En ny tredimensionell sfäroid modell baserad på heterotypic interaktion av tumörceller och stromal fibroblaster är etablerad. Här presenterar vi samodling av tumörceller och stromal fibroblaster, time-lapse imaging, och confocal mikroskopi för att visualisera bildandet av sfäroider. Denna tredimensionella modell erbjuder en pertinent plattform för att studera tumör-stroma interaktioner och testa cancer therapeutics.
Tumor-stroma interaktioner spelar en viktig roll i cancer progression. Tredimensionella (3D) tumör sfäroidmodeller är de mest använda in vitro-modellen i studien av cancerstamceller/initierande celler, preklinisk cancerforskning och läkemedelsscreening. 3D sfäroidmodeller är överlägsna konventionell tumör cell kultur och återge några viktiga tecken på verkliga fasta tumörer. Emellertid, konventionella 3D tumör sfäroider består uteslutande av tumörceller. De saknar deltagande av tumör stromal celler och har otillräcklig extracellulär matris (ECM) nedfall, alltså endast delvis härma in vivo villkor tumörvävnader. Vi etablerade en ny multicellulär 3D sfäroid modell bestående av tumörceller och stromal fibroblaster som bättre härmar in vivo heterogen tumör mikromiljö och dess inhemska desmoplasia. Bildandet av sfäroider regleras strängt av tumörstromal fibroblaster och bestäms av aktiviteten av bestämda avgörande intracellular signaleringvägar (e.g., Notch signalering) i stromal fibroblaster. I den här artikeln presenterar vi tekniker för samodling av tumörceller-stromal fibroblaster, time-lapse imaging att visualisera cellceller interaktioner, och confocal mikroskopi för att visa 3D arkitektoniska funktioner i sfäroider. Vi visar också två exempel på den praktiska tillämpningen av denna 3D-sfäroidmodell. Denna nya multicellulära 3D-sfäroida modell erbjuder en användbar plattform för att studera tumör-stroma interaktion, klargöra hur stromal fibroblaster reglera cancer stam / initiera celler, som bestämmer tumör progression och aggressivitet, och utforska inblandning av stromal reaktion i cancer läkemedelskänslighet och resistens. Denna plattform kan också vara en pertinent in vitro modell för läkemedelsupptäckt.
Solida tumörer representerar komplexa vävnader som består av neoplastiska celler och ett stort utbud av stromalceller1,2,3,4. Stromal fibroblaster, eller cancer-associerade fibroblaster (CAF), är en av de framstående stromal cell populationer i de flesta typer av fasta tumörer. De är kritiskt involverade i reglering en tumörtillväxt, stemness, metastasering, angiogenes och läkemedelsresistens genom produktion av tillväxtfaktorer, cytokiner/kemokineser, syntes av ECM och remodeling enzymer (t.ex. kollagen, fibronectin och matris metalloproteases), frisättning av exosomer, och direkta heterotypic cell-cell interaktion5,6,7,8,9,10,11 . CAF deltar också i fastställandet av cancer organ-specifika metastasering genom att förvälja en delmängd av tumör kloner från heterogena tumör cell populationer i den primära lesion och främja dessa utvalda kloner som ska primas för metastasering till en specifik avlägsen organ vars mikromiljö är optimal för rekolonisering av utvalda kloner12. Dessutom fibroblaster och deras utsöndrade lösliga faktorer och ECM delta i modulering av tumör angiogenesis13,14, anti-tumör immunsvar15, och är även inblandade i läkemedelsresistens och tumör återkommande16,17.
