Summary
Detta protokoll beskriver en teknik för att visualisera makrofagbeteende och död i embryonal zebrafisk under Mycobacterium Marinum infektion. Steg för beredning av bakterier, infektion av embryon, och intravital mikroskopi ingår. Denna teknik kan tillämpas på observation av cellulära beteende och dödsfall i liknande scenarier som involverar infektion eller steril inflammation.
Abstract
Zebrafish är en utmärkt modellorganism för att studera medfödda immun cells beteenden på grund av dess transparenta natur och förlitar sig enbart på dess medfödda immunsystem under tidig utveckling. Den Zebrafish Mycobacterium Marinum (M. Marinum) infektion modell har varit väl etablerad i att studera värd immunsvar mot mycobakteriell infektion. Det har föreslagits att olika makrofage celldöd typer kommer att leda till de olika resultaten av mycobakteriell infektion. Här beskriver vi ett protokoll med intravital mikroskopi att iaktta makrofagcelldöd i zebrafiskar embryon efter M. Marinum infektion. Zebrafish transgena linjer som specifikt etikett makrofager och neutrofiler är infekterade via intramuskulär mikroinjektion av överföras märkt M. Marinum i antingen mellanhjärnan eller stammen. Infekterade zebrafiskar embryon därefter monteras på låg smältning Agreste och observeras av konfokalmikroskopi i X-Y-Z-T dimensioner. Eftersom långsiktig levande avbildning kräver användning av låg lasereffekt för att undvika foto blekning och fototoxicitet, en starkt uttryckt transgena rekommenderas starkt. Detta protokoll underlättar visualisering av de dynamiska processerna in vivo, inklusive immun cell migration, värd patogen interaktion, och celldöd.
Introduction
Mycobakteriell infektion har visats orsaka värd immun cells död1. Till exempel, en försvagad stam kommer att utlösa apoptos i makrofager och innehåller infektionen. Emellertid, envirulent stam kommer att utlösa lytisk celldöd, orsakar bakteriespridning1,2. Med tanke på effekterna av dessa olika typer av celldöd har på värd anti-mycobakteriell respons, en detaljerad observation av makrofagcelldöd under mycobakteriell infektion in vivo behövs.
De konventionella metoderna för att mäta celldöd är att använda döda cell fläckar, såsom annnexin V, Tunel, eller akridin orange/propidium jodid färgning3,4,5. Emellertid, dessa metoder är oförmögna att belysa den dynamiska processen av celldöd in vivo. Observation av celldöd in vitro har redan underlättat av Live Imaging6. Men om resultaten exakt efterlikna fysiologiska förhållanden är fortfarande oklart.
Zebrafish har varit en utmärkt modell för att studera Host anti-Mycobacterium svar. Den har ett mycket bevarat immunförsvar som liknar det hos människor, en lätt manipulerad genom, och de tidiga embryona är transparenta, vilket möjliggör levande Imaging7,8,9. Efter infektion med M. Marinum, Adult zebrafiskar form typiska mogna granulom strukturer, och embryonala zebrafisk form tidigt granulom som strukturer9,10. Den dynamiska processen av medfödda immun cell-bakterier interaktion har undersökts tidigare i zebrafiskar M. Marinum infektion modell11,12. Men på grund av hög spatial-temporal upplösning krav, detaljerna kring Döden av de medfödda immuncellerna förblir i stort sett odefinierade.
Här beskriver vi hur man visualiserar processen för makrofaglytisk celldöd som utlöses av mycobakteriell infektion in vivo. Detta protokoll kan också tillämpas för att visualisera cellulära beteende in vivo under utveckling och inflammation.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Zebrafish togs upp under standardbetingelser i enlighet med försöksdjurens riktlinjer för etisk granskning av djurens välbefinnande (GB/T 35823-2018). Alla zebrafiskar experiment i denna studie godkändes (2019-A016-01) och genomfördes på Shanghai Public Health Clinical Center, Fudan University.
1. M. Marinum Encellsinoculum beredning (figur 1)
- Tina Cerulean-fluorescerande M. Marinum glycerol lager från-80 ° c och Inokulera en 7H10 agar tallrik med 10% (v/v) OADC, 0,25% glycerol och 50 μg/ml hygromycin. Inkubera plattan vid 32 ° c i cirka 10 dagar.
