृति के दिन 5 पर प्रति लो पावर फील्ड (एलपीएफ एक्स 4) बनने वाले 3डी स्फेरॉइड की संख्या प्रति स्फेरॉइड के औसत आकार का मात्रात्मक डेटा है।

Figure 1
चित्रा 1: 3डी स्फेरॉइड और 2डी क्लस्टर का गठन। (A)मानव C8161 मेलानोमा कोशिकाओं और माउस त्वचा फाइब्रोब्लास्ट के सहसंस्कृति द्वारा गठित 3 डी स्फेरॉइड की प्रतिनिधि छवि। 3 डी स्फेरॉइड मेलानोमा कोशिकाओं और फाइब्रोब्लास्ट के सहसंस्कृति के 7 दिन पर फोटो खिंचवाने थे । स्फेरॉइड के औसत आकार ~ 170-360 माइक्रोन व्यास (मतलब = 275, एसडी = 37) दिन में ~ 5−7 थे। स्फेरॉइड की औसत संख्या 18-26 (20.5 ± 3.6) प्रति कम बिजली क्षेत्र (एलपीएफ x4) थी। (ख)C8161 मेलानोमा कोशिकाओं की एकल संस्कृति द्वारा गठित 2डी ट्यूमर सेल समूहों की प्रतिनिधि छवि। मेलानोमा कोशिकाओं की एकल संस्कृति के 7 दिन 2डी मेलानोमा सेल क्लस्टर ों की फोटो खींची गई । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: 3 डी स्फेरॉइड मॉडल का उपयोग करके कैंसर स्टेम/शुरू करने वाली कोशिकाओं को विनियमित करने में सीएएफ में इंट्रासेलर नॉच 1 सिग्नलिंग पाथवे गतिविधि की भूमिका का व्याख्या करना। (A)सीएएफ में इंट्रासेलर नॉच1 सिग्नलिंग पाथवे गतिविधि ने सेल कोकल्चर में मेलानोमा कोशिकाओं द्वारा स्फेरॉइड के गठन का निर्धारण किया। समय-चूक वीडियो से पता चलता है कि एफबी-गोफनॉच 1 ने C8161 मेलानोमा कोशिकाओं द्वारा 3 डी स्फेरॉइड के गठन को रोक दिया, जबकि एफबी-एलओएफनॉच1 ने सेल कोकल्चर के पहले 4-52 घंटे के दौरान C8161 मेलानोमा कोशिकाओं द्वारा अधिक 3 डी स्फेरॉइड के गठन को बढ़ावा दिया। (ख)शीर्ष: विभिन्न पायदान मार्ग कार्यों को ले जाने वाले विभिन्न फाइब्रोब्लास्ट के साथ सेल कोकल्चर के 7 दिन में गठित 3डी स्फेरॉइड की प्रतिनिधि छवियां। नीचे: विभिन्न पायदान मार्ग गतिविधियों को ले जाने वाले विभिन्न फाइब्रोब्लास्ट के साथ सेल कोकल्चर के 7 दिन में गठित 3डी स्फेरॉइड के औसत आकार (व्यास [μm]/स्फेरॉइड) का मात्रात्मक डेटा । दो पूंछ वाले छात्र का टी-टेस्ट सांख्यिकीय विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया गया था । डेटा मतलब ± मानक विचलन (एसडी) के रूप में व्यक्त कर रहे हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3: 3 डी स्फेरॉइड मॉडल का उपयोग करके कैंसर स्टेम/शुरू कोशिकाओं की दवा प्रतिक्रिया का आकलन । (A)विभिन्न दवा सांद्रता के तहत सेल सहसंस्कृति के दिन 5 पर गठित 3डी स्फेरॉइड की प्रतिनिधि छवियां। (ख)औसत आकार (व्यास [μm]/स्फेरॉइड) का मात्रात्मक डेटा और विभिन्न दवा सांद्रता के तहत सेल सहसंस्कृति के दिन 5 पर गठित औसत आकार (व्यास [μm]/स्फेरॉइड) का मात्रात्मक डेटा और 3डी स्फेरॉइड प्रति लो पावर फील्ड (एलपीएफ एक्स 4) की संख्या । मात्रात्मक डेटा मतलब ± मानक विचलन (एसडी) के रूप में व्यक्त किए जाते हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Screenshot 1
वीडियो 1: सेल सहसंस्कृति के प्रारंभिक चरण में 3 डी स्फेरॉइड के गठन की गतिशील प्रक्रिया। टाइम-लैप्स इमेजिंग सेल कोकल्चर के पहले ~ 4-52 एच के दौरान 3डी स्फेरॉइड के गठन और सहसंस्कृति में फाइब्रोब्लास्ट और ट्यूमर कोशिकाओं के बीच गतिशील सेल-सेल इंटरैक्शन दिखाती है। कोशिकाओं को सहसंस्कृति की शुरुआत के बाद ४८ घंटे के आसपास 3 डी स्फेरॉइड बनाने के लिए शुरू कर दिया । 3 डी स्फेरॉइड गठन की चोटी दिन ~ 5−7 (यहां प्रदर्शित नहीं) पर हुई। 3 डी स्फेरॉइड फाइब्रोब्लास्ट और मेलानोमा कोशिकाओं से बने थे, जहां बहुमत (~ 80%) ट्यूमर कोशिकाओं थे। कृपया इस वीडियो को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

