Summary
여기서 설명된 메틸화 특이적 프로브 증폭 방법은 골육종 유래 세포외 소포로 처리된 중간엽 줄기 세포에서 LINE-1 원소의 메틸화 수준을 분석하는 방법이다. 태아 소 혈청에서 세포 외 소포를 분리하는 인기있는 절차인 초원심분리도 입증되었습니다.
Abstract
메틸화 특이적 프로브 증폭(MSPA)은 DNA 샘플의 메틸화 수준에서 상대적 차이를 감지하는 데 사용할 수 있는 간단하고 강력한 기술입니다. 그것은 수완이 많고, 소량의 DNA를 필요로하며, 실습 작업의 약 4-5 시간을 취합니다. 제시된 기술에서, DNA 견본은 대조물로 메틸화되거나 참조 사이트에 DNA를 표적으로 하는 탐사기로 그 때 첫째로 변성됩니다. 혼성화된 DNA는 병렬 반응으로 분리되고, 하나는 결찰만 을 겪고 다른 하나는 메틸화되지 않은 GCGC 서열에서 HhaI 매개 소화에 이어 결찰을 겪습니다. 결과 DNA 단편은 PCR에 의해 증폭되고 모세관 전기 동아에 의해 분리됩니다. 메틸화 GCGC 사이트는 HhaI에 의해 소화되지 않고 피크 신호를 생성하지만, 메틸화되지 않은 GCGC 사이트는 소화되고 피크 신호가 생성되지 않습니다. 각 샘플의 소화 및 소화되지 않은 버전의 제어 정규화 피크를 비교하면 DNA 샘플의 메틸화 투여 비율이 제공됩니다. 여기서, MSPA는 중간엽 줄기 세포에서 긴 산재핵 원소-1(LINE-1)의 메틸화 상태에 대한 골육종 유래 세포간 소포(EV)의 효과를 검출하는데 사용된다. LINE-1s는 전형적으로 암에 있는 hypomethylation를 겪는 반복적인 DNA 원소이고, 이 수용량에서, biomarker로 봉사할 수 있습니다. 초원심분리는 또한 생물학적 유체로부터 세포외 소포를 분리하는 비용 효율적인 방법으로 사용됩니다(즉, EV고갈린 태아 소 혈청 [FBS]을 준비하고 골육종 컨디셔닝 매체[차동 원심분리])에서 EV를 분리하는 경우). 메틸화 분석을 위해 맞춤형 LINE-1 프로브는 LINE-1 프로모터 서열과 7개의 제어 부위에서 3개의 메틸화 부위를 대상으로 설계되었습니다. 이 프로토콜은 LINE-1 메틸화 분석을 위한 MSPA의 사용을 보여주고 초원심분리에 의한 EV 고갈 된 FBS의 제조를 설명합니다.
Introduction
DNA 메틸화는 인간 세포에서 발생하는 주요 후생유전학적 변형이다. DNA 메틸화는 CpG 디뉴클레오티드에서 시토신 잔기에 메틸 기의 연계를 지칭한다. 이러한 디뉴클레오티드는 일반적으로 유전자1의5' 영역에서 클러스터 (CpG 제도)에서 발견된다. 정상 세포에서는, 이 디뉴클레오티드의 대부분은 DNA 전사를 허용하는 미수정 상태에서 존재합니다. 덧붙여, 많은 암은 과민성 CpG 섬 및 전사체침묵과연관됩니다 2, 특히 종양 억제유전자에서, 이는 차례로암3의각종 특징에 기여합니다.
다른 한편으로는, 긴 산재핵 원소-1 (LINE-1s 또는 L1s)는 일반적으로 CpG 제도에서 메틸화의 상부를 가지고 반복적이고, 전염가능한 DNA 원소이다. LINE-1의 메틸화는 전좌를 방지하고 게놈 무결성을 유지하는 데 도움이 됩니다. 여러 유형의 암에서 LINE-1은 저혈압이 되어 활성화 및 후속 역류 매개 염색체 불안정성을초래합니다 4. LINE-1은 인간 게놈5의거의 17%를 차지하며, 그 메틸화 상태는 글로벌 게놈 메틸화 수준6의지표로서 작용할 수 있다. 글로벌 LINE-1 하부메틸화는 종양 표현형7에대한 세포의 전이보다 선행하는 것으로 간주된다; 그러므로, 그것은 초기 암 개시를 위한 잠재적인 마커로 약속을 보유합니다.