- Välj en koloni som uttrycker positiv fluorescens och Inokulera 3 mL 7H9-medium med 10% OADC, 0,5% glycerol och 50 μg/mL hygromycin.
- Inkubera inympningen vid 32 ° c och 100 varv per minut (rpm) i 4 – 6 dagar tills kulturen når logaritmisk fas (OD600 = 0,6 – 1,0).
- Subkultur (1:100) i 30 mL färskt 7H9-medium med 10% OADC, 0,5% glycerol, 0,05% Tween-80 och 50 μg/mL tills OD600 når ~ 1,0.
Anmärkning: för högsta kultur kvalitet, en subkultur steg rekommenderas på denna punkt. Enligt vår erfarenhet, att lägga till klon direkt till en stor mängd medium kommer att leda till bildandet av bakteriella klumpar.
- Samla M. Marinum -celler enligt beskrivningen nedan.
- Centrifugera vid 3 000 x g i 10 minuter för att samla upp M. Marinum som en pellet. Kassera alla utom 300 μL av supernatanten och Använd den för att omlägga pelleten.
- Tillsätt 3 mL 7H9 medium med 10% glycerol för att ytterligare Omsuspendera pelleten, sedan Sonikera suspensionen i ett vattenbad på 100 W vid 15 s på, 15 s av för totalt 2 min.
Obs: Syftet med ultraljudsbehandling är att uppnå en enda cell homogena för inoculum, vilket kommer att förhindra blockering av mikroinjektionsnålen.
- Överför bakteriesuspensionen till en 10 mL spruta och passera sedan genom ett 5 μm filter för att avlägsna eventuella bakterie klumpar.
- Mät uppskovs optiska densitet (OD) med hjälp av en spektrofotometer och späd den till OD600 = 1,0 med 7H9-mediainnehåll ande 10% glycerol. Dela upp suspensionen i 10 μL alikvoter och förvara vid-80 ° c frys för framtida bruk.
- Bekräfta den bakteriella koncentrationen av inokulum (CFU/ml) genom seriell utspädning och plätering av bakterie beståndet på en 7h10-agar-platta som innehåller 10% (v/v) av oadc, 0,5% av glycerol och 50 μg/ml hygromycin.
2. Zebrafish embryo beredning
- En dagen innan lek, inrätta zebrafiskar avel par i häcknings kammaren.
Lägg bara till ett par i varje avels kammare. - Samla embryon nästa morgon inom 1 h post fertilisering (HPF). Tvätta embryona omsorgsfullt med destillerat vatten och överför upp till 100 embryon till en petriskål på 100 mm innehållande 30 mL E3-medium. Inkubera vid 28,5 ° c.
- Efter 12 h, Observera under ett mikroskop och kassera obefruktade eller skadade ägg.
- Vid 24 HPF, ändra mediet till färskt E3 medium med N-fenyltiourea (PTU, 0,2 nM slutlig koncentration) för att förhindra utvecklingen av pigment. Inkubera embryona vid 28,5 ° c tills embryona är redo för mikroinjektion.
3. infektion via bakteriell mikroinjektion
- Bered borosilikatglas mikrokapillära injektionsnålar som tidigare beskrivits i referens13.
- Zebrafish embryon montering för infektion
- Mikrovågsugn 100 mL 1% (w/v) och 100 mL 0,5% (w/v) låg smältning aguppstod i ett autoklaverat E3 medium tills aguppstod är helt smält. Fördela i 1 mL Ali kvot rör och förvara vid 4 ° c för framtida bruk.
- Före användning, värm aguppstod i en 95 ° c värmeblock tills det är helt smält. Bibehålla Agam i flytande form genom att placera den i en 45 ° c värmeblock (figur 2).
- Montering för intramuskulär infektion i bål regionen
- Skapa botten aguppstod skikt genom att hälla 0,5 mL 1% (w/v) Agreste jämnt på en glas bild. Placera på en is låda eller kall yta för 3 min att stelna.
- Anesthetize den zebrafiskar embryon (48-72 HPF) i ägg vatten med tricaine (200 μg/ml) och PTU för 5 min före montering. Placera upp till 60 zebrafiskar embryon på botten aguppstod skiktet och Lägg dem försiktigt i två rader (figur 2B).
- Ta bort eventuella kvarvarande vatten på botten aguppen skikt med mjukpapper innan du lägger 0,3 mL av 0,5% (w/v) Agreste för att skapa det övre skiktet. Se till att embryona är helt inbäddade i aguppstod. Returnera glas bilden till Ice Box igen för att stelna Agam och förhindra uttorkning.
