Summary
Burada açıklanan osteosarkom kaynaklı ekstrasellüler ile tedavi mezenkimal kök hücrelerde LINE-1 elemanlarının METilasyon düzeylerini analiz etmek için bir metilasyon özgü prob amplifikasyon yönteminin kullanımıdır. Ekstrasellüler vezikülleri fetal sığır serumundan ayırmak için popüler bir prosedür olan ultrasantrifüj de gösterilmiştir.
Abstract
Metilasyona özgü prob amplifikasyon (MSPA), DNA örneklerinin metilasyon düzeylerindeki göreceli farklılıkları tespit etmek için kullanılabilen basit ve sağlam bir tekniktir. Beceriklidir, az miktarda DNA gerektirir ve yaklaşık 4-5 saat pratik çalışma gerektirir. Sunulan teknikte, DNA örnekleri önce denatüre edilir, sonra da dna'yı kontrol olarak metillenmiş veya referans alanlarda hedefleyen problarla melezlenir. Melezleştirilmiş DNA paralel reaksiyonlara ayrılır, biri sadece ligasyon, diğeri ise metillenmemiş GCGC dizilerinde HhaI aracılı sindirim inanılması ile ligasyondan geçilir. Ortaya çıkan DNA parçaları PCR ile yükseltilir ve kapiller elektroforez ile ayrılır. Metillenmiş GCGC siteleri HhaI tarafından sindirilmez ve pik sinyaller üretirken, metillenmemiş GCGC siteleri sindirilir ve pik sinyalleri üretilmez. Her bir numunenin sindirilmiş ve sindirilmemiş versiyonlarının kontrol-normalleştirilmiş zirvelerinin karşılaştırılması, bir DNA örneğinin metilasyon dozaj oranını sağlar. Burada, MSPA mezenkimal kök hücrelerde uzun serpiştirilmiş nükleer element-1 (LINE-1) metilasyon durumu osteosarkom kaynaklı ekstrasellüler (EVs) etkilerini tespit etmek için kullanılır. LINE-1'ler genellikle kanserde hipometilasyon geçiren tekrarlayan DNA elementleridir ve bu kapasitede biyomarker görevi görebilir. Ultracentrifugation ayrıca ekstrasellüler vezikülleri biyolojik sıvılardan ayırmak için uygun maliyetli bir yöntem olarak da kullanılmaktadır (örneğin, EV-tükenmiş fetal sığır serumu hazırlanırken [FBS] ve osteosarkom şartlı ortamdan eVs izole [diferansiyel santrifüj]). Metilasyon analizi için, özel LINE-1 probları LINE-1 organizatör dizisindeüç metilasyon sahasını ve yedi kontrol sahasını hedeflemek üzere tasarlanmıştır. Bu protokol LINE-1 metilasyon analizi için MSPA kullanımını gösterir ve ultracentrifugation tarafından EV-tükenmiş FBS hazırlanması açıklar.
Introduction
DNA metilasyon insan hücrelerinde meydana gelen önemli bir epigenetik modifikasyondur. DNA metilasyon CpG dinükleotidlerde sitozin kalıntıları metil gruplarının bağlantı anlamına gelir. Bu tür dinükleotidler genellikle kümelerde (CpG adaları) genlerin 5' bölgesinde bulunur1. Normal hücrelerde, bu dinükleotidlerin çoğu metillenmemiş bir durumda bulunur, bu da DNA transkripsiyonuna izin verir. Bu arada, birçok kanser hipermethylated CpG adaları ve transkripsiyon ile ilişkili2, özellikle tümör baskılayıcı genlerde, hangi sırayla kanser çeşitli işaretleri katkıda3.
Öte yandan, uzun serpiştirilmiş nükleer elementler-1 (LINE-1s veya L1s) normalde CpG adalarında yüksek metilasyon seviyelerine sahip tekrarlayan, transposable DNA elemanlarıdır. LINE-1'in metilasyonunu önler ve genom bütünlüğünün korunmasına yardımcı olur. Çeşitli kanser türlerinde LINE-1 hipometilatlanır, aktivasyon ve sonraki retrotranspozisyon aracılı kromozomal instabilite ile sonuçlanır4. LINE-1 insan genomunun yaklaşık% 17 için hesaplar5, ve metilasyon durumu küresel genomik metilasyon düzeyleri nin bir göstergesi olarak hizmet verebilir6. Global LINE-1 hipometilasyonunun hücrelerin tümör fenotip7'yegeçişinden önce olduğu kabul edilir; bu nedenle, erken kanser başlangıcı için potansiyel bir belirteç olarak umut tutar.
Şu anda, pyrosequencing, metilasyona özgü PCR, mikrodiziler ve kromatin immünopresipitasyon1dahil olmak üzere metilasyon analizi için çeşitli yöntemler vardır. Yeni nesil sıralamanın kullanımı, DNA metilasyonunun saptanması için genom çapında yaklaşımların dahil edilmesine de mümkün kılmıştır. Bu yöntemlerin çoğu, metillenmemiş sitozinlerin urasil'e dönüştürüldüğü ve metillenmiş sitozinlerin değişmediği bisülfit le tedavi edilmiş DNA'ya dayanır. Ancak, bisülfit le tedavi DNA ile çalışan urasil metillenmemiş sitozinlerin eksik dönüşümleri gibi çeşitli tuzaklar vardır, dizilerin önyargılı amplifikasyon, ve sıralama hataları8.