현재, 열화상 분석, 메틸화 특이적 PCR, 마이크로어레이 및 크로마틴면역침전1을포함하는 메틸화 분석을 위한 몇 가지 방법이 있다. 차세대 염기서열 분석의 사용은 또한 DNA 메틸화의 검출에 게놈 전체 접근을 통합하는 가능하게 했습니다. 이러한 방법의 대부분은 비설피테 처리 된 DNA에 의존, 있는 미수정 시토신우라실로 변환되고 메틸화 된 시토신은 변경되지 않은 상태로 유지됩니다. 그러나, 비설피티 처리 된 DNA로 작업하는 것은 우라실로 의 미수정 시토신의 불완전한 변환, 서열의 편향 된 증폭 및 시퀀싱 오류8과같은 몇 가지 함정을 가지고 있다.
메틸화 특이적 프로브 증폭(MSPA)에서, 2개의 올리고뉴클레오티드로 구성된 프로브는 메틸화에 민감한 제한 효소 HhaI 9에대한 제한 부위(GCGC)를 함유하는 DNA 서열을 표적으로 한다. 프로브가 DNA에 혼성화된 후, 각 샘플은 2세트로 나뉩니다. 첫 번째 세트의 프로브는 결찰을 거치고, 두 번째 세트의 프로브는 결찰을 거쳐, 하아I-매개 소화는 미수정 CGCG 부위에서 수행된다. 샘플의 두 세트는 PCR에 의해 증폭되고, 제품은 모세관 전기 동공에 의해 분리됩니다. 미수정 사이트의 프로브는 HhaI에 의해 소화되며 PCR 중에 증폭되지 않아 피크 신호가 생성되지 않습니다. 대조적으로, 메틸화된 부위의 프로브는 소화로부터 보호되고, 따라서 PCR 동안 증폭되어, 이어서 피크신호(10)를생성한다.
MSPA는 대체 방법에 비해 몇 가지 장점이 있습니다. 먼저, 낮은 양의 DNA(50-100 ng)를 필요로 하며 포르말린 고정 파라핀 임베디드샘플(10)으로부터DNA의분석에 적합하다. 그것은 bisulfite 처리된 DNA를 요구하지 않습니다; 사실, 이런 식으로 수정되는 DNA에는 적합하지 않습니다. 많은 견본이 동시에 분석될 수 있고, MSPA 프로브는 다중 유전자 또는 순서를 동시에 표적으로 하도록 디자인될 수 있습니다. 부가적으로, 프로브는 HhaI 제한 부위가 CpG 제도10의전형적인 서열에 대응하기 때문에 메틸화된 DNA에 대해 특이적이고 민감하다.
본 연구는 지방 조직 유래 중간 엽 줄기 세포에서 LINE-1 메틸화에 골육종 (OS)에서 파생 된 세포 외 소포 (EV)의 효과를 조사했다 (AT-MSCs; 그림 1). EV는 대부분의 세포 모형에 의해 분비되는 나노 규모, 막 결합한 소포입니다. 그(것)들은 부모 세포11,12에게서단백질, 지질, mRNA, microRNA 및 추가 분자를 전송합니다. 전기자동차는 세포간 통신을 중재하고 여러 병리생리학적 조건에서 중요한 역할을 한다13,14. 최근 연구에 따르면 암 유래 전기자동차가 활성 LINE-1을 수용자세포(15)로옮길 수 있는 것으로 나타났다. HOS-143B 세포주에서 EV가 다른 유전적 효과16이외에, MSCs에서 LINE-1의 메틸화 상태를 변경할 수 있다는 것이 일찍 보고되었다.
EV 격리를 위한 세포를 성장시킬 때, 성장 배지에 EV 고갈된 태아 소 혈청[FBS]을 사용하는 것이 중요하다, FBS 유래 전기 자동차는 다른 소스로부터 전기자동차를 방해하고 결과를 방해할 수 있기 때문에17,18. 초원심분리는 FBS에서 전기자동차를 고갈시키는 가장 일반적인 방법 중 하나입니다. 그것은 초여과 및 상용 EV 고갈 FBS19와같은 대안에 비해 상대적으로 간단하고 비용 효율적인 절차이다. 여기서, 프로토콜은 또한 초원심분리에 의해 EV 고갈된 FBS를 준비하는 방법을 보여줍니다.