Screenshot 2
वीडियो 2: सेल सहसंस्कृति के प्रारंभिक चरण में 2डी क्लस्टर के गठन की गतिशील प्रक्रिया। टाइम-लैप्स इमेजिंग एकल संस्कृति में C8161melanoma कोशिकाओं द्वारा गठित 2डी समूहों की गतिशील प्रक्रिया को दर्शाती है। 2डी क्लस्टर का गठन ~ 7-10 दिन के आसपास हुआ। समय-चूक इमेजिंग DsRed+/C8161 मेलानोमा कोशिकाओं की एकल संस्कृति में ~ 4-52 घंटे की अवधि रिकॉर्ड करता है। कृपया इस वीडियो को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

Screenshot 3
वीडियो 3: कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी द्वारा कल्पना के रूप में 3 डी स्फेरॉइड की वास्तुकला और रोटेशन। वास्तुकला और एक 3 डी स्फेरॉइड का रोटेशन। सेल कोकल्चर में 7 दिन में बनने वाले स्फेरॉइड को स्कैन करने के लिए हरे और लाल लेजर का इस्तेमाल किया गया था। स्कैन क्षेत्र एक 10x उद्देश्य के तहत निर्धारित किया गया था । स्कैन नीचे से 1 μm z-step पर स्फेरॉइड के ऊपर तक शुरू होता है। फिजी सॉफ्टवेयर का उपयोग करके 3डी स्फेरॉइड रोटेशन फिल्म बनाई गई थी। कृपया इस वीडियो को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

Screenshot 4
वीडियो 4: आर्किटेक्चर और रोटेशन एक 2D ट्यूमर सेल क्लस्टर जैसा कि कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी द्वारा कल्पना की गई है। वास्तुकला और एक 2D क्लस्टर का रोटेशन। मेलानोमा सेल एकल संस्कृति के 7 दिन पर सेल समूहों की कॉन्फोकल छवियां ली गई थीं। स्कैन क्षेत्र एक 10x उद्देश्य के तहत निर्धारित किया गया था । स्कैन नीचे से 1 μm z-step पर स्फेरॉइड के ऊपर तक शुरू होता है। फिजी सॉफ्टवेयर का उपयोग करके 2डी क्लस्टर रोटेशन मूवी बनाई गई थी। कृपया इस वीडियो को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

Screenshot 5
वीडियो 5: 3डी स्फेरॉइड का मूवमेंट। 3डी स्फेरॉइड को संस्कृति माध्यम में निलंबित कर दिया गया था और उन्होंने संस्कृति पकवान/अच्छी तरह से पालन नहीं किया था । जब सेल संस्कृति में अभी भी मध्यम अच्छी तरह से कोमल पाइपिंग से परेशान था, निलंबित 3 डी स्फेरॉइड चले गए। कृपया इस वीडियो को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