- Håll det översta lagret av aguppstod fuktig genom att täcka ytan med extra E3 ägg vatten.
- Montering för mellanhjärnan infektion
- Täck spåret av en enda konkavitet glas mikroskopi Slide med 1% (w/v) Agreste, och sedan överföra 4 – 6 tricaine-sövda embryon i aguppstod.
- Placera huvudet på varje embryo uppåt försiktigt med en 10 G nål (figur 2C).
- När alla embryon positioner är fasta, överföra glaset glida till en is låda eller kall yta för att låta aguppstod stelna.
Obs: Undvik utspädning av låg smältning aguppstod genom att minimera volymen av ägg vatten överföring med embryon.
- Bakterier förberedelse för infektion
- Tillsätt 1 μL steril-filtrerat fenolrött (10X) till en 10 μL alikvot av bakterie beståndet (tillverkat i steg 1) och blanda med en kort stund.
Obs: den slutliga koncentrationen kan justeras med steril PBS. - Sonikera preparatet med 100 W vid 10 s på, 10 s av för 1 min att bryta upp några klumpar som kan ha bildat14.
- Tillsätt 1 μL steril-filtrerat fenolrött (10X) till en 10 μL alikvot av bakterie beståndet (tillverkat i steg 1) och blanda med en kort stund.
- Infektion via mikroinjektion
- Justera mikroinjektorn och micromanipulator till rätt position och inställning för mikroinjektion som tidigare rapporterat13.
- Överför 3 μL av bakterie preparatet med hjälp av en Micro Loader till den förberedda nålen (se steg 3,1). Pipettera långsamt och försiktigt för att undvika att bilda luftbubblor.
- För stammen regionen infektion, injicera 100 cfu i stammen regionen (figur 3A). Undvik att injicera bakterier i notochord.
Anmärkning: CFU för injektion uppskattas av formeln CFU = bakteriell lager koncentration x spädningsfaktor x injektions droppets volym. Den faktiska CFU bekräftas genom plätering en droppe av bakteriell inokulum på en 7h10 agar tallrik som innehåller 10% (v/v) av oadc, 0,5% av glycerol, och 50 μg/ml hygromycin. - För mellanhjärnan infektion, injicera ca 500 CFU i mellanhjärnan-regionen (figur 3B).
- Efter microinjection, spola försiktigt zebrafiskar embryon i färskt ägg vatten med en plastpipett.
Anmärkning: montera embryon i glaset botten skålen så snart som möjligt för att täcka observation av den mycket tidiga medfödda immunceller svar.
4. levande avbildning av infektionen
- Fisk montering för Live Imaging
- Överför upp till 10 trikain-anestetiserade embryon till mitten av en glasbotten 35 mm skålen. Kassera extra E3-medium.
- Täck skålen med 1% låg smältpunkt Agreste och orientera zebrafiskar embryon försiktigt med en 10 G nål. Inkubera glasbotten skålen på is för 10 s att stelna aguppstod.
Anmärkning: vid mellanhjärnan injektion bör embryon monteras i aguppen med huvudet riktat uppåt (figur 4a). För stammen regionen intramuskulär infektion, embryon bör monteras i sidled i Agreste (figur 4B). - När den har helt stelnat, täck aguppstod med ett lager av ägg vatten (plus 1 x tricaine och PTU).
- Tre-färg högupplöst tid förfaller konfokalmikroskopi
Anmärkning: följande steg drivs på en konfokal mikroskopi utrustad med en 63,0 x 1,40 olja UV objektiv objektiv.- Ställ in temperaturen i miljö kammaren på 28,5 ° c. Placera lite vått silkespapper i kammaren för att ge fukt och förhindra avdunstning av ägg vattnet (kompletterande figur 1).
- Placera 35 mm glasbotten skålen med zebrafiskar i miljö kammaren.
- Öppna konfokalmikroskopi-programvaran och initiera scenen. Byt till 63,0 x 1,40 Oil UV-objektiv och lokalisera zebrafisken genom att använda den ljusa fält kanalen med ett DIC-filter (differential interferenskontrast).
- Öppna 405-dioden, argon (20% effekt) och DPSS 561 nm Laser. Ställ in lämpliga inställningar för laser ström och spektrum.