이 문서에서는 OS 세포주에서 EV를 격리하는 것부터 OS-EV 처리 된 MSCs에서 LINE-1의 메틸화 분석에 이르기까지 전술 한 기술에 대한 자세한 프로토콜을 제공합니다(그림 1).
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Protocol
이 연구는 헬싱키 와 우시마 병원 지구의 윤리위원회에 의해 승인되었다 (윤리 승인 D. 217/13/03/02/2015).
1. 초원심분리에 의한 EV 고갈 FBS의 준비
- (울트라) 원심 분리튜브에 FBS를 가지고 초원심분리기 양동이에 넣습니다. 초원심분리가 원활하고 안전하게 작동하도록 하려면 버킷의 균형을 서로 10 mg 이내로 조정하십시오.
- 스윙 로터(SW28, k-factor 246형)에 버킷을 로드합니다. 초원심지에서 로터를 놓고 4 °C에서 19 시간 동안 100,000 x g에서 실행하십시오.
- 조심스럽게 상층 (약 9/10)의 밝은 색상의 상층을 수집하고 50 mL 튜브로 전송합니다. FBS의 EV가 포함되어 있으므로 어두운 갈색 펠릿을 방해하거나 피펫하지 마십시오.
- 상급체를 0.22 μm 필터를 통해 새로운 50 mL 튜브에 전달합니다.
- EV 절연을 위해 세포를 재배할 때 필터 멸균, EV 고갈된 FBS를 세포 배양 배지에 추가합니다.
2. 골육종 유래 전기 의 격리
- 플레이트 OS 세포 (HOS-143B 세포주) RPMI 와 T-175 플라스크 1640 배지, 보충 10% 정상 FBS 와 1% 항생제 (100 U/mL 페니실린, 0.1 mg/mL 연쇄상 구균). 플라스크를 인큐베이터에 37°C 및 5%CO2에놓습니다.
- 플라스크가 70%-80% 콘플루트인 경우, 인산염 완충식염수(PBS)로 세포를 세척한 다음 10% EV 고갈된 FBS(이하 EV 고갈 된 매체)를 함유하는 매체에서 성장시킵니다.
참고: T175 플라스크에 도금된 1 x 106 HOS-143B 셀은 약 60시간 후에 70%의 동률에 도달합니다. - 다음 48 시간 동안, 매 24 시간 후 골육종 세포에서 컨디셔닝 된 매체를 수집하고 신선한 EV 고갈 된 매체를 추가합니다.
- 2500 x g에서 2500 x g에서 20분 동안 4°C에서 원심분리하여 세포 및 세포 이물질을 제거하였다. 상급을 새 튜브로 옮기고 하단에 약 2 mL의 미디어를 남깁니다.
참고: 이 단계에서 EV 격리를 직접 진행하지 않으면 상급체는 -80 oC에 저장할 수 있습니다. - 초원심지 튜브에 상급물을 붓고 더 일찍 균형을 맞추십시오. 4 °C에서 2 시간 동안 100,000 x g에서 튜브를 원심 분리합니다.
- 조심스럽게 상한을 버리고 바닥에 약 1 mL를 남깁니다. 약 20 mL의 PBS (0.1 μm 여과)를 튜브와 피펫에 부드럽게 추가하여 EV 펠릿을 세척하고 다시 놓습니다.
- 튜브의 균형을 맞추고 동일한 설정으로 또 다른 초원심분리를 수행합니다.
- 상급체를 조심스럽게 제거하고 부드러운 파이펫팅으로 PBS의 200 μL에서 EV 펠릿을 다시 일시 중단하십시오. 전기 를 낮은 바인딩 튜브에 보관하십시오.
참고: EV는 필요할 때까지 바로 사용하거나 -80°C에 보관할 수 있습니다.
3. OS-EV의 특성화
참고: 정제된 전기자동차는 서부 블로팅(WB), 나노입자 추적 분석(NTA), 및 투과 전자 현미경(TEM)16을특징으로 할 수 있다.
- EV 마커 CD63, TSG101 및 Hsp70을 사용하여 표준 프로토콜16에 따라 WB를 수행하고, EV샘플(20)의순도를 나타내는 음의 대조군으로 칼넥신을 수행한다.
- NTA의 경우 먼저 EV 샘플을 0.1 μm 여과된 덜베코의 PBS로 희석하여 프레임당 30~100개의 입자를 얻는 것이 좋습니다.