Metilasyona özgü prob amplifikasyonda (MSPA), iki oligonükleotidden oluşan problar metilasyona duyarlı restriksiyon enzimi HhaI9için bir restriksiyon alanı (GCGC) içeren DNA dizilerini hedef alır. Sondalar DNA ile melezleştikten sonra, her örnek iki kümeye ayrılır. İlk sette problar ligasyondan geçerken, ikinci sette problar ligasyondan geçerken, metillenmemiş CGCG bölgelerinde HhaI aracılı sindirim emdirilir. Her iki numune seti de PCR ile güçlenir ve ürünler kılcal elektroforez ile ayrılır. Metillenmemiş bölgelerdeki problar HhaI tarafından sindirilir ve PCR sırasında yükseltilmez, bu da tepe sinyalleri ne olmaz. Buna karşılık, metillenmiş bölgelerdeki problar sindirime karşı korunur ve bu nedenle PCR sırasında yükseltilir ve daha sonra tepe sinyalleri10üretir.
MSPA'nın alternatif yöntemlere göre birçok avantajı vardır. İlk olarak, düşük miktarda DNA gerektirir (50-100 ng) ve formalin-sabit parafin gömülü örneklerden DNA analizi için uygundur10. Bu bisülfit tedavi DNA gerektirmez; aslında, bu şekilde modifiye DNA için uygun değildir. Birçok örnek aynı anda analiz edilebilir ve MSPA sondaları aynı anda birden fazla geni veya diziyi hedeflenecek şekilde tasarlanabilir. Ayrıca, hhaI kısıtlama alanı CpG adaları10tipik bir dizi karşılık gelir gibi problar metillenmiş DNA için özel ve duyarlıdır.
Bu çalışmada osteosarkom (OS) türetilmiş ekstrasellüler (EVs) line-1 metilasyon üzerinde yağ dokusu türetilmiş mezenkimal kök hücrelerde (AT-MSCs) etkileri araştırıldı; Şekil 1). EVs çoğu hücre türleri tarafından salgılanan nano ölçekli, membran bağlı veziküller vardır. Onlar proteinler, lipidler, mRNA, mikroRNA ve ana hücrelerden ek moleküller taşırlar11,12. EVs hücreiçi iletişim aracılık ve çeşitli patofizyolojik koşullarda önemli roller oynamaktadır13,14. Yakın zamanda yapılan bir çalışma, kanser kaynaklı EV'lerin aktif LINE-1'i alıcı hücrelere aktarabileceğini gösterdi15. Daha önce HOS-143B hücre hattından EVs DIĞER genetik etkilere ek olarak, MSCs LINE-1 metilasyon durumunu değiştirebilirsiniz bildirilmiştir16.
EV izolasyonu için büyüyen hücreler, FBS kaynaklı EVs diğer kaynaklardan EVs müdahale ve sonuçları engelleyebilir beri, büyüme orta EV tükenmiş fetal sığır serumu [FBS] kullanmak önemlidir17,18. Ultracentrifugation FBS evleri tüketmek için en yaygın yöntemlerden biridir. Bu ultrafiltrasyon ve ticari EV tükenmiş FBS19gibi alternatiflerile karşılaştırıldığında nispeten basit ve uygun maliyetli bir işlemdir. Burada protokol, EV'in tüketmiş FBS'sinin ultrasantrifikasyon la nasıl hazırlanacağını da göstermektedir.
Bu makalede, os-ev tedavi MSCs LINE-1 metilasyon analizi için bir işletim sistemi hücre hattından EVs izolasyonu, yukarıda belirtilen teknikler için ayrıntılı bir protokol sunar(Şekil 1).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bu çalışma Helsinki ve Uusimaa Hastanesi Bölgesi Etik Komitesi tarafından onaylanmıştır (etik onay D. No. 13/03/02/2015).
1. EV-ultracentrifugation tarafından TÜKENMIŞ FBS hazırlanması
- FBS'yi (ultra) santrifüj tüplerine alın ve ultra santrifüj kovalara yerleştirin. Ultracentrifugation sorunsuz ve güvenli bir şekilde çalıştığından emin olmak için, birbirinden 10 mg içinde kova denge.
- Kovaları sallanan bir rotora yükleyin (SW28 tipi, k-faktör 246). Rotoru ultracentrifuge'a yerleştirin ve 100.000 x g'de 4 °C'de 19 saat çalıştırın.
- Supernatant'ın açık renkli üst tabakasını (yaklaşık onda dokuz) dikkatlice toplayın ve 50 mL'lik bir tüpe aktarın. FBS'den evs içerdiğinden koyu kahverengi peleti rahatsız etmeyin veya pipetle etmeyin.