Anmärkning: följande är spektrum inställningar för Cerulean (excitation = 405 nm; emission = ~ 456 – 499 nm), eGFP (excitation = 488 nm; utsläpp = ~ 500 – 550 Nm), DsRed2 (excitation = 561 nm; emission = ~ 575 – 645 nm) (kompletterande figur 2b). - Välj "XYZ" "sekventiell skanning" förvärvs läge och ange bilder format till "512 x 512 pixlar" (kompletterande figur 2A).
- Växla till "Live data-läge". Rikta positionen för den första zebrafisken och markera "BEGIN" och "End" Z position. Upprepa denna process för var och en av de kvarvarande embryona. En "paus" kan läggas till i slutet av programmet (kompletterande figur 2C).
- Definiera slingan och cykeln för programmet.
- Spara filen.
5. Single cell UV-strålning inducera apoptos och levande avbildning
- Montera fisken enligt beskrivningen i steg 4,1.
- Avbildning av mellanhjärnan-regionen på 3 dagar efter fertilisering (DPF) makrofagspecifikt transgena TG (mfap4-egfp) embryo15
- Välj den region av intresse för en enda överföras märkt makrofag och skanna vid 400 Hz hastighet och 6% UV-lasereffekt för 50 s.
Skanningshastighet och tid bör optimeras baserat på det enskilda mikroskopet. Skanningstiden bör optimeras för att orsaka omfattande DNA-skador som senare kommer att orsaka Målcell apoptos, men inte photobleach hela cellen. - Upprepa ovanstående steg för att bestråla fler målceller.
- Utför tids fördröjnings avbildning av mellanhjärnan-regionen enligt beskrivningen i avsnitt 4.
6. bildbehandling
- Utför "maximal projektion" för de förvärvade bilderna.
- Hitta och markera XY-positionen och tiden för målcellerna under vyn "maximal projektion".
- Gå tillbaka till standardvyn för att hitta och markera Z-positionen för målcellerna.
- Beskär den enda lager bilden av målcellerna.
- Exportera överlägget kanal och ljust fält som video i AVI-format.
- Beskär området av intresse för overlay kanal och ljust fält i ImageJ.
- Kombinera de två videorna i det sista steget vertikalt och Spara som en AVI-format video i ImageJ.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Mycobacterium infektion kan utlösa olika värd svar baserat på vägarna av infektion. I detta protokoll är zebrafiskar embryon smittade av intramuskulär mikroinjektion av överföras märkta bakterier i mellanhjärnan eller bålen (figur 3) och observeras av konfokala Live Imaging. Infektion via dessa två vägar kommer att lokalt begränsa infektionen orsakar medfödda immunceller rekrytering och efterföljande celldöd.
Visualisera detaljerna i medfödda immun cells död är utmanande. Lytisk celldöd sker över en mycket kort tidsfönster och kräver högupplöst mikroskopi att iaktta. Också, den höga motilitet av medfödda immunceller tillåter dem att migrera ut ur observationsområdet. I detta protokoll löser vi problemet genom att observera flera embryon parallellt. En rad av zebrafiskar embryon kan monteras på ett enda glas Mikroskop bild för infektion, och upp till 10 embryon kan monteras på samma 35 mm glasbotten skålen för levande avbildning (figur 4). Genom att utnyttja en Live datamodell av konfokalmikroskopi, kan mer än ett embryo observeras samtidigt. Detta förbättrar effektiviteten i Live Imaging och ökar kraftigt sannolikheten för att fånga hela lytiska celldöd process.
