Summary
Hier beschreven is het gebruik van een methylatie-specifieke sonde versterking methode om methylatie niveaus van LINE-1 elementen te analyseren in mesenchymale stamcellen behandeld met osteosarcoom-afgeleide extracellulaire blaasjes. Ultracentrifugation, een populaire procedure voor het scheiden van extracellulaire blaasjes van foetaal runderserum, wordt ook aangetoond.
Abstract
Methylatie-specifieke sondeversterking (MSPA) is een eenvoudige en robuuste techniek die kan worden gebruikt om relatieve verschillen in methylatieniveaus van DNA-monsters te detecteren. Het is vindingrijk, vereist kleine hoeveelheden DNA, en duurt ongeveer 4-5 uur hands-on werk. In de gepresenteerde techniek worden DNA-monsters eerst gedenatureerd en vervolgens gehybridiseerd tot sondes die dna richten op gemethyleerde of referentielocaties als controle. Gehybridiseerd DNA wordt gescheiden in parallelle reacties, de ene ondergaat alleen ligatie en de andere ondergaat ligatie gevolgd door HhaI-gemedieerde spijsvertering bij niet-gemethyleerde GCGC sequenties. De resulterende DNA-fragmenten worden versterkt door PCR en gescheiden door capillaire elektroforese. Gemethyleerde GCGC-sites worden niet verteerd door HhaI en produceren pieksignalen, terwijl niet-gemethyleerde GCGC-locaties worden verteerd en er geen pieksignalen worden gegenereerd. Het vergelijken van de controle-genormaliseerde pieken van verteerd en onverteerd versies van elk monster biedt de methylatie dosering verhouding van een DNA-monster. Hier wordt MSPA gebruikt om de effecten van osteosarcoom-afgeleide extracellulaire blaasjes (EV's) op de methylatiestatus van lang gestrooid nucleair element-1 (LINE-1) in mesenchymale stamcellen te detecteren. LINE-1s zijn repetitieve DNA-elementen die meestal hypomethylatie ondergaan bij kanker en, in deze hoedanigheid, kunnen dienen als biomarker. Ultracentrifugation wordt ook gebruikt als een kosteneffectieve methode om extracellulaire blaasjes te scheiden van biologische vloeistoffen (d.w.z. bij de voorbereiding van EV-uitgeput foetaal runderserum [FBS] en het isoleren van EV's van osteosarcoom geconditioneerde media [differentiële centrifugatie]). Voor methylatieanalyse zijn aangepaste LINE-1-sondes ontworpen om zich te richten op drie methylatielocaties in de LINE-1-promotorreeks en zeven controlelocaties. Dit protocol toont het gebruik van MSPA voor LINE-1 methylatieanalyse en beschrijft de voorbereiding van EV-uitgepute FBS door ultracentrifugation.
Introduction
DNA-methylatie is een belangrijke epigenetische modificatie die zich in menselijke cellen. DNA-methylatie verwijst naar de koppeling van methylgroepen aan cytosineresiduen in CpG dinucleotiden. Dergelijke dinucleotiden worden meestal gevonden in clusters (CpG-eilanden) op de 5 'regio van genen1. In normale cellen bestaan de meeste van deze dinucleotiden in een niet-gemethyleerde toestand, waardoor DNA-transcriptie mogelijk is. Overigens worden veel kankers geassocieerd met hypermethylated CpG-eilanden en transcriptomic silencing2, vooral in tumorsuppressor genen, die op hun beurt bijdragen aan verschillende kenmerken van kanker3.
Aan de andere kant zijn lang gestrooide nucleaire elementen-1 (LINE-1's of L1's) repetitieve, omzetbare DNA-elementen die normaal gesproken hoge niveaus van methylatie hebben op CpG-eilanden. Methylatie van LINE-1 voorkomt translocatie en helpt de genoomintegriteit te behouden. Bij verschillende vormen van kanker wordt LINE-1 verondersteld, wat resulteert in activering en daaropvolgende retroomzetting-gemedieerde chromosomale instabiliteit4. LINE-1 is goed voor bijna 17% van het menselijk genoom5, en de methylatiestatus kan dienen als indicator van de wereldwijde genomische methylatieniveaus6. Globale LINE-1 hypomethylatie wordt geacht vooraf te gaan aan de overgang van cellen naar een tumorfenotype7; daarom, het houdt belofte als een potentiële marker voor het begin van vroege kanker.
Momenteel zijn er verschillende methoden voor methylatie-analyse, waaronder pyrosequencing, methylatie-specifieke PCR, microarrays, en chromatine immunoprecipitatie1. Het gebruik van next-generation sequencing heeft het ook mogelijk gemaakt om genoombrede benaderingen voor detectie van DNA-methylatie op te nemen. Veel van deze methoden zijn afhankelijk van bisulfiet-behandeld DNA, waarbij niet-gemethyleerde cytosinen worden omgezet in uracil en gemethyleerde cytosinen ongewijzigd blijven. Echter, het werken met bisulfiet-behandeld DNA heeft verschillende valkuilen, zoals onvolledige omzettingen van niet-gemethyleerde cytosines uracil, bevooroordeelde versterking van sequenties, en sequencing fouten8.