- Supernatant'ı 0,22 μm'lik bir filtreden yeni bir 50 mL boruya geçirin.
- EV yalıtımı için hücre oluştururken filtre sterilize edilmiş, EV tükenmiş FBS'yi hücre kültürü ortamına ekleyin.
2. Osteosarkom kaynaklı EVs izolasyonu
- Plaka OS hücreleri (HOS-143B hücre hattı) RPMI 1640 orta ile bir T-175 şişesinde, ile takviye 10% normal FBS ve% 1 antibiyotik (100 U / mL penisilin, 0.1 mg /mL streptomisin). Şişeyi 37 °C ve %5 CO2'debir kuvöze yerleştirin.
- Şişe %70-%80 uyumlu olduğunda, hücreleri fosfat tamponlu salin (PBS) ile yıkayın ve %10 EV tükenmiş FBS içeren medyada büyütün (bundan böyle EV tükenmiş ortam olarak anılacaktır).
NOT: T175 şişesine basılan 1 x 106 HOS-143B hücreleri yaklaşık 60 saat sonra %70 kesişme noktasına ulaşır. - Sonraki 48 saat boyunca, her 24 saat sonra osteosarkom hücrelerinden klimalı medya toplamak ve taze EV tükenmiş medya ekleyin.
- Hücre ve hücre enkazını temizlemek için şartlandırılmış ortamı 4 °C'de 20 dk 2500 x g'de santrifüj edin. Supernatant'ı yeni bir tüpe aktarın ve altta yaklaşık 2 mL ortam bırakarak.
NOT: Bu aşamada DOĞRUDAN EV yalıtımı ile devam etmiyorsa, supernatant -80 oC'de saklanabilir. - Ultracentrifuge tüpler içine supernatant dökün ve daha önce olduğu gibi onları dengeleyin. Tüpleri 100.000 x g'de 4 °C'de 2 saat için santrifüj edin.
- Supernatant'ı dikkatlice atın ve altta yaklaşık 1 mL bırakarak. EV peletini yıkamak ve yeniden askıya almak için boruya ve pipete yaklaşık 20 mL (0,1 μm filtrelenmiş) ekleyin.
- Tüpleri dengeleyin ve aynı ayarlarla başka bir ultracentrifugation turu gerçekleştirin.
- Supernatant'ı dikkatlice çıkarın ve 200 μL PBS'de EV peletini nazik pipetleme ile yeniden askıya alın. EVs'leri düşük bağlama tüplerinde saklayın.
NOT: Evv'ler hemen kullanılabilir veya -80 °C'de ihtiyaç duyulana kadar saklanabilir.
3. OS-EVs karakterizasyonu
NOT: Saflaştırılmış EV'ler batı lekeleme (WB), nanopartikül izleme analizi (NTA) ve iletim elektron mikroskobu (TEM)16ile karakterize edilebilir.
- EV belirteçleri CD63, TSG101 ve Hsp70 ile standart protokol16 uyarınca WB gerçekleştirin ve EV örneğinin saflığını belirtmek için calnexin ile20.
- NTA için, ilk olarak 0,1 μm filtrelenmiş Dulbecco'nun PBS'inde EV örneğini seyreltin ve çerçeve başına 30-100 partikül elde edin.
- Numunenin yaklaşık 500 μL'sini 1 mL şırıngaya alın ve NTA cihazının giriş noktasına yükleyin. Doğru ölçümler için çerçeve başına yeterli parçacık olup olmadığını kontrol edin.
- Ortam sıcaklığında kamera seviyesi 13 kullanarak NTA yazılımını açın ve 60'lı s süreli beş video kaydedin. Analiz sırasında algılama eşiği = 5 ve kazanç = 10 kullanın.
- DAHA önce21açıklandığı gibi TEM tarafından EV örnekleri analiz .
4. AT-MSC kültürü
NOT: Mezenkimal kök hücre izolasyonu için insan yağ dokusu liposuction aspire (Plastik Cerrahi Bölümü, Laser Tilkka Ltd., Finlandiya) olarak sağlanmıştır. Seçmeli liposuction işlemlerinden geçirilen lipoaspirate donörlerden yazılı bilgilendirilmiş onay alınmıştır.
- AT-MSC'leri standart mekanik ve enzimatik izolasyon yöntemleri ni kullanarak liposuction aspirelerinden izoleedin 22.
NOT: Diğer kaynaklardan (ticari hücre hatları dahil) gelen MSC'ler de kullanılabilir. - DMEM/F-12 medyasındaki kültür hücreleri %10 FBS ve %1 antibiyotikle desteklenmiştir.
5. OS-EVs ile MsCtedavisi
- Plaka 15.000 AT-MSCs iyi başına 24 kuyu plaka.
- Saat 24'ten sonra eski ortamı çıkarın, hücreleri PBS ile yıkayın ve EV'in tüketen ortamına değiştirin.