Det medfödda immunförsvaret är den första försvarslinjen mot mycobakteriell infektion, och två viktiga komponenter är makrofage och neutrofila. Här använder vi tidigare rapporterad TG (coro1a: egfp; lyzDsRed2) och TG (MPEG1: loxP-dsredx-loxP-egfp; LyZ: egfp) för att särskilja makrofager och neutrofilerna in vivo16,17,18. En makrofager kraftigt svullna med bakterier blev runda och visade minskad motilitet, med eventuell cytoplasmisk svullnad, bristning av cellmembranet, och snabb spridning av cytoplasmiska innehåll. Dessa händelser är typiska morfologiska förändringar av lytisk celldöd som tidigare rapporterats (figur 5a)16. UV-bestrålning har använts för att utlösa celler att genomgå apoptos i zebrafiskar20,21. I överensstämmelse med detta begrepp uppvisade UV-bestrålade makrofager typiska apoptotiska cell fenotyper, såsom cell krympning, nukleär fragmentering och kromatinkondensation (Figur 5b)22,23. Kombinerat med användning av Cerulean-fluorescerande m. Marinum19, tre färg levande bild av samspelet mellan macrophage, neutrofila, och M. Marinum uppnåddes in vivo. Vi observerade också att makrofager kan aktivt fagocytera och sprida M. Marinum (kompletterande figur 3a). Emellertid, neutrofiler hade begränsad fagocytos förmåga och snabbt genomgick lytisk celldöd utan uppenbar bakteriell svullnad (kompletterande figur 3b). Neutrofiler kan utlösas av fagocytos av endast ett fåtal döda M. Marinum som inte uttrycker Cerulean-fluorescens, eller helt enkelt genom fagocytos av begränsade döda celler skräp.
Figur 1: Schematiskt diagram över beredning av enstaka cell bakterier. Single cell Cerulean-fluorescerande M. Marinum bestånd genererades efter den beskrivna processen. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: diagram över zebrafiskar embryo-montering för mikroinjektion. (A) Schematiskt diagram över monteringsprocessen. B) Zebrafish-embryon har monterats i sidled för infektion i bål regionen. C) Zebrafish-embryon har monterats med huvudet riktat uppåt för infektion i mellanhjärnan. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: positionering för mikroinjektion. (A) den röda pilen indikerar injektionsstället för infektion i stammen regionen. (B) den röda pilen indikerar injektionsstället för mellanhjärnan-infektion. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: montering av zebrafiskar embryon för levande avbildning. (A) för mellanhjärnan-infektion, var zebrafiskar embryon monterade med huvudet riktat nedåt. (B) för stammen regionen infektion, zebrafiskar embryon var monterade i sidled med injektionsstället nära botten av glaset botten skålen. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: typiska morfologiska förändringar i M. Marinum infektion inducerad makrofaglytisk celldöd och UV inducerad makrofage apoptos. (A) tidsfördröjning avbildning av en makrofag (Mac) som genomgår lytisk celldöd när den är kraftigt svullna med M. Marinum. Mellanhjärnan av 3 DPF TG (coro1a: egfp; lyzDsRed2) zebrafiskar embryo är infekterad av Cerulean-fluorescerande M. Marinum (~ 500 CFU) via mikroinjektion. Bilder för både overlay kanal (övre panelen) och DIC kanal (nedre panelen) tillhandahålls. T 00:00 är 5 h 20 min post infektion. Vit streckad linje = cellmembranets kontur; svarta streckade linjer = svullnad cytoplasma; svarta pilar = spruckna cellmembran; röda streckade linjer = snabbt förlorat cytoplasmiska innehåll. B) fotografering med tidsfördröjning av UV-bestrålat makrofage. En GFP +-cell i mellanhjärnan-regionen på 3 DPF TG (mfap4: egfp) bestrålas av UV och följs av tids fördröjnings avbildning. Vit streckad linje = cellmembranets kontur; svarta pilar = nukleär fragmentering och kromatinkondensation. Skalstapel = 15 μm. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Kompletterande figur 1: miljökammare inrättas för Live Imaging. (A) Ställ in den digitala styrenheten så att temperaturen hålls vid 28,5 ° c. (B) Ställ våtservetter inuti kammaren för att ge fukt och förhindra avdunstning av ägg vatten. (C) Stäng locket till kammaren och vänta i minst 30 min för temperaturstabilisering innan du påbörjar levande avbildning. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Kompletterande figur 2: inställning av Konfokalpanelen för Live Imaging. (A) representation av inställningar för förvärvs panelen. B) representation av lasereffekt-och spektrum inställningar. (C) representation av flera jobb och loop inställning i Live data-läge. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Kompletterande figur 3: makrofager sprider infektion och neutrofiler genomgår lytisk celldöd efter M. Marinum -infektion. A) makrofagspridning av m. Marinum i stammen av en 2 DPF TG (coro1a: egfp; LyZ: DsRed2) zebrafiskar embryo smittad av Cerulean-fluorescerande m. Marinum (~ 100 CFU). B) neutrofila (Neu) som genomgår lytisk celldöd utan uppenbar m. Marinum lastat i stammen regionen 3 DPF TG (MPEG1: lrlg; LyZ: egfp) zebrafiskar embryo smittad av Cerulean-fluorescerande m. Marinum (~ 100 CFU) via mikroinjektion. Grön färg tilldelas till LRLG och röd färg tilldelas eGFP för bättre visualisering av den lytiska celldöd processen. Pilarna i cyan indikerar målceller. Pilar i rött pekar på de celler som är på väg att släppa cytoplasman innehåll i nästa bildruta. Pilar i grönt pekar på de döda cellerna som just har förlorat sin cytoplasma innehåll. Skalstapel = 25 μm. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Video 1: en makrofage tungt lastad med M. Marinum genomgår lytisk celldöd, relaterat till figur 5a. Time-lapse Imaging (63x mål) för 9 min och 18 s vid 3 bilder per sekund (FPS) i mellanhjärnan regionen av en 3 DPF TG (coro1a: egfp; lyzDsRed2) zebrafiskar embryo infekterade med Cerulean-fluorescerande M. Marinum. Vänligen klicka här för att se denna video (Högerklicka för att ladda ner).