In methylatie-specifieke sondeversterking (MSPA) richten sondes bestaande uit twee oligonucleotiden zich op DNA-sequenties die een beperkingsplaats (GCGC) bevatten voor het methylatiegevoelige beperkingsenzym HhaI9. Nadat de sondes hybridiseren naar DNA, wordt elk monster verdeeld in twee sets. Sondes in de eerste set ondergaan ligatie, terwijl sondes in de tweede set ondergaan ligatie gevolgd door HhaI-gemedieerde spijsvertering op niet-gemethyleerde CGCG sites. Beide sets van monsters worden vervolgens versterkt door PCR, en de producten worden gescheiden door capillaire elektroforese. Sondes op niet-gemethyleerde locaties worden verteerd door HhaI en worden niet versterkt tijdens PCR, wat resulteert in geen pieksignalen. Sondes op gemethyleerde locaties zijn daarentegen beschermd tegen de spijsvertering en worden daarom versterkt tijdens PCR, waardoor pieksignalen worden opgevangen10.
MSPA heeft verschillende voordelen ten opzichte van alternatieve methoden. Ten eerste vereist het een lage hoeveelheid DNA (50-100 ng) en is het zeer geschikt voor de analyse van DNA uit formaline-vaste paraffine ingebedde monsters10. Het vereist geen bisulfiet-behandeld DNA; in feite is het ongeschikt voor DNA dat op deze manier wordt gewijzigd. Veel monsters kunnen tegelijkertijd worden geanalyseerd en MSPA-sondes kunnen zodanig worden ontworpen dat ze meerdere genen of sequenties tegelijk targeten. Bovendien zijn de sondes specifiek en gevoelig voor gemethyleerd DNA omdat de HhaI-beperkingssite overeenkomt met een sequentie die typisch is voor CpG-eilanden10.
Deze studie onderzocht de effecten van osteosarcoom (OS)-afgeleide extracellulaire blaasjes (EV's) op LINE-1-methylatie in vetweefsel-afgeleide mesenchymale stamcellen (AT-MSCs; Figuur 1). EV's zijn nanoschaal, membraangebonden blaasjes die door de meeste celtypen worden afgescheiden. Ze dragen eiwitten, lipiden, mRNA, microRNA en extra moleculen uit oudercellen11,12. EV's bemiddelen intercellulaire communicatie en spelen belangrijke rollen in verschillende pathofysiologische omstandigheden13,14. Een recente studie toonde aan dat kanker-afgeleide EV's actieve LINE-1 kunnen overbrengen naar ontvanger cellen15. Eerder is gemeld dat EV's van de HOS-143B-cellijn de methylatiestatus van LINE-1 in MMC's kunnen veranderen, naast andere genetische effecten16.
Bij het kweken van cellen voor EV-isolatie is het belangrijk om EV-uitgeput foetaal runderserum [FBS] te gebruiken in het groeimedium, aangezien fbs-afgeleide EV's EV's uit andere bronnen kunnen verstoren en de resultaten kunnen belemmeren17,18. Ultracentrifugation is een van de meest voorkomende methoden voor het afbreken van EV's van FBS. Het is een relatief eenvoudige en kosteneffectieve procedure in vergelijking met alternatieven zoals ultrafiltratie en commerciële EV-uitgeputfbs19. Hier laat het protocol ook zien hoe ev-uitgeputte FBS voor te bereiden door ultracentrifugation.
Dit artikel bevat een gedetailleerd protocol voor de bovengenoemde technieken, van isolatie van EV's van een OS-cellijn tot de methylatieanalyse van LINE-1 in OS-EV behandelde MDO's (figuur 1).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Deze studie werd goedgekeurd door de Ethische Commissie van Helsinki en Uusimaa Hospital District (ethische goedkeuring D. 217/13/03/02/2015).
1. Voorbereiding van EV-uitgeputte FBS door ultracentrifugation
- Neem FBS in (ultra)centrifugebuizen en plaats ze in ultracentrifugeemmers. Om ervoor te zorgen dat de ultracentrifugation soepel en veilig verloopt, balanceer t anderzijds de emmers binnen 10 mg van elkaar.
- Laad de emmers op een swingende rotor (type SW28, k-factor 246). Plaats de rotor in de ultracentrifuge en ren op 100.000 x g voor 19 uur bij 4 °C.
- Verzamel voorzichtig de lichtgekleurde bovenste laag van de supernatant (ongeveer negen tienden) en breng over op een buis van 50 mL. Verstoor of pipet de donkerbruine pellet niet, want het bevat EV's van FBS.
- Geef de supernatant via een 0,22 μm filter door in een nieuwe buis van 50 mL.