- 시료의 약 500 μL을 1mL 주사기에 넣고 NTA 기기의 입구 포트에 로드합니다. 정확한 측정을 위해 프레임당 충분한 입자가 있는지 확인합니다.
- NTA 소프트웨어를 열고 주변 온도에서 카메라 레벨 13을 사용하여 60초 의 5개의 비디오를 녹화합니다. 분석 중에 검색 임계값 = 5 및 게인 = 10을 사용합니다.
- 앞서21에설명된 대로 TEM별로 EV 샘플을 분석합니다.
4. AT-MSC 문화
참고: 중간엽 줄기 세포 격리를 위한 인간 지방 조직은 지방 흡입 흡인으로 제공되었습니다 (성형 외과, 레이저 Tilkka Ltd., 핀란드). 서면 통보 된 동의는 선택 적 지방 흡입 절차를 겪고있던 lipoaspirate 기증자로부터 취해졌습니다.
- 표준 기계적 및 효소 적 절연 방법을 사용하여 지방 흡입 흡인에서 AT-MSCs를분리22.
참고: 다른 공급원(상용 세포주 포함)의 중식세포도 사용될 수 있다. - DMEM/F-12 배지의 배양 세포는 10% FBS 및 1% 항생제로 보충되었습니다.
5. OS-EV를 가진 양전자의 처리
- 플레이트 15,000 AT-MSCs 당 잘 24 웰 플레이트.
- 24 시간 후, 오래된 매체를 제거하고, PBS로 세포를 세척하고, EV 고갈 된 매체로 변경하십시오.
- 1일째(세포 부착 후 24시간), 3일째(1일차 후 48시간), 5일째(1일차 이후 96시간)에 OS-EV(세포당 1 x 106EV의 입자 농도)로 세포를 치료합니다.
- 1일째에는 시간점(TP) 0 샘플, 3일째에는 TP 3 샘플, 7일째에는 TP 7 샘플(5일째 이후 48시간)에 대한 OS-EV 처리를 중단합니다.
참고: 실험 계획에 따라 다른 시간 점 일정도 따를 수 있습니다.
- 1일째에는 시간점(TP) 0 샘플, 3일째에는 TP 3 샘플, 7일째에는 TP 7 샘플(5일째 이후 48시간)에 대한 OS-EV 처리를 중단합니다.
- 적절한 방법을 사용하여 자식 에서 DNA를 추출하십시오. 데이터 분석을 위해 양수 및 음수 제어 샘플을 포함합니다.
6. LINE-1 메틸화 분석
- 이전에 Pavicic 등23에서수행한 것처럼 사용자 정의 된 LINE-1 프로브 프라이머를 설계하십시오. 메틸화 프로브의 경우, LINE-1의 프로모터 영역 내에서 HhaI 제한 부위를 포함하는 3개의 서열을 선택한다. 제어 프로브의 경우 나머지 LINE-1 시퀀스에서 HhaI 제한 사이트가 없는 7개의 시퀀스를 선택합니다.
참고: LINE-1 시퀀스는 GenBank 데이터베이스 24(L1.2, 액세스 없음)에서 사용할 수 있습니다. AH005269.2). 프로브 설계에 대한 MSPA 제조업체의 지침을 사용합니다25. - TE 완충액에서 DNA 샘플 70 ng를 5 μL 부피로 희석한다.
- 표 1에기재된 바와 같이 후속 열사이클링 및 PCR 단계를 수행합니다. 샘플을 98°C에서 10분 동안 가열한 다음 25°C로 식힙니다.
- 각 샘플에 3 μL의 프로브 혼성화 믹스를 추가하고 열전자전거기를 실행하여 프로브가 DNA에 혼성화될 수 있도록 합니다.
- 실온(RT)에서 각 샘플에 13 μL의 혼성화 후 믹스를 추가합니다. 10 μL을 두 번째 튜브로 옮김.
- 두 세트의 튜브를 열전도선에 놓고 48°C에서 적어도 1분 동안 배양합니다.
- 시료가 48°C에 있는 동안, 제1 튜브 세트(소화되지 않은 계열)에 결찰 혼합물의 10 μL을 추가하고, 결찰-소화 혼합물의 10 μL을 제2 튜브 세트(소화 계열)에 첨가한다. 다음 열자전거 프로그램을 실행합니다.
- 튜브를 스핀다운하고 동시에 써모사이클러를 72°C로 설정합니다.