Video 2: en makrofaggenomgår apoptos efter UV-bestrålning, relaterat till Figur 5b. Time-lapse Imaging (63x mål) på 74 min vid 6 fps i mellanhjärnan regionen en 3 DPF TG (mfap4: egfp) zebrafiskar embryo. En GFP +-cell i mitthjärn regionen av embryona bestrålas av UV och följs av tidsfördröjning Imaging. Vänligen klicka här för att se denna video (Högerklicka för att ladda ner).
Video 3: en makrofag sprider M. Marinum, relaterad till tilläggs figur 3a. Time-lapse Imaging (63x mål) av 24 min vid 3 fps i stammen regionen 2 DPF TG (coro1a: egfp; LyZ: DsRed2) zebrafiskar embryo infekterade med Cerulean-fluorescerande M. Marinum. Vänligen klicka här för att se denna video (Högerklicka för att ladda ner).
Video 4: en neutrofila genomgår lytisk celldöd utan uppenbar M. Marinum engorgement, i samband med kompletterande figur 3b. Time-lapse Imaging (63x mål) på 7 min 30 s vid 3 fps i stammen regionen 3 DPF TG (MPEG1: lrlg; LyZ: egfp) zebrafiskar embryo infekterade med Cerulean-fluorescerande M. Marinum. Vänligen klicka här för att se denna video (Högerklicka för att ladda ner).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Detta protokoll beskriver visualiseringen av makrofagdöd under mycobakteriell infektion. Baserat på faktorer som integriteten av cellmembranet, infektion driven celldöd kan delas in i apoptos och lytisk celldöd24,25. Lytisk celldöd är mer stressande för organismen än apoptos, eftersom det utlöser en stark inflammatorisk reaktion 24,25. Observation av lytisk celldöd in vivo är svårt, på grund av kravet på hög spatial-temporal upplösning, korrekt konfokal mikroskopi inställningar, och starka transgena uttryck.
Korrekt mikroinjektion kräver flera kritiska steg. Den bakteriella beståndet måste noggrant sonicated att ta bort alla klumpar före injektion. Vi förbättrade zebrafiskar montering för mikroinjektion genom att bädda in dem på en glas glida mellan två lager av låg smältning aguppstod. Efter applicering av det andra skiktet av aguppstod, är bilden överförs till en is låda eller kall yta för att påskynda stelning och förhindra uttorkning av aguppstod. Om embryona behöver monteras på olika diabilder, se till att hålla det översta lagret av aguppstod fuktig genom att tillsätta extra ägg vatten.
För Live Imaging, krävs en högupplöst objektiv objektiv för att observera detaljerna i celldöd. Detta krav åtföljs alltid av kort arbetsavstånd, och kräver därför positionering infektions platsen nära omslagsbilden. Ett långt arbetsavstånd vatten lins är idealisk för att avbilda djupare vävnad och kommer att möjliggöra mer utrymme för korrekt embryomontering. Extended Live Imaging med hjälp av en laser med hög intensitet kommer att orsaka vävnadsskada eller dödsfall av embryot. Således är det mycket viktigt att hålla intensiteten av lasern så låg som möjligt för att undvika foto blekning och toxicitet. En starkt uttrycka transgena kan underlätta observation med hjälp av en laser med låg intensitet. Eftersom GFP-uttrycket är starkare i TG (coro1a: eGFP) än TG (Mpeg1: egfp)använde vi TG (coro1a: Egfp; LyZ: DsRed2) i stället för TG (MPEG1: egfp; LyZ: DsRed2) i denna studie. Att ställa in en mobil arbetsstation för mikroinjektion nära den konfokala maskinen är bäst för att observera snabba svar. Kylning den låga smältande aguppstod på is för att påskynda stelnings tiden kan också bidra till att minska tiden mellan injektion och levande avbildning.