- Hücre-EV'leri 1.Gün (hücre adezyonu sonrası 24 saat), Gün 3 (1.Gün'den sonra 48 saat) ve 5.Gün (1.Gün'den sonra 96 saat) os-ev'ler (hücre başına 1 x 106 EVs parçacık konsantrasyonunda) ile tedavi edin.
- Gün 1'de OS-EV (TP) 0, Gün 3'te TP 3 ve 7.
NOT: Deney planlarına göre diğer zaman çizelgesi zaman çizelgeleri de takip edilebilir.
- Gün 1'de OS-EV (TP) 0, Gün 3'te TP 3 ve 7.
- Uygun bir yöntem kullanarak MSCs DNA ayıklayın. Veri analizi için pozitif ve negatif kontrol örnekleri ekleyin.
6. LINE-1 metilasyon teşpleri
- Pavicic ve ark.23tarafından daha önce yapıldığı gibi, özelleştirilmiş LINE-1 prob astarları tasarla. Metilasyon probları için LINE-1'in promotör bölgesi içinde HhaI kısıtlama bölgesini içeren üç dizi seçin. Kontrol sondaları için LINE-1 dizisinin geri kalanından HhaI kısıtlama alanı olmayan yedi dizi seçin.
NOT: LINE-1 dizisi GenBank veritabanı24 'de mevcuttur (L1.2, katılım no. AH005269.2). Probları tasarlamak için MSPA üreticisinin talimatlarını kullanın25. - TE tamponundaki 70 ng DNA örneğini 5 μL hacimle seyreltin.
- Tablo 1'debelirtildiği gibi sonraki termobisiklet ve PCR adımlarını gerçekleştirin. Numuneleri 98 °C'de 10 dk ısıtın, ardından 25 °C'ye kadar soğutun.
- Her numuneye 3 μL prob hibridizasyon karışımı ekleyin ve probların DNA ile melezlemesi için termocycler çalıştırın.
- Oda sıcaklığında (RT), her numuneye 13 μL'lik hibritizasyon sonrası karışımı ekleyin. 10 μL'yi ikinci bir tüpe aktarın.
- Her iki tüp setini de termocycler'a yerleştirin ve en az 1 dakika boyunca 48 °C'de kuluçkaya yatırın.
- Numuneler 48 °C'de yken, ligasyon karışımının 10 μL'sini ilk tüp setine (sindirilmemiş seriler) ve ligasyon-sindirim karışımının 10 μL'sini ikinci tüp setine (sindirilmiş seri) ekleyin. Bir sonraki termocycler programını çalıştırın.
- Tüpleri aşağı doğru çevirin ve aynı anda termocycler'ı 72 °C'ye ayarlayın.
- Her tüpe 5 μL polimeraz karışımı ekleyin ve tüpleri termocycler'a yerleştirin. PCR programını çalıştırın.
- PCR programı çalışırken, 2,5 μL boyut standardı içeren 1 mL formamid bir çözüm hazırlayın. Bu çözeltinin pipet 10 μL'si optik 96 kuyu plakasının her kuyusu için (barkodlu).
- PCR'den sonra, sindirilmemiş ve sindirilmiş numuneleri ultra saf suda sırasıyla 1:100 ve 1:200'e seyreltin. 96 kuyu plakasına 2 μL seyreltilmiş PCR ürün ekleyin. Hava kabarcıklarını gidermek için plakayı 15-20 s için 200 x g'de santrifüj edin.
- Kapiller elektroforez ile numunelerin parça analizini yapın.
NOT: Plaka analiz edilinceye kadar karanlıkta 4 °C'de saklanmalıdır.
7. Parça veri analizi
- Bir elektroferogram analiz yazılımı ile kapiller elektroforez sonuçlarını açın.
- Panel sütununun altında, örneklerden biri için menüden MLPA'yı seçin. Panel başlığına tıklayın ve tüm örneklere MLPA uygulamak için Ctrl+D tuşuna basın.
- Aynı şekilde, Tüm örnekler için Analiz yöntemini Microsatellite varsayılanolarak ayarlayın.
- Tüm örnekleri seçin ve seçilen ayarlara göre örnekleri analiz etmek için Yeşil oynat düğmesine tıklayın.
- Tüm örnekleri seçin ve sonda tepelerini görselleştirmek için Grafik düğmesine tıklayın.
- Tek tek sonda zirvelerinin daha yüksek çözünürlüğü için en yüksek bölgeyi yakınlaştırın. LINE-1 prob karışımındaki problara karşılık gelen 10 tepenin tamamının etiketlenmiş olduğundan emin olun. Ek zirveleri atın (<95 bp ve >160 bp).
- Genotipler sekmesinde, sonuçları virgülle ayrılmış değerler (CSV) biçiminde dışa aktarın.
- CSV dosyasını bir veri analizi yazılımında açın ve verileri sütunlara sıralayın.
- Etiket üç metilasyon site zirveleri yaklaşık boyutlarına göre (L1-1m 153 bp, L1-2m 119 bp, L1-3m 133 bp). Geri kalan yedi tepe kontrol sondalarına karşılık gelir.
