Summary
ここでは、骨肉腫由来細胞外小胞で治療した間葉系幹細胞における間葉系幹細胞における、メチル化特異的プローブ増幅法を用いて、LINE-1要素のメチル化レベルを解析する。ウシ胎児血清から細胞外小胞を分離するための一般的な手順である超遠心分離も実証されている。
Abstract
メチル化特異的プローブ増幅(MSPA)は、DNAサンプルのメチル化レベルの相対的な差異を検出するために使用できる、シンプルで堅牢な手法です。それは、機知に富み、少量のDNAを必要とし、約4〜5時間の実作業を要します。提示された技術では、DNAサンプルはまず、メチル化または参照部位のいずれかでDNAを標的とするプローブに対してハイブリダイズされます。ハイブリダイズされたDNAは並列反応に分離され、1つはライゲーションのみを受け、もう1つは結紮を受け、もう1つは非メチル化GCGC配列でHhaI媒介消化を経る。得られたDNA断片はPCRにより増幅され、毛細管電気泳動によって分離される。メチル化GCGC部位はHhaIによって消化されず、ピークシグナルを生成しますが、非メチル化GCGC部位は消化され、ピーク信号は生成されません。各サンプルの消化済みおよび未消化のバージョンの制御正規化ピークを比較すると、DNAサンプルのメチル化投与量比が得られます。ここでは、MSPAは間葉系幹細胞における長い間在在核元素1(LINE-1)のメチル化状態に対する骨肉腫由来細胞外小胞(EV)の影響を検出するために使用される。LINE-1sは、通常、癌において低メチル化を受ける反復的なDNA元素であり、この能力において、バイオマーカーとして働く可能性がある。超遠心分離はまた、生物学的流体から細胞外小胞を分離するための費用対効果の高い方法として使用される(すなわち、EV枯渇した胎児ウシ血清[FBS]を調製し、骨肉腫条件化培地[差動遠心分離]からEVを単離する場合)。メチル化分析のために、カスタムLINE-1プローブは、LINE-1プロモーター配列と7つの制御部位の3つのメチル化部位を対象とするように設計されています。このプロトコルは、LINE-1メチル化分析のためのMSPAの使用を実証し、超遠心分離によるEV枯渇FBSの調製を記述する。
Introduction
DNAメチル化は、ヒト細胞で起こる主要なエピジェネティック修飾である。DNAメチル化とは、CpGジヌクレオチド中のシトシン残基に対するメチル基の結合をいう。このようなジヌクレオチドは、通常、遺伝子1の5'領域のクラスター(CpG島)に見られる。正常な細胞では、これらのジヌクレオチドの大部分は非メチル化状態で存在し、DNA転写を可能にする。なお、多くの癌は、高メチル化CpG島および転写抑制2に関連しており、特に腫瘍抑制遺伝子において、癌3の様々な特徴に寄与する。
一方、長い散在核元素-1(LINE-1またはL1)は、CpG諸島で通常高レベルのメチル化を有する反復的でトランスポーザブルなDNA元素である。LINE-1のメチル化は転位を防ぎ、ゲノムの完全性を維持するのに役立つ。いくつかのタイプの癌において、LINE−1は、低メチル化され、活性化およびそれに続く経転媒性染色体不安定性4をもたらす。LINE-1はヒトゲノム5のほぼ17%を占め、そのメチル化状態は、世界のゲノムメチル化レベル6の指標として役立つ可能性がある。グローバルLINE-1ハイメチル化は、細胞から腫瘍表現型7への移行に先立つと考えられている。したがって、早期癌発症の潜在的なマーカーとしての約束を保持する。
現在、メチル化分析には、ピロースケンシング、メチル化特異的PCR、マイクロアレイ、クロマチン免疫沈降法1など、いくつかの方法があります。次世代シーケンシングの使用により、DNAメチル化の検出にゲノム全体のアプローチを組み込むことも可能になりました。これらの方法の多くは、非メチル化シトシンがウラシルに変換され、メチル化されたシトシンが変わらないバイサルファイト処理DNAに依存しています。しかし、亜硫酸水素塩処理DNAを使用すると、非メチル化シトシンからウラシルへの不完全な変換、配列の偏った増幅、シーケンシングエラーなど、いくつかの落とし穴があります。
メチル化特異的プローブ増幅(MSPA)において、メチル化感受性制限酵素HhaI9に対する制限部位(GCGC)を含む2つのオリゴヌクレオチド標的DNA配列からなるプローブ。プローブがDNAにハイブリダイズした後、各サンプルは2つのセットに分けられます。第1セットのプローブはライゲーションを受け、第2セットではプローブがライゲーションを受け、次いでメチル化されていないCGCG部位でHhaI媒介消化を行う。その後、両方のサンプルセットをPCRで増幅し、キャピラリー電気泳動により分離します。非メチル化部位のプローブはHhaIによって消化され、PCR中に増幅されず、ピークシグナルが発生しません。これに対して、メチル化部位のプローブは消化から保護され、PCR中に増幅され、その後ピークシグナル10を生成する。