In vitro 3D tumör sfäroidmodeller har utvecklats och använts i cancerforskning som en mellanliggande modell mellan in vitro cancer cellkulturer och in vivo tumör modeller18,19,20,21. Den 3D tumör sfäroidmodeller har vunnit popularitet i cancer stamceller forskning, preklinisk cancer forskning, och drogscreening eftersom dessa modeller reproducera några viktiga funktioner i verkliga tumörer som saknas i traditionella 2D monolayers22. Många befintliga 3D tumör sfäroidmodeller är enbart består av tumörceller och saknar deltagande av tumör stromal celler. Detta resulterar ofta i tumör sfäroider har otillräcklig ECM nedfall och avsaknad av heterotypic cell-cell interaktioner. Konventionella 3D-sfäroider som uteslutande bildas av cancerceller och homotypic cell-cell vidhäftning kan endast delvis efterlikna in vivo villkor tumörvävnader. För att övervinna några av dessa begränsningar, utredare har föreslagit att införliva flera typer av stromal celler i 3D-kokulturer och utvecklat flera heterotyp 3D tumör sfäroid modeller23,24,25,26,27. Dessutom har utredare använt exogena 3D-matriser, inklusive naturliga hydrogeler eller syntetiska polymerer såsom polyetenglykol, poly(laktids- co-glykolid), och poly (N-isopropylacrylamide), för att bädda in monocellulära och multicellulära sfäroida modeller, skapa en cellstödjande miljö och reproducera cellmatrisinteraktioner28,29, vilket gör dessa system mer biologiskt relevanta30. Införlivande av vissa typer av stromalceller, såsom endotelceller, i 3D-kokulturer leder dock till ytterligare komplexitet för ett in vitro-system och gör det svårt att studera heterotypiska cellceller interaktioner mellan två specifika typer av celler, såsom cancer cell-fibroblast interaktioner. Dessutom, endotelceller i verkliga vävnader inte alltid direkt interagerar med cancerceller och andra stromal celler eftersom det finns ett lager av källaren membran insvept utanför kapillärer som förhindrar endotelceller från att direkt interagera med cancerceller och andra stromal celler. I dessa 3D sfäroida modeller, införlivade endotelceller faktiskt inte bildar blodkärl, men interagerar direkt med cancerceller och andra stromal celler, något som sällan förekommer in vivo. På samma sätt är exogena matriser som används i några av de 3D-sfäroida modellerna inte identiska med ECM i verkliga tumörvävnader när det gäller struktur och sammansättning. Alla dessa artificiella förhållanden kan leda till vilseledande uppgifter.
Vi har nyligen skapat en ny multicellulär 3D sfäroid modell bestående av tumörceller och CAF. I vår modell bestäms bildandet av 3D-tumörsfäroider helt av CAF. CAF inducerar och reglerar fenotypen av tumörstamceller/initierande celler. ECM produceras av CAF är naturligt och gör det möjligt för desmoplastic struktur att bättre efterlikna in vivo tumör mikromiljö. Denna nya 3D-modell kan vara ett användbart verktyg för cancer drog screening och erbjuder en unik plattform för att studera tumör-stroma interaktion, belysa hur CAF reglera cancer stam / initiera celler, och utforska medverkan av stromal interaktioner i cancer läkemedelskänslighet och resistens.
In vitro 3D-cellkulturtekniker har varit allmänt anställda i årtionden inom cancerforskning. Jämfört med konventionella 2D-cellodlingssystem rekapitulerar 3D-mikromiljön cellcell- och/eller cellmatrisinteraktionerna och möjliggör att de verkliga förhållanden som observerats i tumörvävnader efterliknars. Men ett 3D-system som endast bildas av cancerceller och homotypiska cellceller interaktioner tar inte hänsyn till vikten av heterotypic cross talk och kan ge felaktiga resultat i forskning. Vi har nyligen utvecklat ett nytt 3D-system som kombinerar cancerceller och CAF för att bättre efterlikna in vivo heterogen tumör mikromiljö och dess inhemska och stela desmoplastic reaktion.