- 각 튜브에 5 μL의 폴리머라제 믹스를 넣고 튜브를 열전자전거에 넣습니다. PCR 프로그램을 실행합니다.
- PCR 프로그램이 실행되는 동안 2.5 μL 크기의 표준이 포함된 1mL 포름아미드 용액을 준비합니다. 이 용액의 파이펫 10 μL은 광학 96 웰 플레이트(바코드 사용)의 각 웰에 대해.
- PCR 후, 소화되지 않은 샘플을 초순수에서 각각 1:100 및 1:200으로 희석합니다. 희석된 PCR 제품 2 μL을 96웰 플레이트에 추가합니다. 15-20s에 대한 200 x g의 플레이트를 원심 분리하여 기포를 제거합니다.
- 모세관 전기 동공에 의한 시료의 단편 분석을 수행합니다.
참고 : 플레이트는 분석 될 때까지 어둠 속에서 4 °C에서 보관해야합니다.
7. 조각 데이터 분석
- 모세관 전기 동공결과를 열면 전기 포로그램 분석 소프트웨어가 생성됩니다.
- 패널 열 아래에서 샘플 중 하나에 대해 메뉴에서 MLPA를 선택합니다. 패널 헤더를 클릭하고 Ctrl+D를 눌러 모든 샘플에 MLPA를 적용합니다.
- 같은 방법으로 모든 샘플에 대해 분석 메서드를 Microsatellite 기본값으로 설정합니다.
- 모든 샘플을 선택하고 녹색 재생 버튼을 클릭하여 선택한 설정에 따라 샘플을 분석합니다.
- 모든 샘플을 선택하고 그래프 버튼을 클릭하여 프로브 피크를 시각화합니다.
- 개별 프로브 피크의 더 높은 해상도를 위해 피크 영역을 확대합니다. LINE-1 프로브 믹스의 프로브에 해당하는 10개의 피크가 모두 레이블이 지정되어 있는지 확인합니다. 추가 피크(<95 bp 및 >160 bp)를 폐기합니다.
- 유전자형 탭에서 결과를 CSV(쉼표 구분값) 형식으로 내보냅니다.
- 데이터 분석 소프트웨어에서 CSV 파일을 열고 데이터를 열로 정렬합니다.
- 대략적인 크기(L1-1m에서 153bp, L1-2m에서 119bp, L1-3m에서 133bp)를 기준으로 세 개의 메틸화 부위 피크에 라벨을 붙입니다. 나머지 7개의 피크는 제어 프로브에 해당합니다.
참고: 여기서, L1-2m 프로브 피크의 값은 117 bp의 크기를 가지며, 그 영역은 대부분의 LINE-1 메틸화검소(23)에서사용되었기 때문에 사용된다. - 각 샘플(소화되지 않고 소화되지 않은)에 대해 7개의 제어 피크의 합계 피크 영역을 계산합니다. 각 LINE-1 프로브의 피크 면적을 이 합계로 나눕니다.
- 각 DNA 샘플에 대해, 다음 방정식을 사용하여 소화된 샘플의 값을 소화되지 않은 샘플의 값으로 나누어 메틸화 투여량 비(DM)를얻습니다.
여기서: DM은 메틸화 투여비이고, Ax는 피크 x(예를 들어, L1-2m 피크) 하에서 영역이며, Actrl은 모든 7개의 제어 프로브의 합계 피크 영역이다.
- 대략적인 크기(L1-1m에서 153bp, L1-2m에서 119bp, L1-3m에서 133bp)를 기준으로 세 개의 메틸화 부위 피크에 라벨을 붙입니다. 나머지 7개의 피크는 제어 프로브에 해당합니다.
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Representative Results
본 연구의 주요 목표는 MSC에 대한 OS-EV의 후생유전학적 효과를 평가하는 것이었다. 일반적인 EV 마커 CD63, Hsp70 및 TSG101의 표현은 OS-EV의 존재를 확인하였다. (그림2A). 칼넥신 신호의 부재는 OS-EV 분리물의 순도를 나타냈다. 순도의 추가 표시는 TEM으로 관찰되었고, 다양한 크기의 온전한 소포가 존재하였다(도2B). 평균 OS-EV 입자 농도는 7.63x10 11/mL(도2C)이었다. 전기자동차의 크기 분포는 50-500 nm에 속했으며, 입자의 약 80%가 50-200nm범위(그림2D)내에 속합니다.