Screenshot 6
वीडियो 6: 2D ट्यूमर सेल समूहों की स्थिरता। संस्कृति माध्यम में गड़बड़ी के बावजूद 2डी ट्यूमर सेल क्लस्टर कल्चर प्लेट और स्थिर में लंगर डाला गया। कुछ सिंगल डेड सेल्स मोबाइल थे । कृपया इस वीडियो को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

Discussion

इन विट्रो 3 डी सेल संस्कृति तकनीकों को कैंसर अनुसंधान में दशकों से व्यापक रूप से नियोजित किया गया है। पारंपरिक 2डी सेल संस्कृति प्रणालियों की तुलना में, 3डी माइक्रोएनवायरमेंट सेल-सेल और/या सेल-मैट्रिक्स इंटरैक्शन को फिर से तैयार करता है और ट्यूमर ऊतकों में देखी गई वास्तविक स्थितियों की नकल करने में सक्षम बनाता है । हालांकि, केवल कैंसर कोशिकाओं और समरूप कोशिका-कोशिका इंटरैक्शन द्वारा गठित 3 डी प्रणाली विषमतापूर्ण क्रॉस टॉक के महत्व को ध्यान में नहीं रखती है और अनुसंधान में गलत परिणाम प्रदान कर सकती है। हमने हाल ही में वीवो विषम ट्यूमर माइक्रोएनवायरमेंट और इसके देशी और कठोर डेस्मोप्लास्टिक प्रतिक्रिया में बेहतर नकल करने के लिए कैंसर कोशिकाओं और सीएएफ के संयोजन से एक उपन्यास 3 डी प्रणाली विकसित की है।