NOT: Burada, l1-2m prob tepe değerleri kullanılır, hangi boyutu 117 bp, bu bölge en LINE-1 metilasyon tahlilleri kullanılmıştır beri23. - Her örnek için (sindirilmemiş ve sindirilmiş), yedi kontrol tepe noktasının toplam tepe alanını hesaplayın. Her LINE-1 sondasının en yüksek alanını bu toplama bölün.
- Her DNA örneği için, aşağıdaki denklemi kullanarak metilasyon dozaj oranını (DM)elde etmek için sindirilmemiş numunenin değerine bölün:
Nerede: DM metilasyon dozoranı, Ax pik x altında alandır (örneğin, L1-2m tepe), ve Actrl tüm yedi kontrol probları toplam tepe alanıdır.
- Etiket üç metilasyon site zirveleri yaklaşık boyutlarına göre (L1-1m 153 bp, L1-2m 119 bp, L1-3m 133 bp). Geri kalan yedi tepe kontrol sondalarına karşılık gelir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bu çalışmanın temel amacı OS-EV'lerin MSC'ler üzerindeki epigenetik etkilerini değerlendirmektir. OS-EV'ler standart diferansiyel santrifüj yöntemi kullanılarak HOS-143B hücrelerinden izole edilmiştir. Tipik EV belirteçleri CD63, Hsp70 ve TSG101'in batı lekeleme ile ifade edilerek OS-EV'lerin varlığı doğrulandı. (Şekil 2A). Calnexin sinyalinin yokluğu OS-EV izole saflık gösterdi. TEM ile ek saflık göstergesi gözlendi, çeşitli boyutlarda bozulmamış veziküller mevcuttu (Şekil 2B). Ortalama OS-EV partikül konsantrasyonu 7.63x1011/mL (Şekil 2C) idi. EVs'lerin boyut dağılımı 50-500 nm arasında değişmekte ve parçacıkların yaklaşık %80'i 50-200 nm aralığında değişmektedir(Şekil 2D).
AT-MSC'ler OS-EV ile tedavi edildi ve farklı zaman noktalarında MSC'lerden DNA çıkarıldı. LINE-1 metilasyon MS-MLPA ile analiz edildi ve metilasyon dozaj oranı açısından hesaplandı. Temel metilasyon düzeylerini (kesik çizgi) belirlemek için TP 0 sonuçları kullanılmıştır (Şekil 3). TP 3'te (yeşil kolonlar) OS-EV ile tedavi edildiğinde MSC'lerde ortalama LINE-1 metilasyon dozaj oranında bir azalma gözlendi ve temel metilasyon seviyelerinin altına düştü. Bu hipometili fenomen I. TP 7'de (mavi kolon) daha inceydi ve ortalama metilasyon dozoranı hem işlenmemiş hem de EV ile tedavi edilen MSC'lerde taban çizgisine göre biraz daha yüksekti.
Şekil 1: Deneysel iş akışı. EV'ler HOS-143B hücrelerinden diferansiyel santrifüj ile izole edilmiş ve batı lekeleme, TEM ve NTA ile karakterize edilmiştir. AT-MSC'ler farklı zaman noktalarında OS-EV ile tedavi edildi (TP 0, 3, an 7). MSC'lerden DNA çıkarıldı ve LINE-1 metilasyon MSPA tarafından analiz edildi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: EVs karakterizasyonu. (A) EV belirteçleri CD63 varlığı, Hsp70 ve TSG101 batı blotting tarafından EVs varlığını doğruladı, hiçbir bant calnexin için gözlenmedi, EV izole saflığını gösteren. Hem HOS-143B protein lisate hem de OS-EV'ler için 10 μg protein yüklendi. (B) TEM izole çeşitli boyutlarda bozulmamış EVs varlığını doğruladı. (C) Parçacık konsantrasyonu ve (D) OS-EV'lerin boyut dağılımı NTA ölçümleri ile belirlendi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: MSC'lerden LINE-1'in metilasyon dozoranları ya tedavi edilmez sayılsa da OS-EV ile tedavi edilir. Kesikli gri çizgi, TP 0 değerlerine karşılık gelen temel metilasyon değerini temsil eder. Yeşil sütunlar TP 3 örnekleri için OS-EV tedavisi olmadan ve ile ortalama metilasyon dozaj oranlarını temsil ederken, mavi sütunlar TP 7 örnekleri için aynı temsil eder. Hem TP 3 hem de TP 7 örnekleri OS-EV ile tedavi sonrası metilasyon düzeylerinde azalma gösterdi. Ancak, EV tedavisinden sonra metilasyon düzeyinin de temel değerden daha düşük olduğu TP 3 örneklerinde fark daha büyüktü. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Tablo 1: MSPA reaktif karışımı tarifleri ve termocycler / PCR programları. Bahsedilen hacimler bir DNA örneğini temsil eder. Bu aşamada iki tüp kümesi olduğundan polimeraz karışımının önceki karışımlar kadar 2kat numune için hazırlanması gerektiği unutulmamalıdır. Sonraki termobisiklet veya PCR programının ayrıntıları sağda sağda sağda sağda sağda verilmiştir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu çalışma, MSPA'nın belirli bir genetik elementin metilasyon durumunu tespit etmek ve ölçmek için nasıl kullanılabileceğini göstermektedir. LINE-1 burada odak noktası oldu, ama sondalar genler ve diziler bir dizi hedef için tasarlanmış olabilir. Ayrıca, farklı uygulamalar için kullanılabilir prob karışımları büyüyen bir liste vardır. MSPA, bisülfit dönüşüm gerektirmeyen DNA metilasyon analizi için basit ve sağlam bir tekniktir10. Örnek hazırlamadan veri analizine kadar tam prosedür yaklaşık 2 gün sürer, ancak yalnızca 4-5 saat gerçek uygulamalı çalışmayı içerir. Burada gösterildiği gibi az miktarda DNA (70 ng'ye kadar) uygulanabilir.