I detta protokoll fokuserar vi på observation av makrofagbeteende. Emellertid, den detaljerade studien av neutrofila beteende under mycobakteriell infektion kan också vara informativ. Till exempel, hur neutrofila extracellulära fällor (nät) är inblandade i att döda extracellulära Mycobacterium tuberculosis fortfarande i stort sett odefinierad. Kombinationen av den avbildningsteknik som beskrivs i detta protokoll med en Histon protein märkning transgena kommer att avsevärt underlätta visualisering av nät in vivo.
För närvarande, zebrafiskar erkänns som ett mycket robust system för att studera medfödda immunceller beteende. Statistiska uppgifter om fagocytos och celldöd kan uppnås med hjälp av detta protokoll. Kombinerat med de kraftfulla gen redigeringsverktygen som finns tillgängliga idag kan detta protokoll ge en effektiv plattform för att ytterligare förstå effekten av en mängd olika faktorer på interaktion mellan värd och patogen in vivo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Vi tackar Dr Zilong Wen för att dela zebrafiskar stammar, Dr Stefan Oehlers och Dr David Tobin för att dela M. Marinum relaterade resurser, yuepeng han för hjälp i figur förberedelse. Detta arbete stöddes av National Natural Science Foundation i Kina (81801977) (B.Y.), den utestående ungdom utbildningsprogram för Shanghai Municipal Health Commission (2018YQ54) (B.Y.), Shanghai segling program (18YF1420400) (B.Y.), och öppen fond av Shanghai Key Laboratory of tuberculosis (2018KF02) (B.Y.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.05% Tween-80 | Sigma | P1379 | |
| 10 mL syringe | Solarbio | YA0552 | |
| 10% OADC | BD | 211886 | |
| 3-aminobenzoic acid | Sigma | E10521 | |
| 5 μm filter | Mille X | SLSV025LS | |
| 50 μl/ml hygromycin | Sangon Biotech | A600230 | |
| 7H10 | BD | 262710 | |
| 7H9 | BD | 262310 | |
| A glass bottom 35 mm dish | In Vitro Scientific | D35-10-0-N | |
| Agarose | Sangon Biotech | A60015 | |
| Confocal microscope | Leica | TCS SP5 II | |
| Enviromental Chamber | Pecon | temp control 37-2 digital | |
| Eppendorf microloader | Eppendorf | No.5242956003 | |
| Glass microscope slide | Bioland Scientific LLC | 7105P | |
| Glycerol | Sangon Biotech | A100854 | |
| Incubator | Keelrein | PH-140(A) | |
| M.marinum | ATCC BAA-535 | ||
| Microinjection needle | World Precision Instruments | IB100F-4 | |
| Microinjector | Eppendorf | Femtojet | |
| Micromanipulator | NARISHIGE | MN-151 | |
| msp12:cerulean | Ref.: PMID 25470057; 27760340 | ||
| Phenol red | Sigma | P3532 | |
| PTU | Sigma | P7629 | |
| Single concavity glass microscope slide | Sail Brand | 7103 | |
| Sonicator | SCICNTZ | JY92-IIDN | |
| Spectrophotometer (OD600) | Eppendorf AG | 22331 Hamburg | |
| Stereo Microscope | OLYMPUS | SZX10 | |
| Tg(mfap4:eGFP) | Ref.: PMID 30742890 | ||
| Tg(coro1a:eGFP;lyzDsRed2) | Ref.: PMID 31278008 | ||
| Tg(mpeg1:LRLG;lyz:eGFP) | Ref.: PMID 27424497; 17477879 |
References
- Behar, S. M., Divangahi, M., Remold, H. G. Evasion of innate immunity by Mycobacterium tuberculosis: is death an exit strategy. Nature Reviews Microbiology. 8 (9), 668-674 (2010).
- Lamkanfi, M., Dixit, V. M. Manipulation of host cell death pathways during microbial infections. Cell Host Microbe. 8 (1), 44-54 (2010).