- Voeg de filtergesteriliseerde, EV-uitgeputte FBS toe aan celkweekmedia bij het kweken van cellen voor EV-isolatie.
2. Isolatie van osteosarcoom-afgeleide EV's
- Plate OS cellen (HOS-143B cellijn) in een T-175 kolf met RPMI 1640 medium, aangevuld met 10% normale FBS en 1% antibiotica (100 U/mL penicilline, 0,1 mg/mL streptomycine). Plaats de kolf in een couveuse op 37 °C en 5% CO2.
- Wanneer de kolf 70%-80% confluent is, was tik de cellen met fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) en kweek ze vervolgens in media met 10% EV-uitgepute FBS (hierna "EV-uitgeputte media" genoemd).
OPMERKING: 1 x 106 HOS-143B cellen verguld in een T175 kolf bereikt 70% samenvloeiing na ongeveer 60 uur. - Tijdens de volgende 48 uur, verzamelen geconditioneerde media van osteosarcoom cellen na elke 24 uur en voeg verse EV uitgeput media.
- Centrifugeer de geconditioneerde media met 2500 x g gedurende 20 min bij 4 °C om cellen en celvuil te verwijderen. Breng de supernatant naar een nieuwe buis, waardoor ongeveer 2 mL van de media aan de onderkant.
LET OP: Als het in dit stadium niet direct doorgaat met EV-isolatie, kan de supernatant worden opgeslagen bij -80 oC. - Giet de supernatant in ultracentrifugebuizen en balanceer ze zoals eerder. Centrifugeer de buizen op 100.000 x g gedurende 2 uur bij 4 °C.
- Gooi voorzichtig de supernatant weg, waardoor ongeveer 1 mL aan de onderkant overblijft. Voeg ongeveer 20 mL PBS (0,1 μm gefilterd) toe aan de buis en pipet voorzichtig om de EV-pellet te wassen en opnieuw op te schorten.
- Balanceer de buizen en voer nog een ronde van ultracentrifugation uit met dezelfde instellingen.
- Verwijder voorzichtig de supernatant en brep de EV pellet in 200 μL PBS door zachte pipetteren. Bewaar de EV's in laaggebonden buizen.
LET OP: EV's kunnen meteen worden gebruikt of anders opgeslagen in -80 °C totdat ze nodig zijn.
3. Karakterisering van OS-EV's
OPMERKING: Gezuiverde EV's kunnen worden gekenmerkt door western blotting (WB), nanoparticle tracking analysis (NTA) en transmission electron microscopy (TEM)16.
- Voer WB volgens het standaard protocol16 met EV markers CD63, TSG101 en Hsp70, en met calnexine als een negatieve controle om de zuiverheid van de EV monster20aan te geven .
- Voor NTA, eerst verdunnen van de EV monster in 0,1 μm gefilterd Dulbecco's PBS te verkrijgen (idealiter) 30-100 deeltjes per frame.
- Neem ongeveer 500 μL van het monster in een spuit van 1 mL en laad het in de inlaatpoort van het NTA-instrument. Controleer of er voldoende deeltjes per frame zijn, voor nauwkeurige metingen.
- Open de NTA-software en neem vijf video's van 60 s duur op, met behulp van cameraniveau 13 bij omgevingstemperatuur. Gebruik tijdens de analyse detectiedrempel = 5 en gain = 10.
- Analyseer EV-monsters door TEM zoals eerder beschreven21.
4. AT-MSC cultuur
OPMERKING: Menselijk vetweefsel voor mesenchymale stamcelisolatie werd geleverd als liposuctie aanzuiging (Department of Plastic Surgery, Laser Tilkka Ltd., Finland). Schriftelijke geïnformeerde toestemming werd genomen van de lipoaspiraat donoren, die werden ondergaan electieve liposuctie procedures.
- At-MDO's isoleren van liposuctieaspiraten met behulp van standaard mechanische en enzymatische isolatiemethoden22.
OPMERKING: MPC's uit andere bronnen (waaronder commerciële cellijnen) kunnen ook worden gebruikt. - Kweekcellen in DMEM/F-12 media aangevuld met 10% FBS en 1% antibiotica.
5. Behandeling van MDO's met OS-EV's
- Plaat 15.000 AT-MsCs per put in een 24 put plaat.
- Na 24 uur, verwijder de oude media, was cellen met PBS, en over schakelen naar EV-uitgeputmedia.
- Behandel cellen met OS-EV's (bij een deeltjesconcentratie van 1 x 106 EV's per cel) op dag 1 (24 uur na celhechting), dag 3 (48 uur na dag 1) en dag 5 (96 uur na dag 1).
- Stop de OS-EV behandeling voor timepoint (TP) 0 monsters op dag 1, TP 3 monsters op dag 3 en TP 7 monsters op dag 7 (48 uur na dag 5).
OPMERKING: Andere tijdschema's volgens de experimentele plannen kunnen ook worden gevolgd.