Metilasyon analizi protokolünün en önemli kısmı, bu çalışmada LINE-1 prob karışımı gibi özel prob karışımlarının hazırlanmasıdır. Farklı uzunlukları nedeniyle LINE-1 prob oligonükleotidleri 4-40 nM aralığında sentezlenmiş, bu nedenle dağılma adımı ve sonraki seyreltmeler üreticinin talimatları na göre dikkatle yapılmalıdır25. Burada kullanılan protokolün PCR ve çeşitli termobisiklet programları orijinal üreticinin sürümünde olanlardan farklıdır.
HhaI enzimi ile ilgili birkaç önlem var. İlk olarak, ligasyon-sindirim karışımında kullanılan enzimhacmi üreticiye bağlıdır ve ısı inaktivasyonuna dirençli enzim versiyonları MSPA için uygun değildir. Bazı enzimlerde, hatalı PCR ürünlerinin ve anormal pik sinyallerin oluşmasına neden olacak eksik sindirim örnekleri olabilir. Son olarak, son PCR ürünlerinin kapiller elektroforez için ne ölçüde seyreltildiği problara bağlıdır. İlk çalıştırmalar, bir dizi seyreltmeyi test etmek için tavsiye edilen optimizasyonları içerir.
HhaI aracılı DNA sindirim seçici doğası gibi MSPA bazı sınırlamalar vardır. Hha DNA'yı sadece metillenmemiş GCGC dizilerinde bırakırım ve CpG adalarıiçinde bulunsalar bile G ve C ile kaplanmamış cpg dinükleotidlerinin diğer örneklerini göz ardı ederim. Sonuç olarak, bu tür dinükleotidlerin (ve probların hedef sırasının dışında bulunanların) metilasyon durumu belirlenemez. LINE-1 prob-mix organizatör bölge24ek GCGC dizileri içeren daha fazla probiçerebilir, bu nedenle metilasyon siteleri daha fazla sayıda temsil eden.
Alternatif olarak, diğermetilasyon özgü restriksiyon enzimleri, Sac II ve MluI gibi, HhaBen daha farklı bir kısıtlama sitesi var ek olarak MSPA kullanılabilir, hangi küresel metilasyon düzeyleri daha geniş bir temsil sağlayabilir26. İkinci olarak, TP 7 örneklerinde gözlendiği gibi, metilasyon dozoranı ndaki farklılıklar oldukça ince olabilir. Bu, normal koşullarda küresel metilasyon düzeyi yüksek olan ve sadece birkaç CpG bölgesinde geçici hipometilasyon olaylarından büyük ölçüde etkilenmeyen genom5'tekiLINE-1'lerin yüksek kopya sayısına bağlı olabilir. Ayrıca, MSCs farklılaşma aşaması ve hücre döngüsü açısından heterojen, hangi temel metilasyon değerini etkileyebilir. Son olarak, MSPA sadece DNA metilasyon göreceli farklılıkları tespit edebilir ve bu nedenle referans örnekleri gerektirir. Bu gibi durumlarda, yerel metilasyon doğrudan tespit yöntemleri daha uygun olabilir, onlar bisülfit dönüşüm adım27gerektirebilir rağmen.