Fibroblaster är viktiga komponenter i tumör stroma. CAF är involverade i regleringen av tumörprogression genom att framkalla lösliga faktorer, ECM/remodeling enzymer10,11, och exosomer. Dessutom, CAF spela en roll i läkemedelsresistens och tumör återkommande16,17. Vårt multicellulära 3D-sfäroidsystem kan användas för att utforska molekylära mekanismer för tumörstromal interaktioner och för att ta itu med läkemedelsresistens och tumör återkommande. CAF är främst härrör från aktiverade lokala quiescent fibroblaster och rekryteras cirkulerande benmärg MSC, som genomgår in situ differentiering i CAF i tumörvävnad37,38,39. I den aktuella studien använde vi hudfibroblaster för att skapa en multicellulär 3D-sfäroid modell. Emellertid, annan typ av fibroblaster (t.ex. MSC-DF), fungerar också på ett mycket liknande sätt som hud fibroblaster för att reglera tumörcell 3D sfäroid bildning34. MSC-DF kan genereras från murine benmärg MSC, som berikas av odling benmärg mononukleära celler i MSC cell odling medium i ca 10 dagar med periodiska medelstora förändringar var 3 dagar. Dessa MSC kännetecknas som CD73+/ CD105+/ Lin–. För att differentiera MSC i fibroblaster, MSC är därefter odlade med komplett DMEM för ytterligare 2 veckor. MSC-DF kännetecknas som α-SMA+/Vimentin+/FSP-1+ celler36. MSC-DF kan vara viktiga tumör regulatorer. Eftersom en bråkdel av CAF i många typer av fasta tumörer skiljer sig från rekryterade cirkulerande MSC frigörs från benmärg36,MSC-DF kan vara lovande behandlingsmål. De är också mycket lättare terapeutiskt manipulerade eller riktade innan de rekryteras till tumörvävnader och differentieras till CAF. Således erbjuder vår 3D-modell ett idealiskt system för att studera och testa inte bara cancerceller, men också olika fraktioner eller subpopulationer av CAF. Metoden för 3D-sfäroidbildning är enkel. De kritiska stegen inkluderar att använda serumfritt medium för samodling, tillämpa rätt förhållande av fibroblaster till tumörceller, och använda rätt kulturplattor för samkultur. Den potentiella begränsningen av vår metod är att bildandet av 3D-sfäroider till stor del är cancercell linjeberoende. Vårt spheroid bildningprotokoll kan kräva optimering av förhållandet mellan fibroblaster och cancerceller om olika cancercellinjer används. Det bör noteras att vi använde en human melanom cell och mus fibroblast cell koliemodell för bildandet av 3D sfäroider, eftersom det är mycket lättare att skapa GOF eller LOF celler i mus fibroblaster för studier av rollen som en molekyl eller signalering väg att reglera tumör sfäroidbildning. Förmågan hos mänskliga melanomceller och musfibroblaster att bilda sfäroider indikerar att molekyler som krävs för cell-cell kommunikation arbete korsarter. Vi har nyligen testat samodling av mänskliga fibroblaster med mänskliga melanomceller och fann att mänskliga fibroblaster kan också reglera mänskliga melanomceller för att bilda 3D-sfäroider.
Vi använde mänskliga metastaserande melanomceller, C8161, i vår flercelliga 3D-sfäroida modell. Vi testade också andra mänskliga melanomceller, till exempel 1205Lu32, som bär BRAFV600E mutation, och MeWo, som uttrycker höga nivåer av CDK4 /Kit (ATCC HTB-65), och fann att de också kan bilda 3D-sfäroider i samkultur. Detta tyder på att bildandet av 3D-sfäroider av tumörceller är oberoende av de typer av onkogena mutationer. Även om vi inte har testat om andra typer av icke-melanom tumörceller kan bilda 3D-sfäroider med fibroblaster, våra resultat tyder på att bildandet av 3D-sfäroider inte är begränsad till ett melanom cellinje och kanske inte beror på en viss cancercellinje.