- Stop de OS-EV behandeling voor timepoint (TP) 0 monsters op dag 1, TP 3 monsters op dag 3 en TP 7 monsters op dag 7 (48 uur na dag 5).
- Haal DNA uit de MCC's met behulp van een geschikte methode. Neem positieve en negatieve controlemonsters op voor de gegevensanalyse.
6. TEST VAN DE OPSTELLING VAN DE METHYLATIE
- Ontwerp de aangepaste LINE-1 sonde primers, zoals eerder gedaan door Pavicic et al.23. Selecteer voor methylatiesondes drie sequenties met de HhaI-beperkingssite binnen het promotorgebied van LINE-1. Selecteer voor besturingssondes zeven sequenties die de HhaI-beperkingssite missen uit de rest van de LINE-1-reeks.
OPMERKING: De LINE-1-reeks is beschikbaar in de GenBank-database24 (L1.2, toetredingsnummer. AH005269.2). Gebruik de instructies van de MSPA fabrikant voor het ontwerpen van de sondes25. - Verdun 70 ng DNA-monster in TE-buffer tot een volume van 5 μL.
- Voer latere thermocycling en PCR stappen uit zoals vermeld in tabel 1. Verwarm de monsters 10 min bij 98 °C en koel vervolgens af tot 25 °C.
- Voeg 3 μL sondehybridisatiemix toe aan elk monster en voer de thermocycler uit om de sondes te laten hybridiseren met het DNA.
- Bij kamertemperatuur (RT) voegt u 13 μL post-hybridisatiemix toe aan elk monster. Breng 10 μL over op een tweede buis.
- Plaats beide sets buizen in de thermocycler en uitbroed minstens 1 min op 48 °C.
- Terwijl de monsters op 48 °C staan, voegt u 10 μL van het ligatiemengsel toe aan de eerste reeks buizen (onverteerde reeksen) en 10 μL van het ligatie-vergistingsmengsel aan de tweede reeks buizen (verteerde reeks). Voer het volgende thermocycler programma uit.
- Draai de buizen naar beneden en stel tegelijkertijd de thermocycler in op 72 °C.
- Voeg 5 μL polymerasemix toe aan elke buis en plaats de buizen in de thermocycler. Voer het PCR-programma uit.
- Terwijl het PCR-programma wordt uitgevoerd, bereidt u een oplossing voor van 1 mL formamide met een standaard van 2,5 μL formaat. Pipetteer 10 μL van deze oplossing voor elke put van een optische 96 putplaat (met barcode).
- Verdun na PCR de onverteerde en verteerde monsters tot respectievelijk 1:100 en 1:200 in ultrazuiver water. Voeg 2 μL verdund PCR-product toe aan de 96 putplaat. Centrifugeer de plaat op 200 x g voor 15-20 s om luchtbellen te verwijderen.
- Voer fragmentanalyse uit van monsters door capillaire elektroforese.
LET OP: De plaat moet tot analyse bij 4 °C in het donker worden bewaard.
7. Fragmentgegevensanalyse
- Open de capillaire elektroforese resultaten in een elektropherogram analyse software.
- Kies mlpa in het menu onder de kolom Paneel voor een van de voorbeelden. Klik op de koptekst van het deelvenster en druk op Ctrl+D om MLPA toe te passen op alle voorbeelden.
- Stel op dezelfde manier de analysemethode in op Microsatellite default voor alle monsters.
- Selecteer alle voorbeelden en klik op de groene afspeelknop om de samples te analyseren volgens de gekozen instellingen.
- Selecteer alle voorbeelden en klik op de knop Grafiek om de sondepieken te visualiseren.
- Zoom in op het piekgebied voor een hogere resolutie van de individuele sondepieken. Zorg ervoor dat alle 10 pieken die overeenkomen met de sondes van de LINE-1 probe-mix zijn gelabeld. Extra pieken verwijderen (<95 bp en >160 bp).
- Exporteer de resultaten op het tabblad Genotypen in de CSV-indeling (komma-gescheiden waarden).
- Open het CSV-bestand in een gegevensanalysesoftware en sorteer de gegevens in kolommen.
- Label de drie pieken op de methylatieplaats op basis van hun geschatte afmetingen (L1-1m bij 153 bp, L1-2m bij 119 bp, L1-3m bij 133 bp). De resterende zeven pieken komen overeen met de controlesondes.
OPMERKING: Hier worden waarden van de L1-2m sondepieken gebruikt, die een grootte hebben van 117 bp, aangezien die regio is gebruikt in de meeste LINE-1 methylatiestesten23. - Bereken voor elk monster (onverteerd en verteerd) het sompiekgebied van alle zeven controlepieken. Verdeel het piekgebied van elke LINE-1 sonde door deze som.