फाइब्रोब्लास्ट ट्यूमर स्ट्रोमा के प्रमुख घटक हैं। सीएएफ घुलनशील कारकों, ईसीएम/रीमॉडलिंग एंजाइमों10,11,और exosomes प्राप्त करके ट्यूमर प्रगति को विनियमित करने में शामिल हैं । इसके अतिरिक्त, सीएएफ दवा प्रतिरोध और ट्यूमर पुनरावृत्ति16,17में एक हिस्सा खेलते हैं । हमारे बहुकोशिकीय 3 डी स्फेरॉइड प्रणाली का उपयोग ट्यूमर-स्ट्रोमल इंटरैक्शन के आणविक तंत्र का पता लगाने और दवा प्रतिरोध और ट्यूमर पुनरावृत्ति को संबोधित करने के लिए किया जा सकता है। सीएएफ मुख्य रूप से सक्रिय स्थानीय शांत फाइब्रोब्लास्ट से प्राप्त होते हैं और बोन मैरो एमएससी को परिचालित करते हैं, जो ट्यूमर ऊतक37,38,39में सीएएफ में सीटू भेदभाव में गुजरते हैं। वर्तमान अध्ययन में, हमने एक बहुकोशिकीय 3 डी स्फेरॉइड मॉडल बनाने के लिए त्वचा फाइब्रोब्लास्ट का उपयोग किया। हालांकि, अन्य प्रकार के फाइब्रोब्लास्ट (उदाहरण के लिए, एमएससी-डीएफ), ट्यूमर सेल 3डी स्फेरॉइड फॉर्मेशन34को विनियमित करने के लिए त्वचा फाइब्रोब्लास्ट के समान तरीके से भी काम करते हैं। एमएससी-डीएफ को रिनबोन मैरो एमएससी से जेनरेट किया जा सकता है, जो हर 3 दिन में आवधिक मध्यम परिवर्तनों के साथ लगभग 10 दिनों तक एमएससी सेल कल्चर मीडियम में बोन मैरो मोनोन्यूक्लियर कोशिकाओं की खेती करके समृद्ध होता है । इन एमएससी को CD73+/CD105+/Lin-केरूप में विशेषता है । एमएससी को फाइब्रोब्लास्ट में अंतर करने के लिए, एमएससी को बाद में अतिरिक्त 2 सप्ताह के लिए पूर्ण डीएमईएम के साथ सुसंस्कृत किया जाता है। एमएससी-डीएफ को α-SMA+/Vimentin+/FSP-1+ कोशिकाओं३६के रूप में विशेषता है । एमएससी-डीएफ महत्वपूर्ण ट्यूमर नियामक हो सकते हैं। क्योंकि ठोस ट्यूमर के कई प्रकार में सीएएफ का एक अंश अस्थि मज्जा३६से जारी एमएससी भर्ती से अलग कर रहे हैं, एमएससी-डीएफ उपचार लक्ष्य का वादा किया जा सकता है । वे ट्यूमर ऊतकों में भर्ती होने और सीएएफ में अंतर करने से पहले उन्हें अधिक आसानी से चिकित्सकीय रूप से हेरफेर या लक्षित किया जाता है। इस प्रकार, हमारा 3डी मॉडल न केवल कैंसर कोशिकाओं का अध्ययन करने और परीक्षण करने के लिए एक आदर्श प्रणाली प्रदान करता है, बल्कि सीएएफ के विभिन्न अंशों या उपआबादी को भी पढें। 3 डी स्फेरॉइड गठन के लिए विधि सीधी है। महत्वपूर्ण चरणों में सहसंस्कृति के लिए सीरम मुक्त माध्यम का उपयोग करना, ट्यूमर कोशिकाओं के लिए फाइब्रोब्लास्ट का सही अनुपात लागू करना, और सहसंस्कृति के लिए सही संस्कृति प्लेटों का उपयोग करना शामिल है। हमारी विधि की संभावित सीमा यह है कि 3डी स्फेरॉइड का गठन काफी हद तक कैंसर सेल लाइन-निर्भर है। हमारे स्फेरॉइड गठन प्रोटोकॉल को फाइब्रोब्लास्ट और कैंसर कोशिकाओं के बीच अनुपात के अनुकूलन की आवश्यकता हो सकती है यदि विभिन्न कैंसर सेल लाइनें नियोजित हैं। यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि हमने 3 डी स्फेरॉइड के गठन के लिए मानव मेलानोमा सेल और माउस फाइब्रोब्लास्ट सेल कोकल्चर मॉडल का उपयोग किया, क्योंकि ट्यूमर स्फेरॉइड गठन को विनियमित करने में अणु या सिग्नलिंग मार्ग की भूमिका के अध्ययन के लिए माउस फाइब्रोब्लास्ट में गोफ या एलओएफ कोशिकाओं को बनाना बहुत आसान है। स्फेरॉइड बनाने के लिए मानव मेलानोमा कोशिकाओं और माउस फाइब्रोब्लास्ट की क्षमता इंगित करती है कि सेल-सेल संचार कार्य के लिए आवश्यक अणु क्रॉस-स्पीसिज काम करते हैं। हमने हाल ही में मानव मेलानोमा कोशिकाओं के साथ मानव फाइब्रोब्लास्ट के सहसंस्कृति का परीक्षण किया है और पाया है कि मानव फाइब्रोब्लास्ट मानव मेलानोमा कोशिकाओं को 3 डी स्फेरॉइड बनाने के लिए विनियमित भी कर सकते हैं।

हमने अपने बहुकोशिकीय 3 डी स्फेरॉइड मॉडल में मानव मेटास्टैटिक मेलानोमा कोशिकाओं, C8161 को नियोजित किया। हमने अन्य मानव मेलानोमा कोशिकाओं का भी परीक्षण किया, उदाहरण के लिए, 1205Lu32,जिसमें BRAFV600E उत्परिवर्तन किया जाता है, और MeWo, जो सीडीके4/किट (एटीसीसी एचटीबी-65) के उच्च स्तर को व्यक्त करता है, और पाया कि वे सहसंस्कृति में 3डी स्फेरॉइड बनाने में भी सक्षम हैं। यह इंगित करता है कि ट्यूमर कोशिकाओं द्वारा 3 डी स्फेरॉइड का गठन ऑन्कोजेनिक म्यूटेशन के प्रकारों से स्वतंत्र है। यद्यपि हमने यह परीक्षण नहीं किया है कि अन्य प्रकार की गैर-मेलानोमा ट्यूमर कोशिकाएं फाइब्रोब्लास्ट के साथ 3 डी स्फेरॉइड बनाने में सक्षम हैं या नहीं, हमारे निष्कर्षों से संकेत मिलता है कि 3डी स्फेरॉइड का गठन मेलानोमा सेल लाइन तक सीमित नहीं है और यह एक विशिष्ट कैंसर सेल लाइन पर निर्भर नहीं हो सकता है।