Bu çalışma da EV izolasyonu için hücre kültürü ortamının önemli bir bileşeni olan EV tükenmiş FBS, hazırlanması gösterdi. Ultracentrifugation etkili FBS geri kalanından EVs ayırabilirsiniz ucuz bir süreçtir. Ancak, santrifüj 19 saat gibi ultrafiltrasyon ve ticari sürümleri19gibi alternatifler, daha fazla zaman alıcı bir yöntem yapar. Ultracentrifugation da örneğin dikkatli bir şekilde işlenmesini gerektirir, örneğin santrifüjden önce tüpleri dengeleme ve daha sonra supernatant toplama gibi. Tüm bu zorluklara rağmen, EV'leri biyolojik sıvılardan ayırmak için popüler bir yöntemdir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Acknowledgments
Bu çalışma Helsinki Üniversitesi proje finansmanı (WBS490302, WBS73714112) Helsinki Üniversitesi Hastanesi Devlet üniversite düzeyinde sağlık araştırmaları için fon (Y1014SUL05, TYH2016130), Finlandiya-Norveç Tıp Vakfı ve Selma ve Maja-Lisa Selander Fonu (Minerva Vakfı). Walter Paviciç'e değiştirilmiş MSPA protokolünü sağladığı ve ilgili teknik destek için teşekkür ederiz. Teemu Masalin'e (Helsinki Üniversitesi) video prodüksiyonunda bize yardımcı olduğu için minnettarız.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL syringe | Terumo | SS+01T1 | for NTA |
| 24-well plate | Corning | 3524 | MSC cell culture |
| 3730xl DNA Analyzer | Applied Biosystems, ThermoFisher Scientific | 3730XL | |
| 50 mL centrifuge tube | Corning | 430829 | |
| Beckman Optima LE-80K Ultracentrifuge | Beckman | ||
| BlueStar Prestained Protein Marker | Nippon Genetics | MWP03 | WB: protein marker |
| Calnexin (clone C5C9) | Cell Signaling Technology | 2679 | WB, dilution 1:800 |
| CD63 (clone H5C6) | BD Biosciences | 556019 | WB, dilution 1:1000 |
| Centrifuge 5702 R | Eppendorf | 5703000010 | For conditioned media and cells |
| Centrifuge 5810 | Eppendorf | 5810000010 | For spinning down 96-well plate |
| Centrifuge tube (polyallomer, 14x95 mm) | Beckman | 331374 | Ultracentrifugation |
| DMEM/F-12 + GlutaMAX medium | Gibco, Life Technologies | 31331-028 | For AT-MSC culture |
| Fetal bovine serum | Gibco, Life Technologies | 10270-106 | |
| GeneScan 500 LIZ size standard | Applied Biosystems, Life Technologies | 4322682 | for capillary electrophoresis |
| GenomePlex Complete Whole Genome Amplification (WGA) Kit | Sigma | WGA2-10RXN | for MSPA negative control |
| Hi-Di formamide | Applied Biosystems, Life Technologies | 4311320 | for capillary electrophoresis |
| HOS-143B cell line | ATCC | CRL-8303 | |
| Hsp70 (clone 5G10) | BD Biosciences | 554243 | WB, dilution 1:1000 |
| IRDye 800CW Goat anti-mouse | Li-Cor | 926-32210 | WB: secondary |
| IRDye 800CW Goat anti-rabbit | Li-Cor | 926-32211 | WB: secondary |
| LINE-1 probe-mix primers | IDT | Sequences in Table 1 | |
| MicroAmp Optical 96-well reaction plate with barcode | Applied Biosystems, Life Technologies | 4306737 | also requires sealing film |
| Micro BCA Protein Assay kit | ThermoFisher Scientific | 23235 | measure protein concentration |
| MiniProtean TGX 10% gels | Bio-Rad | 456-1034 | WB: gel electrophoresis |
| NanoSight LM14C | Malvern Instruments | for NTA | |
| Nitrocellulose membrane 0.2 µm | Bio-Rad | 1620112 | WB: protein transfer |
| NucleoSpin Tissue XS | Macherey-Nagel | 740901.50 | for DNA extraction |
| Odyssey Blocking Buffer | Li-Cor | 927-40000 | WB: blocking, antibodies |
| PBS, 1X | Corning | 21-040-CVR | |
| Penicillin-streptomycin | Gibco, Life Technologies | DE17-602E | Antibiotics for culture media |
| Protein LoBind tube, 0.5 mL | Eppendorf | 22431064 | For storing Evs |
| REVERT Total Protein Stain and Wash Solution Kit | Li-Cor | 926-11015 | WB: total protein staining |
| RKO cell line | ATCC | CRL-2577 | for MSPA positive control |
| RPMI medium 1640 + GlutaMAX | Gibco, Life Technologies | 61870-010 | For HOS-143B cell culture |
| SALSA MLPA HhaI enzyme | MRC-Holland | SMR50 | |
| SALSA MLPA reagent kit | MRC-Holland | EK1-FAM | |
| SALSA MLPA P300 probe-mix | MRC-Holland | P300-100R | |
| Swinging rotor SW-28 | Beckman Coulter | 342207 | Ultracentrifugation |
| Syringe filter, 0.22 µm | Jet Biofil | FPE-204-030 | sterile filtering FBS |
| Tecnai 12 | FEI Company | equipped with Gatan Orius SC 1000B CCD-camera (Gatan Inc., USA); for TEM |
|
| TBS, 1X tablets | Medicago | 09-7500-100 | WB: buffer |
| Trans-Blot Turbo | Bio-Rad | WB: transfer | |
| Thermal cycler | ThermoFisher Scientific | TCA0096 | |
| TrypLE Express | Gibco | 12604-021 | for trypsinization of cells |
| TSG101 (clone 4A10) | Sigma | SAB2702167 | WB, dilution 1:500 |
References
- Esteller, M. Cancer epigenomics: DNA methylomes and histone-modification maps. Nature Reviews Genetics. 8, 286-298 (2007).