AT-MSCs는 OS-EV로 처리되었고 DNA는 상이한 시점에서 MCS로부터 추출되었다. LINE-1 메틸화는 MS-MLPA에 의해 분석되었고 메틸화 투여비의 관점에서 계산되었다. TP 0으로부터의 결과는 기준선 메틸화 수준(파선)을 결정하기 위해사용되었다(그림 3). TP3(녹색 기둥)에서, OS-EV로 치료할 때 평균 LINE-1 메틸화 투여비의 감소가 MCS에서 관찰되었고, 기준선 메틸화 수준 이하로 떨어졌다. 이러한 저하저체술 현상은 TP 7(청색 컬럼)에서 더 미묘했으며, 평균 메틸화 투여량비는 기준선에 비해 치료되지 않은 및 EV 처리 된 식용 자식 모두에서 약간 높았다.
그림 1: 실험 워크플로우. EV는 차동 원심분리에 의해 HOS-143B 세포로부터 분리되었고, 서쪽 블로팅, TEM 및 NTA를 특징으로 한다. AT-MSCs는 상이한 시점(TP 0, 3, 7)에서 OS-EV로 처리하였다. DNA를 MSPC로부터 추출하고 LINE-1 메틸화를 MSPA에 의해 분석시켰다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 전기 자동차의 특성화. (A) EV 마커 CD63, Hsp70 및 TSG101의 존재는 서부 블로팅에 의한 EV의 존재를 확인했으며, 칼넥신에 대한 밴드는 관찰되지 않았으며, EV 분리의 순도를 나타낸다. 10 μg의 단백질을 HOS-143B 단백질 용해및 OS-EV 모두에 대해 적재하였다. (b) TEM은 분리된 다양한 크기의 온전한 EV의 존재를 확인하였다. (c) OS-EV의 입자 농도 및 (D) 크기 분포는 NTA 측정에 의해 결정되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: MSC에서 LINE-1의 메틸화 투여비는 치료되지 않거나 OS-EV로 처리하였다. 파선 회색 선은 TP 0 값에 해당하는 기준선 메틸화 값을 나타냅니다. 녹색 컬럼은 TP 3 샘플에 대한 OS-EV 처리없이 평균 메틸화 투여 비율을 나타내며 파란색 컬럼은 TP 7 샘플에 대해 동일합니다. 둘 다 TP 3 및 TP 7 샘플OS-EV로 처리 한 후 메틸화 수준이 감소하는 것으로 나타났다. 그러나, 차이는 EV 처리 후에 메틸화 수준이 또한 기준선 값 보다는 더 낮았던 TP 3 견본에서 더 컸다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
표 1: MSPA 시약 혼합 레시피 및 열사이클러/PCR 프로그램. 언급된 부피가 1개의 DNA 견본을 나타냅니다. 이 단계에서 튜브의 두 세트가 있기 때문에 중합효소 혼합은 이전 혼합물로 2 배 많은 샘플을 위해 제조되어야한다는 점에 유의해야한다. 후속 열자전거 또는 PCR 프로그램의 세부 사항은 오른쪽에 제공됩니다.
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Discussion
이 연구는 MSPA가 특정 유전 요소의 메틸화 상태를 감지하고 정량화하는 데 어떻게 사용될 수 있는지를 보여줍니다. LINE-1은 여기서 초점이 되었지만, 프로브는 다양한 유전자 및 서열을 표적으로 하도록 설계될 수 있다. 또한 다양한 응용 분야에서 사용할 수 있는 프로브 믹스 목록이 늘어나고 있습니다. MSPA는 바이설피테변환(10)을필요로 하지 않는 DNA 메틸화 분석을 위한 간단하고 견고한 기술이다. 샘플 준비에서 데이터 분석에 이르는 전체 절차는 약 2일이 걸리지만 실제 실습 작업은 4-5시간정도소요됩니다. 여기에서 설명한 바와 같이 소량의 DNA(최저 70ng)에 적용할 수 있습니다.
메틸화 분석 프로토콜의 가장 중요한 부분은 본 연구에서 LINE-1 프로브-믹스와 같은 맞춤형 프로브 믹스의 제조이다. 그들의 상이한 길이 때문에, LINE-1 프로브 올리고뉴클레오티드는 4-40 nM의 범위에서 합성되었고, 그래서 용해 단계 및 후속 희석은 제조사의 지침25에따라 신중하게 수행되어야 했다. 여기에 사용되는 프로토콜의 PCR 및 여러 열 자전거 프로그램은 원래 제조업체 버전의 프로그램과 다릅니다.