- Crowley, L. C., Marfell, B. J., Scott, A. P., Waterhouse, N. J. Quantitation of Apoptosis and Necrosis by Annexin V Binding, Propidium Iodide Uptake, and Flow Cytometry. Cold Spring Harbor Protocol. 2016 (11), (2016).
- Crowley, L. C., Marfell, B. J., Waterhouse, N. J. Detection of DNA Fragmentation in Apoptotic Cells by TUNEL. Cold Spring Harbor Protocol. 2016 (10), (2016).
- Chan, L. L., McCulley, K. J., Kessel, S. L. Assessment of Cell Viability with Single-, Dual-, and Multi-Staining Methods Using Image Cytometry. Methods in Molecular Biology. 1601, 27-41 (2017).
- Rathkey, J. K., et al. Live-cell visualization of gasdermin D-driven pyroptotic cell death. Journal of Biological Chemistry. 292 (35), 14649-14658 (2017).
- Henry, K. M., Loynes, C. A., Whyte, M. K., Renshaw, S. A. Zebrafish as a model for the study of neutrophil biology. Journal of Leukocyte Biology. 94 (4), 633-642 (2013).
- Harvie, E. A., Huttenlocher, A. Neutrophils in host defense: new insights from zebrafish. Journal of Leukocyte Biology. 98 (4), 523-537 (2015).
- Lesley, R., Ramakrishnan, L. Insights into early mycobacterial pathogenesis from the zebrafish. Current Opinion Microbiology. 11 (3), 277-283 (2008).
- Tobin, D. M., Ramakrishnan, L. Comparative pathogenesis of Mycobacterium marinum and Mycobacterium tuberculosis. Cellular Microbiology. 10 (5), 1027-1039 (2008).
- Clay, H., et al. Dichotomous role of the macrophage in early Mycobacterium marinum infection of the zebrafish. Cell Host Microbe. 2 (1), 29-39 (2007).
- Davis, J. M., et al. Real-time visualization of mycobacterium-macrophage interactions leading to initiation of granuloma formation in zebrafish embryos. Immunity. 17 (6), 693-702 (2002).
- Benard, E. L., et al. Infection of zebrafish embryos with intracellular bacterial pathogens. Journal of Visualized Experiments. (61), e3781 (2012).
- Maglione, P. J., Xu, J., Chan, J. B. cells moderate inflammatory progression and enhance bacterial containment upon pulmonary challenge with Mycobacterium tuberculosis. Journal of Immunology. 178 (11), 7222-7234 (2007).
- Wang, Z., et al. Neutrophil plays critical role during Edwardsiella piscicida immersion infection in zebrafish larvae. Fish Shellfish Immunology. 87, 565-572 (2019).
- Wang, T., et al. Nlrc3-like is required for microglia maintenance in zebrafish. Journal of Genetics and Genomics. 46 (6), 291-299 (2019).
- Hall, C., Flores, M. V., Storm, T., Crosier, K., Crosier, P. The zebrafish lysozyme C promoter drives myeloid-specific expression in transgenic fish. BMC Developmental Biology. 7, 42 (2007).
- Xu, J., Wang, T., Wu, Y., Jin, W., Wen, Z. Microglia Colonization of Developing Zebrafish Midbrain Is Promoted by Apoptotic Neuron and Lysophosphatidylcholine. Developmental Cell. 38 (2), 214-222 (2016).
- Oehlers, S. H., et al. Interception of host angiogenic signalling limits mycobacterial growth. Nature. 517 (7536), 612-615 (2015).
- Kulms, D., Schwarz, T.
- van Ham, T. J., Mapes, J., Kokel, D., Peterson, R. T. Live imaging of apoptotic cells in zebrafish. FASEB Journal. 24 (11), 4336-4342 (2010).
- Zhang, Y., Chen, X., Gueydan, C., Han, J. Plasma membrane changes during programmed cell deaths. Cell Research. 28 (1), 9-21 (2018).
- Lu, Z., Zhang, C., Zhai, Z.
- Ashida, H., et al. Cell death and infection: a double-edged sword for host and pathogen survival. Journal of Cell Biology. 195 (6), 931-942 (2011).
- Traven, A., Naderer, T. Microbial egress: a hitchhiker's guide to freedom. PLoS Pathogens. 10 (7), 1004201 (2014).