MSPAには、代替方法に対していくつかの利点があります。まず、少量のDNA(50~100ng)を必要とし、ホルマリン固定パラフィン埋込サンプル10からDNAを分析するのに適しています。これは、亜硫酸水素塩処理DNAを必要としません;実際、この方法で修飾されるDNAには適していません。同時に多くのサンプルを分析することができ、MSPAプローブは複数の遺伝子または配列を同時に標的にするように設計することができます。さらに、プローブは、HhaI制限部位がCpG島10の典型的な配列に対応するように、メチル化DNAに対して特異的かつ感受性である。
本研究では、脂肪組織由来間葉系幹細胞(AT-MSC)におけるLINE-1メチル化に対する骨肉腫(OS)由来細胞外小胞(EV)の影響を調べた。図 1を参照してください。EVは、ほとんどの細胞タイプによって分泌されるナノスケールの膜結合小胞です。それらは、親細胞11、12からタンパク質、脂質、mRNA、マイクロRNA、および追加の分子を運びます。EVは細胞間通信を媒介し、いくつかの病態生理学的条件において重要な役割を果たす13、14。最近の研究では、癌由来のEVが能動的なLINE-1をレシピエント細胞15に移す可能性が示された。HOS-143B細胞系のEVは、他の遺伝的効果16に加えて、MSCにおけるLINE-1のメチル化状態を変化させることができることが以前に報告されている。
EV単離のために細胞を増殖させる場合、FBS由来のEVは他の供給源からのEVを妨害し、結果17、18を妨げる可能性があるため、成長培地にEV枯渇したウシ血清[FBS]を使用することが重要である。超遠心分離は、FBSからEVを枯渇させる最も一般的な方法の1つです。これは、限外濾過や商用EV枯渇FBS19などの代替手段と比較して、比較的簡単で費用対効果の高い手順です。ここで、このプロトコルは、超遠心分離によってEVで枯渇したFBSを調製する方法も示す。
この記事では、OS 細胞系からの EV の分離から、OS-EV 処理された MSC における LINE-1 のメチル化解析まで、前述の技術に関する詳細なプロトコルを紹介します (図 1)。
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Protocol
この研究は、ヘルシンキとウシマ病院地区の倫理委員会によって承認されました(倫理承認第217/13/03/02/2015)。
1. 超遠心分離によるEV枯渇FBSの調製
- FBSを(超)遠心管に入れ、超遠心分離機のバケツに入れ。超遠心分離がスムーズかつ安全に実行されるように、互いの10mg以内のバケットのバランスをとります。
- バケットをスイングローターにロードします(SW28、kファクター246と入力)。ローターを超遠心分離機に入れ、4 °Cで19時間100,000 x gで走ります。
- 上清の明るい色の上層(約9分の1)を注意深く集め、50mLチューブに移します。FBSのEVが含まれているため、ダークブラウンペレットを邪魔したりピペットしたりしないでください。
- 0.22 μm フィルターを通して上清を新しい 50 mL チューブに渡します。
- EV分離のために細胞を成長させた場合、細胞培養培地にフィルター滅菌、EV枯渇FBSを加える。
2. 骨肉腫由来EVの分離
- プレートOS細胞(HOS-143B細胞株)は、RPMI 1640培地を有するT-175フラスコに、10%の正常FBSおよび1%の抗生物質(100 U/mLペニシリン、0.1mg/mLストレプトマイシン)を補充した。フラスコを37°Cおよび5%のCO2のインキュベーターに置く。
- フラスコが70%~80%のコンフルエントな場合、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)で細胞を洗浄し、10%のEV枯渇FBS(以下EV枯渇培地と呼ばれる)を含む培地で増殖させます。
注:T175フラスコで1 x 106 6 HOS-143B細胞をメッキすると、約60時間後に70%のコンフルエンシーに達する。 - 次の48時間の間に、24時間ごとに骨肉腫細胞から調整された培地を収集し、新鮮なEV枯渇培地を追加します。
- 4°Cで20分間2500 x gで調整培地を遠心分離し、細胞および細胞の破片を除去します。上清を新しいチューブに移し、下部に約2 mLの媒体を残します。
注: この段階で EV 分離を直接進めなければ、上清は -80 oC で保管できます。 - 上澄み剤を超遠心管に注ぎ、以前と同じバランスをとります。4 °Cで2時間100,000 x gでチューブを遠心分離する。
- 上清を慎重に捨て、底部に1mL前後を残します。チューブとピペットに約20 mLのPBS(0.1μmろ過)を加え、EVペレットを洗って再懸濁します。