- Verdeel voor elk DNA-monster de waarde van het verteerdmonster door die van het onverteerd monster om de methylatiedoseringsverhouding (DM)te verkrijgen met behulp van de volgende vergelijking:
Waar: DM is methylatie dosering verhouding, Ax is het gebied onder piek x (bijvoorbeeld, L1-2m piek), en Actrl is de som piek gebied van alle zeven controle sondes.
- Label de drie pieken op de methylatieplaats op basis van hun geschatte afmetingen (L1-1m bij 153 bp, L1-2m bij 119 bp, L1-3m bij 133 bp). De resterende zeven pieken komen overeen met de controlesondes.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Het belangrijkste doel van deze studie was het evalueren van de epigenetische effecten van OS-EV's op MMC's. OS-EV's werden geïsoleerd van HOS-143B cellen met behulp van de standaard differentiële centrifugatie methode. Expressie van de typische EV markers CD63, Hsp70, en TSG101 door westerse blotting bevestigde de aanwezigheid van OS-EV's. (Figuur 2A). Afwezigheid van calnexin signaal aangegeven zuiverheid van de OS-EV isolaat. Bij TEM werd een aanvullende indicatie van zuiverheid waargenomen, waarbij intacte blaasjes van verschillende afmetingen aanwezig waren (figuur 2B). De gemiddelde OS-EV deeltjesconcentratie was 7.63x1011/mL(Figuur 2C). De grootteverdeling van EV's varieerde van 50-500 nm, waarbij ongeveer 80% van de deeltjes binnen het bereik van 50-200 nm(figuur 2D)viel.
AT-MPC's werden behandeld met OS-EV's en DNA werd op verschillende tijdspunten uit de MMC's gehaald. LINE-1 methylatie werd geanalyseerd door MS-MLPA en berekend in termen van methylatie dosering verhouding. De resultaten van TP 0 werden gebruikt om de basismethylatieniveaus (stippellijn)(figuur 3) te bepalen. Bij TP 3 (groene kolommen) werd een daling van de gemiddelde LINE-1-methylatiedoseringsverhouding waargenomen bij mbo's bij behandeling met OS-EV's, die onder het methylatieniveau van de basislijn viel. Dit hypomethylating fenomeen was subtieler bij TP 7 (blauwe kolommen), en de gemiddelde methylatie dosering verhouding was iets hoger in zowel onbehandelde als EV-behandelde MDO's in vergelijking met de basislijn.
Figuur 1: Experimentele werkstroom. EV's werden geïsoleerd uit HOS-143B cellen door differentiële centrifugatie en gekenmerkt door westerse vlekken, TEM en NTA. AT-MPC's werden behandeld met OS-EV's op verschillende tijdpunten (TP 0, 3, een 7). DNA werd gewonnen uit MsCs en LINE-1 methylatie werd geanalyseerd door MSPA. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: Karakterisering van EV's. (A) De aanwezigheid van EV-markers CD63, Hsp70 en TSG101 bevestigde de aanwezigheid van EV's door westerse blotting, terwijl er geen banden werden waargenomen voor calnexine, wat de zuiverheid van het EV-isolaat aangeeft. 10 μg eiwit werd geladen voor zowel HOS-143B eiwit lysaat als OS-EV's. (B) TEM heeft de aanwezigheid van intacte EV's van verschillende groottes in het isolaat bevestigd. (C) De deeltjesconcentratie en (D) de grootteverdeling van OS-EV's werden bepaald door NTA-metingen. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: Methylatiedoseringsverhoudingen van LINE-1 van MMC's die onbehandeld of behandeld zijn met OS-EV's. De stippelgrijze lijn vertegenwoordigt de waarde van de basislijnmethylatie, die overeenkomt met tp 0-waarden. Groene kolommen vertegenwoordigen gemiddelde methylatiedoseringsverhoudingen zonder en met OS-EV-behandeling voor TP 3-monsters, terwijl blauwe kolommen hetzelfde vertegenwoordigen voor TP 7-monsters. Zowel TP 3 als TP 7-monsters vertoonden een afname van het methylatieniveau na behandeling met OS-EV's. Het verschil was echter groter in TP 3-monsters, waarbij het methylatieniveau na de EV-behandeling ook lager was dan de uitgangswaarde. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Tabel 1: MSPA reagens mix recepten en thermocycler / PCR programma's. De genoemde volumes vertegenwoordigen één DNA-monster. Opgemerkt moet worden dat de polymerasemix moet worden voorbereid voor 2x evenveel monsters als eerdere mengsels, omdat er in dit stadium twee sets buizen zijn. Details van het daaropvolgende thermocycling of PCR-programma worden aan de rechterkant verstrekt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Deze studie illustreert hoe MSPA kan worden gebruikt om de methylatiestatus van een specifiek genetisch element op te sporen en te kwantificeren. LINE-1 was hier de focus, maar de sondes kunnen worden ontworpen om een reeks genen en sequenties te richten. Bovendien is er een groeiende lijst van sondemixen beschikbaar voor verschillende toepassingen. MSPA is een eenvoudige en robuuste techniek voor DNA-methylatieanalyse die geen bisulfietconversie vereist10. De volledige procedure van monstervoorbereiding tot gegevensanalyse duurt ongeveer 2 dagen, maar omvat slechts 4-5 uur daadwerkelijk hands-on werk. Het is van toepassing voor kleine hoeveelheden DNA (zo laag als 70 ng), zoals hier aangetoond.