Vi visade två exempel på praktiska tillämpningar av vår 3D-sfäroidmodell. Ett exempel var att belysa intracellulära Notch signalering utbildningsavsnitt aktivitet i regleringen av cancer stammen / initiera cell fenotyp och 3D sfäroid bildning. Vi visade att intracellular Notch signalering väg i CAF är en molekylär switch som styr fenotyp av cancer stam / initieraceller med hjälp av denna 3D sfäroid modell. Våra resultat inte bara avslöja en molekylär mekanism bakom stromal reglering av cancer stam / initiera celler och cancer heterogenicitet, men också belysa att Notch vägen i CAF är ett kritiskt mål för melanom therapeutics. Detta exempel visar att vår 3D-sfäroida modell är mycket användbar för att studera mekanismerna för cancer cell-stromal fibroblast interaktioner och identifiera potentiella terapeutiska mål. Ett annat exempel var att testa läkemedelssvaret från cancerstam/initierande celler i närvaro av CAF. Det är väl känt att läkemedelssvaret från cancerceller, inklusive cancer stamceller / initieraceller, varierar i närvaro och frånvaro av CAF. Förekomst av CAF i detta in vitro-system gör denna modell mer kliniskt relevant och genererade testresultat mer tillförlitliga. Dessutom är vårt 3D-sfäroidsystem mångsidigt. Det kan användas för olika ändamål. Till exempel, om läkemedelsresistenta cancerceller används i denna 3D-modell, Det kan ändras för att ta itu med läkemedelsresistens och kanske tumör återkommande. Det kan också ändras för att testa eller screenläkemedel som främst riktar CAF för cancerbehandling. CAF har nyligen blivit lovande terapeutiska mål. Det finns fördelar med att rikta CAF. Först, jämfört med tumörceller som är onormala (ofta med genetiska förändringar) och smart (lätt få resistens mot cellgifter- och radioterapier), CAF i tumörvävnad är normala celler och genetiskt stabilare, så de är mindre benägna att utveckla resistens mot behandlingarna. För det andra, inriktning CAF beror inte på vilken typ av onkogena mutationer i tumörcellerna. Tredje, inriktning CAF kan uppnå flera träffeffekter genom fibroblaster-beroende anti-tumör, anti-angiogenes, och / eller modulerande cancer immunsvar. Vår 3D-sfäroida modell är ett kraftfullt verktyg för att upptäcka olika uppsättningar av cancer terapeutiska strategier.
The authors have nothing to disclose.
Vi tackar Dr Omaida C. Velazquez (University of Miami) för hjälpsamma samarbete, samråd och diskussion; Dr Jie Li (University of Miami) för att tillhandahålla MeWo celler; och Dr Meenhard Herlyn (The Wistar Institute) för att tillhandahålla alla andra melanomceller. Vi tackar också Dr Marcia Boulina, chef för Analytical Imaging Core Facility, University of Miami, för bildbehandling analys. Zhao-Jun Liu stöddes av bidrag från Bankhead-Coley Cancer Research Program (Award# 09BN-11), Women’s Cancer Association (den53: e årliga bidrag) och interna medel från University of Miami.
0.25% Trypsin-EDTA | Corning | 25-253-CI | |
24-well plate | Corning | 351147 | Non-tissue culture treated plate, 24-well, flat bottom with low evaporation lid |
Alex Fluor 488 goat anti-mouse IgG | Life Technology | A21202 | |
CaCl2 1.5 M | Sigma-Aldrich | C5670-500G | |
Collagenase, Type 1A | Sigma-Aldrich | C-2674 | 500 mg, 1 mg/mL concentration in DMEM. |
DakoCytomation | Dako | x0909 | |
DAPI | |||
Dispase Grade II | Roche Diagnostics | 165859 | |
Dulbecco's Modified Eagle's Medium(DMEM) | Corning | 10-013-CV | |
Fetal Bovine Serum | VMR | 97068-085 | Premium Grade |
Fiji (ImageJ) | NIH | Free for downloading, no license needed. | |
IncuCyte Zoom 2016A | Essen Bioscience | ||
IncuCyte Zoom System | Essen Bioscience | ||
Insulin | Sigma-Aldrich | I1882 | |
L-15 Medium (Leibovitz) | Sigma-Aldrich | L1518 | |
Leica SP5 Inverted Confocal Microscope | Leica | ||
MCDB 153 Medium | Sigma-Aldrich | M7403-10X1L | |
Mouse anti α-SMA (smooth muscle actin), monoclone | Abcam | ab18640 | |
Olympus IX51 Inverted Fluorescence Microscope | Olympus | IX51 | |
Olymupus CellSens | Olympus | ||
PD0325901 | Selleckchem Chemicals | S1036 | |
Penicillin Streptomycin Solution | Corning | 30-002- CI | 100 X |
Sodium Bicarbonate 7.5% | Corning | 25-035-CI |