हमने अपने 3डी स्फेरॉइड मॉडल के व्यावहारिक अनुप्रयोगों के दो उदाहरण दिखाए। इसका एक उदाहरण कैंसर स्टेम/शुरू करने वाले सेल फेनोटाइप और 3डी स्फेरॉइड फॉर्मेशन को विनियमित करने में इंट्रासेलर नॉच सिग्नलिंग पाथवे गतिविधि को स्पष्ट करना था । हमने दिखा दिया कि सीएएफ में इंट्रासेलर नॉच सिग्नलिंग पाथवे इस 3डी स्फेरॉइड मॉडल का उपयोग करके कैंसर स्टेम/शुरू करने वाली कोशिकाओं के फेनोटाइप को नियंत्रित करने वाला आणविक स्विच है । हमारे निष्कर्ष न केवल कैंसर स्टेम/शुरू कोशिकाओं और कैंसर विषमता के एक आणविक तंत्र अंतर्निहित स्ट्रोमल विनियमन को उजागर, लेकिन यह भी उजागर है कि सीएएफ में पायदान मार्ग मेलानोमा चिकित्सा के लिए एक महत्वपूर्ण लक्ष्य है । यह उदाहरण इंगित करता है कि हमारा 3डी स्फेरॉइड मॉडल कैंसर सेल-स्ट्रोमल फाइब्रोब्लास्ट इंटरैक्शन के लिए तंत्र का अध्ययन करने और संभावित चिकित्सीय लक्ष्यों की पहचान करने के लिए बहुत उपयोगी है। एक अन्य उदाहरण सीएएफ की उपस्थिति में कैंसर स्टेम/शुरू कोशिकाओं की दवा प्रतिक्रिया का परीक्षण करना था । यह अच्छी तरह से जाना जाता है कि कैंसर स्टेम/शुरू कोशिकाओं सहित कैंसर कोशिकाओं की दवा प्रतिक्रिया, सीएएफ की उपस्थिति और अनुपस्थिति में बदलता है । इस इन विट्रो सिस्टम में सीएएफ की उपस्थिति इस मॉडल को अधिक चिकित्सकीय रूप से प्रासंगिक और उत्पन्न परीक्षण परिणामों को अधिक विश्वसनीय बनाती है। इसके अलावा, हमारी 3 डी स्फेरॉइड प्रणाली बहुमुखी है। इसका उपयोग विभिन्न उद्देश्यों के लिए किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, यदि इस 3 डी मॉडल में दवा प्रतिरोधी कैंसर कोशिकाओं को नियोजित किया जाता है, तो इसे दवा प्रतिरोध और शायद ट्यूमर पुनरावृत्ति को संबोधित करने के लिए बदला जा सकता है। यह भी परीक्षण या स्क्रीन दवाओं है कि मुख्य रूप से कैंसर के इलाज के लिए सीएएफ लक्ष्य के लिए संशोधित किया जा सकता है । सीएएफ हाल ही में चिकित्सकीय लक्ष्यों का वादा हो गया है । सीएएफ को लक्षित करने के फायदे हैं। सबसे पहले, ट्यूमर कोशिकाओं के साथ तुलना में जो असामान्य हैं (अक्सर आनुवंशिक परिवर्तन के साथ) और स्मार्ट (आसानी से कीमो और रेडियोथेरेपी के लिए प्रतिरोध प्राप्त करते हैं), ट्यूमर ऊतक में सीएएफ सामान्य कोशिकाएं और आनुवंशिक रूप से अधिक स्थिर होते हैं, इसलिए उपचार के लिए प्रतिरोध विकसित होने की संभावना कम होती है। दूसरा, सीएएफ को लक्षित करना ट्यूमर कोशिकाओं में ऑन्कोजेनिक म्यूटेशन के प्रकार पर निर्भर नहीं करता है। तीसरा, सीएएफ को लक्षित करने से फाइब्रोब्लास्ट-निर्भर एंटी-ट्यूमर, एंटी-एंजियोजेनेसिस, और/या मॉड्यूलिंग कैंसर प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के माध्यम से कई हिट प्रभाव प्राप्त हो सकते हैं । हमारा 3डी स्फेरॉइड मॉडल कैंसर चिकित्सीय रणनीतियों के विविध सेटों की खोज के लिए एक शक्तिशाली उपकरण है।