Het belangrijkste onderdeel van het methylatieanalyseprotocol is de voorbereiding van aangepaste sondemixen, zoals de LINE-1 probe-mix in deze studie. Vanwege hun verschillende lengtes werden LINE-1 sonde oligonucleotiden gesynthetiseerd in het bereik van 4-40 nM, dus de ontbindingsstap en de daaropvolgende verdunningen moesten zorgvuldig worden uitgevoerd, volgens de instructies van de fabrikant25. De PCR en verschillende thermocycling programma's van het protocol zoals hier gebruikt verschillen van die in de versie van de oorspronkelijke fabrikant.
Er zijn een paar voorzorgsmaatregelen met betrekking tot het HhaI enzym. Ten eerste is het volume van het enzym dat wordt gebruikt in de ligatie-vergistingsmix afhankelijk van de fabrikant, en versies van het enzym die bestand zijn tegen hitte-inactivatie zijn niet geschikt voor MSPA. Bij sommige enzymen kunnen er gevallen van onvolledige spijsvertering zijn, wat zou resulteren in de vorming van defecte PCR-producten en afwijkende pieksignalen. Ten slotte hangt de mate waarin de uiteindelijke PCR-producten worden verdund voor capillaire elektroforese af van de sondes. Initiële uitvoeringen zijn waarschijnlijk optimalisaties te betrekken, waarvoor het wordt aanbevolen om een reeks verdunningen te testen.
Er zijn bepaalde beperkingen van MSPA, zoals de selectieve aard van HhaI-gemedieerde DNA-vertering. Hha Hha Ik kletter DNA alleen bij niet-gemethyleerde GCGC sequenties en negeer andere gevallen van CpG dinucleotiden die niet zijn omsloten door een G en C, zelfs als ze zich bevinden binnen CpG eilanden. Als gevolg hiervan kan de methylatiestatus van dergelijke dinucleotiden (en die zich buiten de doelsequentie van de sondes bevinden) niet worden bepaald. De LINE-1 probe-mix kan meer sondes bevatten die extra GCGC-sequenties uit het promotorgebied24bevatten, waardoor een groter aantal methylatieplaatsen wordt weergegeven.
Als alternatief kunnen andere methylatiespecifieke beperkingsenzymen, zoals SacII en MluI, die een andere beperkingslocatie hebben dan die van HhaI, bovendien worden gebruikt in MSPA, wat een bredere weergave van de mondiale methylatieniveaus26kan bieden . Ten tweede, zoals waargenomen met TP 7 monsters, de verschillen in methylatie dosering verhouding kan heel subtiel zijn. Dit kan te wijten zijn aan het hoge kopieernummer van LINE-1's in het genoom5, die hoge niveaus van wereldwijde methylatie hebben onder normale omstandigheden en grotendeels zal worden beïnvloed door voorbijgaande hypomethylatiegebeurtenissen in slechts enkele CpG-sites. Bovendien zijn de MDO's heterogeen in termen van het stadium van differentiatie en van de celcyclus, die de basismethylatiewaarde kan beïnvloeden. Ten slotte kan MSPA alleen relatieve verschillen in DNA-methylatie detecteren en om deze reden referentiemonsters nodig hebben. In dergelijke gevallen kunnen methoden die rechtstreeks lokale methylatie detecteren, beter zijn, hoewel zij wellicht de bisulfiteconversiestap27vereisen .