HhaI 효소와 관련된 몇 가지 예방 조치가 있습니다. 첫째, 결찰-소화 혼합에 사용되는 효소의 부피는 제조업체에 따라 다르며, 열 불활성화에 강한 효소의 버전은 MSPA에 적합하지 않습니다. 몇몇 효소를 가진, 불완전한 소화의 인스턴스가 있을지도 모릅니다, 결함이 있는 PCR 제품 및 비정상적인 피크 신호의 대형 귀착될 것입니다. 마지막으로, 모세관 전기 동극을 위해 최종 PCR 제품이 희석되는 정도는 프로브에 달려 있습니다. 초기 실행에는 다양한 희석을 테스트하는 것이 권장되는 최적화가 포함될 수 있습니다.
하I매개 DNA 소화의 선택적 성질과 같은 MSPA의 특정 제한사항이 있다. 하 ((하) 나는 단지 methythylated GCGC 서열에서 DNA를 절단하고 그들이 CpG 섬 내에있는 경우에도, G와 C에 의해 동봉되지 않는 CpG 디뉴클레오티드의 다른 인스턴스를 무시합니다. 그 결과, 이러한 디뉴클레오티드(및 프로브의 표적 서열 외부에 위치한 것)의 메틸화 상태를 결정할 수 없다. LINE-1 프로브-혼합은 프로모터영역(24)으로부터의추가 GCGC 서열을 포함하는 더 많은 프로브를 포함할 수 있으며, 이에 따라 더 많은 수의 메틸화 부위를 나타내고 있다.
대안적으로, SacII 및 MluI과 같은 다른 메틸화 특이적 제한 효소는, 하I와는다른 제한 부위를 가지고 있으며, 이는 MSPA에서 추가로 사용될 수 있으며, 이는 글로벌 메틸화 수준26의광범위한 표현을 제공할 수 있다. 둘째, TP와 관찰 7 샘플, 메 틸 화 복용량 비율의 차이 매우 미묘한 수 있습니다. 이것은 일반적인 조건 하에서 글로벌 메틸화의 상부를 가지고 있고 주로 몇몇 CpG 사이트에 있는 과도 hypomethylation 사건에 의해 영향을 받지 않을 것이다 게놈5에있는 LINE-1s의 높은 사본 수 때문일 지도 모릅니다. 더욱이, 중간식 세포는 기저선 메틸화 값에 영향을 미칠 수 있는 분화 단계 및 세포 주기의 관점에서 이질적이다. 마지막으로, MSPA는 DNA 메틸화에 있는 상대적인 다름을 검출할 수 있고 이 이유를 위한 참고 견본을 요구합니다. 이러한 예에서, 국소 메틸화를 직접 검출하는 방법은 바이설피테 변환단계(27)를요구할 수 있지만 더 적합할 수 있다.
이 연구는 세포외 소포의 사용을 관련시켰기 때문에, 우리는 또한 EV 격리를 위한 세포 배양 매체의 필수적인 분대인 EV 고갈된 FBS의 준비를 설명했습니다. 초원심분리는 전기 자동차를 FBS의 나머지 부분과 효과적으로 분리할 수 있는 저렴한 공정입니다. 그러나, 원심분리의 19 시간은 초여과 및 상용 버전19와같은 대안보다 더 많은 시간이 소요되는 방법을 만든다. 초원심분리는 원심분리 전에 튜브를 밸런싱하고 이후에 상수를 수집할 때와 같은 시료의 신중한 취급이 필요합니다. 이러한 어려움에도 불구하고, 그것은 생물학적 유체에서 전기 를 분리하기위한 인기있는 방법입니다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없다.