- チューブのバランスをとり、同じ設定で超遠心分離の別のラウンドを実行します。
- 上清を慎重に取り出し、穏やかなピペッティングで200μLのPBSにEVペレットを再懸濁します。低結合チューブに EV を格納します。
注: EV は、必要になるまですぐに使用することも、-80 °C で保存することもできます。
3. OS-EVの特性評価
注:精製されたEVは、ウェスタンブロッティング(WB)、ナノ粒子追跡分析(NTA)、透過電子顕微鏡(TEM)16によって特徴付けることができます。
- EVマーカーCD63、TSG101、およびHsp70を用いて標準プロトコル16に従ってWBを行い、かつ、EVサンプル20の純度を示す負の対照としてカルネキシンを用いた。
- NTAの場合、まず、ダルベッコのPBSをろ過した0.1μmでEVサンプルを希釈し、フレームあたり30~100個の粒子を得ます。
- サンプルの約500μLを1 mLのシリンジに取り込み、NTAインストゥルメントの入口ポートにロードします。正確な測定のために、フレームごとに十分な粒子があることを確認してください。
- NTAソフトウェアを開き、周囲温度でカメラレベル13を使用して、60sの持続時間の5つのビデオを記録します。分析中は、検出しきい値 = 5、ゲイン = 10 を使用します。
- 前述の21に従って、TEM による EV サンプルの分析
4. AT-MSC 文化
注:間葉系幹細胞分離のためのヒト脂肪組織は、脂肪吸引吸引吸引吸引として提供された(フィンランドレーザーティルッカ株式会社形成外科)。書面によるインフォームド・コンセントは、選択的脂肪吸引処置を受けていた脂肪吸引ドナーから取られた。
- 標準的な機械的および酵素的分離方法22を使用して、脂肪吸引吸引吸引から AT-CS を分離する。
注: 他のソース(市販の細胞株を含む)からのMSCも使用することができます。 - DMEM/F-12培地中の培養細胞は、10%FBSおよび1%の抗生物質を補充した。
5. OS-EVによるMSCの治療
- 24の井戸の版の井戸ごとの15,000のAT-MCC。
- 24時間後、古い培地を取り出し、PBSで細胞を洗浄し、EVで枯渇した媒体に変えます。
- 1日目(細胞接着後24時間)、3日目(1日目から48時間)、5日目(1日目以降96時間)にOS-EV(細胞当たり1 x106 EVの粒子濃度)を持つ細胞を治療します。
- 7日目(5日目から48時間)に、1日目、TP 3サンプル、7日目のTP 7サンプルで、タイムポイント(TP)0サンプルのOS-EV処理を中止します。
注: 実験計画に従って他のタイムポイントスケジュールも続けることができます。
- 7日目(5日目から48時間)に、1日目、TP 3サンプル、7日目のTP 7サンプルで、タイムポイント(TP)0サンプルのOS-EV処理を中止します。
- 適切な方法を使用して、MSCからDNAを抽出します。データ分析に正および負の制御サンプルを含めます。
6. LINE-1メチル化アッセイ
- Pavicicら23で以前に行ったように、カスタマイズされたLINE-1プローブプライマーを設計する。メチル化プローブの場合、LINE-1のプロモーター領域内にHhaI制限部位を含む3つの配列を選択する。制御プローブの場合、残りのLINE-1シーケンスからHhaI制限部位を欠いている7つの配列を選択します。
注: LINE-1 シーケンスは GenBank データベース24 (L1.2、アノミオン番号) で入手できます。AH005269.2). プローブを設計するための MSPA メーカーの説明書を使用します25. - TE バッファーで 70 ng の DNA サンプルを 5 μL のボリュームに希釈します。
- 表 1に示すように、サーモサイクリングおよび PCR のステップを続けて実行します。98°Cで10分間サンプルを加熱し、25°Cまで冷却します。
- 各サンプルに3μLのプローブハイブリダイゼーションミックスを加え、サーモサイクラーを実行してプローブがDNAにハイブリダイズできるようにします。
- 室温(RT)で、各サンプルに13 μLのポストハイブリダイゼーションミックスを加えます。10 μLを2番目のチューブに移します。
- 両方のチューブをサーモサイクラーに入れ、少なくとも1分間48°Cでインキュベートします。
- サンプルが48°Cにある間、第1セットのチューブ(未消化系列)に10μLのライゲーションミックスを加え、第2セットのチューブに10μLのライゲーション分解ミックスを加えます(消化系列)。次のサーモサイクラープログラムを実行します。
- チューブをスピンダウンし、同時に72°Cにサーモサイクラーを設定します。
- 各チューブに5μLのポリメラーゼミックスを加え、熱サイクル器にチューブを入れます。PCR プログラムを実行します。