Aangezien deze studie het gebruik van extracellulaire blaasjes betrof, hebben we ook de voorbereiding van EV-uitgeputte FBS aangetoond, een essentieel onderdeel van celkweekmedia voor EV-isolatie. Ultracentrifugation is een goedkoop proces dat EV's effectief kan scheiden van de rest van de FBS. Echter, de 19 uur van centrifugation maakt het een meer tijdrovende methode dan alternatieven, zoals ultrafiltratie en commerciële versies19. Ultracentrifugation vereist ook een zorgvuldige behandeling van het monster, zoals bij het balanceren van de buizen voor centrifugeren en het verzamelen van de supernatant daarna. Ondanks deze uitdagingen is het een populaire methode om EV's te scheiden van biologische vloeistoffen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd gefinancierd door de universiteit van Helsinki projectfinanciering (WBS490302, WBS73714112) Helsinki University Hospital State financiering voor universitair gezondheidsonderzoek (Y1014SUL05, TYH2016130), Fins-Noorse Medical Foundation, en de Selma en Maja-Lisa Selander Fonds (Stichting Minerva). Wij danken Walter Pavicic voor het verstrekken van de gewijzigde MSPA protocol en voor de bijbehorende technische ondersteuning. We zijn Teemu Masalin (Universiteit van Helsinki) dankbaar dat hij ons heeft geholpen met videoproductie.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL syringe | Terumo | SS+01T1 | for NTA |
| 24-well plate | Corning | 3524 | MSC cell culture |
| 3730xl DNA Analyzer | Applied Biosystems, ThermoFisher Scientific | 3730XL | |
| 50 mL centrifuge tube | Corning | 430829 | |
| Beckman Optima LE-80K Ultracentrifuge | Beckman | ||
| BlueStar Prestained Protein Marker | Nippon Genetics | MWP03 | WB: protein marker |
| Calnexin (clone C5C9) | Cell Signaling Technology | 2679 | WB, dilution 1:800 |
| CD63 (clone H5C6) | BD Biosciences | 556019 | WB, dilution 1:1000 |
| Centrifuge 5702 R | Eppendorf | 5703000010 | For conditioned media and cells |
| Centrifuge 5810 | Eppendorf | 5810000010 | For spinning down 96-well plate |
| Centrifuge tube (polyallomer, 14x95 mm) | Beckman | 331374 | Ultracentrifugation |
| DMEM/F-12 + GlutaMAX medium | Gibco, Life Technologies | 31331-028 | For AT-MSC culture |
| Fetal bovine serum | Gibco, Life Technologies | 10270-106 | |
| GeneScan 500 LIZ size standard | Applied Biosystems, Life Technologies | 4322682 | for capillary electrophoresis |
| GenomePlex Complete Whole Genome Amplification (WGA) Kit | Sigma | WGA2-10RXN | for MSPA negative control |
| Hi-Di formamide | Applied Biosystems, Life Technologies | 4311320 | for capillary electrophoresis |
| HOS-143B cell line | ATCC | CRL-8303 | |
| Hsp70 (clone 5G10) | BD Biosciences | 554243 | WB, dilution 1:1000 |
| IRDye 800CW Goat anti-mouse | Li-Cor | 926-32210 | WB: secondary |
| IRDye 800CW Goat anti-rabbit | Li-Cor | 926-32211 | WB: secondary |
| LINE-1 probe-mix primers | IDT | Sequences in Table 1 | |
| MicroAmp Optical 96-well reaction plate with barcode | Applied Biosystems, Life Technologies | 4306737 | also requires sealing film |
| Micro BCA Protein Assay kit | ThermoFisher Scientific | 23235 | measure protein concentration |
| MiniProtean TGX 10% gels | Bio-Rad | 456-1034 | WB: gel electrophoresis |
| NanoSight LM14C | Malvern Instruments | for NTA | |
| Nitrocellulose membrane 0.2 µm | Bio-Rad | 1620112 | WB: protein transfer |
| NucleoSpin Tissue XS | Macherey-Nagel | 740901.50 | for DNA extraction |
| Odyssey Blocking Buffer | Li-Cor | 927-40000 | WB: blocking, antibodies |
| PBS, 1X | Corning | 21-040-CVR | |
| Penicillin-streptomycin | Gibco, Life Technologies | DE17-602E | Antibiotics for culture media |
| Protein LoBind tube, 0.5 mL | Eppendorf | 22431064 | For storing Evs |
| REVERT Total Protein Stain and Wash Solution Kit | Li-Cor | 926-11015 | WB: total protein staining |
| RKO cell line | ATCC | CRL-2577 | for MSPA positive control |
| RPMI medium 1640 + GlutaMAX | Gibco, Life Technologies | 61870-010 | For HOS-143B cell culture |
| SALSA MLPA HhaI enzyme | MRC-Holland | SMR50 | |
| SALSA MLPA reagent kit | MRC-Holland | EK1-FAM | |
| SALSA MLPA P300 probe-mix | MRC-Holland | P300-100R | |
| Swinging rotor SW-28 | Beckman Coulter | 342207 | Ultracentrifugation |
| Syringe filter, 0.22 µm | Jet Biofil | FPE-204-030 | sterile filtering FBS |
| Tecnai 12 | FEI Company | equipped with Gatan Orius SC 1000B CCD-camera (Gatan Inc., USA); for TEM |
|
| TBS, 1X tablets | Medicago | 09-7500-100 | WB: buffer |
| Trans-Blot Turbo | Bio-Rad | WB: transfer | |
| Thermal cycler | ThermoFisher Scientific | TCA0096 | |
| TrypLE Express | Gibco | 12604-021 | for trypsinization of cells |
| TSG101 (clone 4A10) | Sigma | SAB2702167 | WB, dilution 1:500 |
References
- Esteller, M. Cancer epigenomics: DNA methylomes and histone-modification maps. Nature Reviews Genetics. 8, 286-298 (2007).
- Herman, J. G., Baylin, S. B. Gene silencing in cancer in association with promoter hypermethylation. New England Journal of Medicine. 349, 2042-2054 (2003).
- Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of Cancer: The Next Generation. Cell. 144 (5), 646-674 (2011).
- Howard, G., Eiges, R., Gaudet, F., Jaenisch, R., Eden, A. Activation and transposition of endogenous retroviral elements in hypomethylation induced tumors in mice. Oncogene. 27, 404-408 (2008).
- Lander, E. S., et al. Initial sequencing and analysis of the human genome. Nature. 409, 860-921 (2001).
- Rodriguez, J., et al. Chromosomal instability correlates with genome-wide DNA demethylation in human primary colorectal cancers. Cancer Research. 66, 8462 (2006).
- Feinberg, A. P., Ohlsson, R., Henikoff, S. The epigenetic progenitor origin of human cancer. Nature Reviews Genetics. 7, 21-33 (2006).
- Bock, C., et al. BiQ Analyzer: visualization and quality control for DNA methylation data from bisulfite sequencing. Bioinformatics. 21 (11), 4067-4068 (2005).
- Schouten, J. P., et al. Relative quantification of 40 nucleic acid sequences by multiplex ligation-dependent probe amplification. Nucleic Acids Research. 30, 57 (2013).
- Nygren, A. O. H., et al. Methylation-Specific MLPA (MS-MLPA): simultaneous detection of CpG methylation and copy number changes of up to 40 sequences. Nucleic Acids Research. 33 (14), 128 (2005).
- El Andaloussi, S., Mager, I., Breakefield, X. O., Wood, M. J. Extracellular vesicles: biology and emerging therapeutic opportunities. Nature Reviews Drug Discovery. 12, 347-357 (2013).
- Vallabhaneni, K. C., et al. Extracellular vesicles from bone marrow mesenchymal stem/stromal cells transport tumor regulatory microRNA, proteins, and metabolites. Oncotarget. 6 (7), 4953-4967 (2015).
- Ratajczak, J., Wysoczynski, M., Hayek, F., Janowska-Wieczorek, A., Ratajczak, M. Z. Membrane- derived microvesicles: important and underappreciated mediators of cell-to-cell communication. Leukemia. 20, 1487-1495 (2006).
- Lee, T. H., et al. Microvesicles as mediators of intercellular communication in cancer- the emerging science of cellular "debris". Seminars in Immunopathology. 33, 455-467 (2011).
- Kawamura, Y., Calle, A. S., Yamamoto, Y., Sato, T., Ochiya, T. Extracellular vesicles mediate the horizontal transfer of an active LINE-1 retrotransposon. Journal of Extracellular Vesicles. 8, 1643214 (2019).
- Mannerström, B., et al. Epigenetic alterations in mesenchymal stem cells by osteosarcoma-derived extracellular vesicles. Epigenetics. 14 (4), 352-364 (2019).
- Shelke, G. V., Lässer, C., Gho, Y. S., Lötvall, J. Importance of exosome depletion protocols to eliminate functional and RNA-containing extracellular vesicles from fetal bovine serum. Journal of Extracellular Vesicles. 3, 24783 (2014).
- Wei, Z., Batagov, A. O., Carter, D. R., Krichevsky, A. M. Fetal bovine serum RNA interferes with the cell culture derived extracellular RNA. Scientific Reports. 6, 31175 (2016).
- Kornilov, R., et al. Efficient ultrafiltration-based protocol to deplete extracellular vesicles from fetal bovine serum. Journal of Extracellular Vesicles. 7, 1422674 (2018).
- Théry, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids. Current Protocols in Cell Biology. 30 (1), 1-29 (2006).
- Puhka, M., et al. Metabolomic profiling of extracellular vesicles and alternative normalization methods reveal enriched metabolites and strategies to study prostate cancer-related changes. Theranostics. 7 (16), 3824 (2017).
- Peltoniemi, H. H., et al. Stem cell enrichment does not warrant a higher graft survival in lipofilling of the breast: A prospective comparative study. Journal of Plastic, Reconstructive & Aesthetic Surgery. 66 (11), 1494-1503 (2013).
- Pavicic, W., Joensuu, E. I., Nieminen, T., Peltomäki, P. LINE-1 hypomethylation in familial and sporadic cancer. Journal of Molecular Medicine. 90, 827-835 (2012).
- L1.2 sequence on GenBank (accession number: AH005269.2). , Available from: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/AH005269 (2000).
- Designing synthetic MLPA probes (v04). MRC-Holland. , Available from: https://support.mlpa.com/downloads/files/designing-synthetic-mlpa-probes (2018).
- Takara Bio Inc. , Available from: https://www.takarabio.com/us/products/cell_biology_and_epigenetics/epigenetics/dna_preparation/msre_overview (2018).
- Pisanic, R., et al. Long interspersed nuclear element 1 retrotransposons become deregulated during the development of ovarian cancer precursor lesions. The American Journal of Pathology. 189 (3), 513-520 (2019).