Acknowledgments
이 작품은 헬싱키 대학 프로젝트 기금 (WBS490302, WBS73714112) 헬싱키 대학 병원 주립 대학 수준의 건강 연구를위한 자금 (Y1014SUL05, TYH2016130), 핀란드 - 노르웨이 의학 재단, 셀마및 셀마에 의해 지원되었다 마자 리사 실란더 기금 (미네르바 재단). 우리는 수정 된 MSPA 프로토콜을 제공하고 관련 기술 지원을 위해 월터 파비치에게 감사드립니다. 비디오 제작을 도와주신 티무 마살린(헬싱키 대학교)에게 감사드립니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL syringe | Terumo | SS+01T1 | for NTA |
| 24-well plate | Corning | 3524 | MSC cell culture |
| 3730xl DNA Analyzer | Applied Biosystems, ThermoFisher Scientific | 3730XL | |
| 50 mL centrifuge tube | Corning | 430829 | |
| Beckman Optima LE-80K Ultracentrifuge | Beckman | ||
| BlueStar Prestained Protein Marker | Nippon Genetics | MWP03 | WB: protein marker |
| Calnexin (clone C5C9) | Cell Signaling Technology | 2679 | WB, dilution 1:800 |
| CD63 (clone H5C6) | BD Biosciences | 556019 | WB, dilution 1:1000 |
| Centrifuge 5702 R | Eppendorf | 5703000010 | For conditioned media and cells |
| Centrifuge 5810 | Eppendorf | 5810000010 | For spinning down 96-well plate |
| Centrifuge tube (polyallomer, 14x95 mm) | Beckman | 331374 | Ultracentrifugation |
| DMEM/F-12 + GlutaMAX medium | Gibco, Life Technologies | 31331-028 | For AT-MSC culture |
| Fetal bovine serum | Gibco, Life Technologies | 10270-106 | |
| GeneScan 500 LIZ size standard | Applied Biosystems, Life Technologies | 4322682 | for capillary electrophoresis |
| GenomePlex Complete Whole Genome Amplification (WGA) Kit | Sigma | WGA2-10RXN | for MSPA negative control |
| Hi-Di formamide | Applied Biosystems, Life Technologies | 4311320 | for capillary electrophoresis |
| HOS-143B cell line | ATCC | CRL-8303 | |
| Hsp70 (clone 5G10) | BD Biosciences | 554243 | WB, dilution 1:1000 |
| IRDye 800CW Goat anti-mouse | Li-Cor | 926-32210 | WB: secondary |
| IRDye 800CW Goat anti-rabbit | Li-Cor | 926-32211 | WB: secondary |
| LINE-1 probe-mix primers | IDT | Sequences in Table 1 | |
| MicroAmp Optical 96-well reaction plate with barcode | Applied Biosystems, Life Technologies | 4306737 | also requires sealing film |
| Micro BCA Protein Assay kit | ThermoFisher Scientific | 23235 | measure protein concentration |
| MiniProtean TGX 10% gels | Bio-Rad | 456-1034 | WB: gel electrophoresis |
| NanoSight LM14C | Malvern Instruments | for NTA | |
| Nitrocellulose membrane 0.2 µm | Bio-Rad | 1620112 | WB: protein transfer |
| NucleoSpin Tissue XS | Macherey-Nagel | 740901.50 | for DNA extraction |
| Odyssey Blocking Buffer | Li-Cor | 927-40000 | WB: blocking, antibodies |
| PBS, 1X | Corning | 21-040-CVR | |
| Penicillin-streptomycin | Gibco, Life Technologies | DE17-602E | Antibiotics for culture media |
| Protein LoBind tube, 0.5 mL | Eppendorf | 22431064 | For storing Evs |
| REVERT Total Protein Stain and Wash Solution Kit | Li-Cor | 926-11015 | WB: total protein staining |
| RKO cell line | ATCC | CRL-2577 | for MSPA positive control |
| RPMI medium 1640 + GlutaMAX | Gibco, Life Technologies | 61870-010 | For HOS-143B cell culture |
| SALSA MLPA HhaI enzyme | MRC-Holland | SMR50 | |
| SALSA MLPA reagent kit | MRC-Holland | EK1-FAM | |
| SALSA MLPA P300 probe-mix | MRC-Holland | P300-100R | |
| Swinging rotor SW-28 | Beckman Coulter | 342207 | Ultracentrifugation |
| Syringe filter, 0.22 µm | Jet Biofil | FPE-204-030 | sterile filtering FBS |
| Tecnai 12 | FEI Company | equipped with Gatan Orius SC 1000B CCD-camera (Gatan Inc., USA); for TEM |
|
| TBS, 1X tablets | Medicago | 09-7500-100 | WB: buffer |
| Trans-Blot Turbo | Bio-Rad | WB: transfer | |
| Thermal cycler | ThermoFisher Scientific | TCA0096 | |
| TrypLE Express | Gibco | 12604-021 | for trypsinization of cells |
| TSG101 (clone 4A10) | Sigma | SAB2702167 | WB, dilution 1:500 |
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