- Herman, J. G., Baylin, S. B. Gene silencing in cancer in association with promoter hypermethylation. New England Journal of Medicine. 349, 2042-2054 (2003).
- Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of Cancer: The Next Generation. Cell. 144 (5), 646-674 (2011).
- Howard, G., Eiges, R., Gaudet, F., Jaenisch, R., Eden, A. Activation and transposition of endogenous retroviral elements in hypomethylation induced tumors in mice. Oncogene. 27, 404-408 (2008).
- Lander, E. S., et al. Initial sequencing and analysis of the human genome. Nature. 409, 860-921 (2001).
- Rodriguez, J., et al. Chromosomal instability correlates with genome-wide DNA demethylation in human primary colorectal cancers. Cancer Research. 66, 8462 (2006).
- Feinberg, A. P., Ohlsson, R., Henikoff, S. The epigenetic progenitor origin of human cancer. Nature Reviews Genetics. 7, 21-33 (2006).
- Bock, C., et al. BiQ Analyzer: visualization and quality control for DNA methylation data from bisulfite sequencing. Bioinformatics. 21 (11), 4067-4068 (2005).
- Schouten, J. P., et al. Relative quantification of 40 nucleic acid sequences by multiplex ligation-dependent probe amplification. Nucleic Acids Research. 30, 57 (2013).
- Nygren, A. O. H., et al. Methylation-Specific MLPA (MS-MLPA): simultaneous detection of CpG methylation and copy number changes of up to 40 sequences. Nucleic Acids Research. 33 (14), 128 (2005).
- El Andaloussi, S., Mager, I., Breakefield, X. O., Wood, M. J. Extracellular vesicles: biology and emerging therapeutic opportunities. Nature Reviews Drug Discovery. 12, 347-357 (2013).
- Vallabhaneni, K. C., et al. Extracellular vesicles from bone marrow mesenchymal stem/stromal cells transport tumor regulatory microRNA, proteins, and metabolites. Oncotarget. 6 (7), 4953-4967 (2015).
- Ratajczak, J., Wysoczynski, M., Hayek, F., Janowska-Wieczorek, A., Ratajczak, M. Z. Membrane- derived microvesicles: important and underappreciated mediators of cell-to-cell communication. Leukemia. 20, 1487-1495 (2006).
- Lee, T. H., et al. Microvesicles as mediators of intercellular communication in cancer- the emerging science of cellular "debris". Seminars in Immunopathology. 33, 455-467 (2011).
- Kawamura, Y., Calle, A. S., Yamamoto, Y., Sato, T., Ochiya, T. Extracellular vesicles mediate the horizontal transfer of an active LINE-1 retrotransposon. Journal of Extracellular Vesicles. 8, 1643214 (2019).
- Mannerström, B., et al. Epigenetic alterations in mesenchymal stem cells by osteosarcoma-derived extracellular vesicles. Epigenetics. 14 (4), 352-364 (2019).
- Shelke, G. V., Lässer, C., Gho, Y. S., Lötvall, J. Importance of exosome depletion protocols to eliminate functional and RNA-containing extracellular vesicles from fetal bovine serum. Journal of Extracellular Vesicles. 3, 24783 (2014).
- Wei, Z., Batagov, A. O., Carter, D. R., Krichevsky, A. M. Fetal bovine serum RNA interferes with the cell culture derived extracellular RNA. Scientific Reports. 6, 31175 (2016).
- Kornilov, R., et al. Efficient ultrafiltration-based protocol to deplete extracellular vesicles from fetal bovine serum. Journal of Extracellular Vesicles. 7, 1422674 (2018).
- Théry, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids. Current Protocols in Cell Biology. 30 (1), 1-29 (2006).
- Puhka, M., et al. Metabolomic profiling of extracellular vesicles and alternative normalization methods reveal enriched metabolites and strategies to study prostate cancer-related changes. Theranostics. 7 (16), 3824 (2017).
- Peltoniemi, H. H., et al. Stem cell enrichment does not warrant a higher graft survival in lipofilling of the breast: A prospective comparative study. Journal of Plastic, Reconstructive & Aesthetic Surgery. 66 (11), 1494-1503 (2013).
- Pavicic, W., Joensuu, E. I., Nieminen, T., Peltomäki, P. LINE-1 hypomethylation in familial and sporadic cancer. Journal of Molecular Medicine. 90, 827-835 (2012).
- L1.2 sequence on GenBank (accession number: AH005269.2). , Available from: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/AH005269 (2000).
- Designing synthetic MLPA probes (v04). MRC-Holland. , Available from: https://support.mlpa.com/downloads/files/designing-synthetic-mlpa-probes (2018).
- Takara Bio Inc. , Available from: https://www.takarabio.com/us/products/cell_biology_and_epigenetics/epigenetics/dna_preparation/msre_overview (2018).
- Pisanic, R., et al. Long interspersed nuclear element 1 retrotransposons become deregulated during the development of ovarian cancer precursor lesions. The American Journal of Pathology. 189 (3), 513-520 (2019).