Disclosures

लेखकों की घोषणा वे कोई प्रतिस्पर्धी वित्तीय हितों की है ।

Acknowledgments

हम सहायक सहयोग, परामर्श और चर्चा के लिए डॉ ओमैदा सी वेलाक्वेज़ (मियामी विश्वविद्यालय) का शुक्रिया अदा करते हैं; डॉ Jie ली (मियामी विश्वविद्यालय) MeWo कोशिकाओं को उपलब्ध कराने के लिए; और डॉ Meenhard Herlyn (Wistar संस्थान) अन्य सभी मेलानोमा कोशिकाओं को उपलब्ध कराने के लिए। हम इमेजिंग विश्लेषण के लिए मियामी विश्वविद्यालय के एनालिटिकल इमेजिंग कोर फैसिलिटी के निदेशक डॉ मार्सिया बुलिना को भी धन्यवाद देते हैं । झाओ-जून लियू को बैंकहेड-कोले कैंसर रिसर्च प्रोग्राम (पुरस्कार # 09BN-11), महिला कैंसर एसोसिएशन (५३ वें वार्षिक अनुदान) और मियामी विश्वविद्यालय से आंतरिक धन से अनुदान द्वारा समर्थित कियागया था ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.25% Trypsin-EDTA Corning 25-253-CI
24-well plate Corning 351147 Non-tissue culture treated plate, 24-well, flat bottom with low evaporation lid
Alex Fluor 488 goat anti-mouse IgG Life Technology A21202
CaCl2 1.5 M Sigma-Aldrich C5670-500G
Collagenase, Type 1A Sigma-Aldrich C-2674 500 mg, 1 mg/mL concentration in DMEM.
DakoCytomation Dako x0909
DAPI
Dispase Grade II Roche Diagnostics 165859
Dulbecco's Modified Eagle's Medium(DMEM) Corning 10-013-CV
Fetal Bovine Serum VMR 97068-085 Premium Grade
Fiji (ImageJ) NIH Free for downloading, no license needed.
IncuCyte Zoom 2016A Essen Bioscience
IncuCyte Zoom System Essen Bioscience
Insulin Sigma-Aldrich I1882
L-15 Medium (Leibovitz) Sigma-Aldrich L1518
Leica SP5 Inverted Confocal Microscope Leica
MCDB 153 Medium Sigma-Aldrich M7403-10X1L
Mouse anti α-SMA (smooth muscle actin), monoclone Abcam ab18640
Olympus IX51 Inverted Fluorescence Microscope Olympus IX51
Olymupus CellSens Olympus
PD0325901 Selleckchem Chemicals S1036
Penicillin Streptomycin Solution Corning 30-002- CI 100 X
Sodium Bicarbonate 7.5% Corning 25-035-CI

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References

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Shao, H., Moller, M., Wang, D., Ting, A., Boulina, M., Liu, Z. J. A Novel Stromal Fibroblast-Modulated 3D Tumor Spheroid Model for Studying Tumor-Stroma Interaction and Drug Discovery. J. Vis. Exp. (156), e60660, doi:10.3791/60660 (2020).

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