- PCRプログラムの実行中に、2.5 μLのサイズ標準を含む1 mLホルムアミドの溶液を調製してください。この溶液のピペット10μLを光学96ウェルプレート(バーコード付き)の各ウェルに対する。
- PCR後、未消化のサンプルと消化したサンプルを、それぞれ1:100と1:200に超純水で希釈します。96ウェルプレートに2μLの希釈PCR製品を加えます。15~20sのプレートを200xgで遠心分離し、気泡を除去します。
- 毛管電気泳動によるサンプルのフラグメント解析を行います。
注:プレートは、分析するまで暗闇の中で4°Cで保管する必要があります。
7. フラグメントデータ解析
- キャピラリー電気泳動を開くと、電気泳動解析ソフトウェアが得られます。
- [パネル] 列の 1 つのサンプルで、メニューからMLPAを選択します。パネルヘッダーをクリックし、Ctrl+Dを押してMLPAをすべてのサンプルに適用します。
- 同様に、すべてのサンプルについて、解析方法をマイクロサテライトのデフォルトに設定します。
- すべてのサンプルを選択し、緑の再生ボタンをクリックして、選択した設定に従ってサンプルを分析します。
- すべてのサンプルを選択し、グラフボタンをクリックしてプローブピークを視覚化します。
- 個々のプローブピークの分解能を高めるには、ピーク領域を拡大します。LINE-1プローブミックスのプローブに対応する10個のピークすべてにラベルが付いるようにします。追加のピークを破棄します (<95 bp および >160 bp)。
- [ジェノタイプ] タブで、結果をコンマ区切り値 (CSV) 形式でエクスポートします。
- データ分析ソフトウェアで CSV ファイルを開き、データを列に並べ替えます。
- 3つのメチル化部位のピークを、その近似サイズに基づいてラベル付けします(L1-1mは153bp、L1-2mは119bp、L1-3mは133bp)。残りの7つのピークは、制御プローブに対応します。
注: この領域はほとんどの LINE-1 メチル化アッセイ23で使用されているため、ここでは L1-2m プローブピークの値が使用され、サイズは 117 bp です。 - 各サンプル(未消化および消化)について、7つの制御ピークの合計ピーク面積を計算します。各LINE-1プローブのピーク面積をこの合計で割ります。
- 各DNAサンプルについて、消化されていないサンプルの値を未消化サンプルの値で割り、次の式を使用してメチル化投与量比(DM)を得ます。
どこ:DMはメチル化投与量比であり、Axはピークx(例えば、L1-2mピーク)の下の面積であり、Actrlは7つの全ての対照プローブの合計ピーク面積である。
- 3つのメチル化部位のピークを、その近似サイズに基づいてラベル付けします(L1-1mは153bp、L1-2mは119bp、L1-3mは133bp)。残りの7つのピークは、制御プローブに対応します。
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Representative Results
本研究の主な目的は、MS-EVがMSCに及ぼすエピジェネティックな影響を評価することであった。ウェスタンブロッティングによる代表的なEVマーカーCD63、Hsp70、TSG101の発現は、OS−EVの存在を確認した。(図2A)。カルネキシンシグナルの欠如は、OS−EV分離の純度を示した。TEMではさらなる純度の指標が認められ、様々なサイズの無傷の小胞が存在する(図2B)。平均OS-EV粒子濃度は7.63x1011/mL(図2C)であった。EVのサイズ分布は50~500nmで、約80%の粒子が50~200nmの範囲に収まる(図2D)。
AT-MCCはOS-EVで処理され、DNAは異なる時刻でMSCから抽出された。LINE-1メチル化をMS-MLPAで分析し、メチル化投与量比の観点から計算した。TP0からの結果は、ベースラインメチル化レベル(破線)を決定するために使用した(図3)。TP 3(緑色カラム)では、OS-EVで処理した場合のMSCでは、平均LINE-1メチル化投与量比の低下が認められ、ベースラインメチル化レベルに低下した。この低メチル化現象はTP 7(青柱)でより微妙であり、平均メチル化投与量比はベースラインと比較して未処理およびEV処理されたMSCsの両方でわずかに高かった。
図1:実験的なワークフローEVは、遠心分離によってHOS-143B細胞から単離し、ウェスタンブロッティング、TEMおよびNTAを特徴とする。AT-MSC は、異なる時点 (TP 0、3、7) で OS-EV で処理されました。DNAをMCから抽出し、LINE-1メチル化をMSPAで分析した。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 2: EV の特性評価(A)EVマーカーCD63、Hsp70およびTSG101の存在はウェスタンブロッティングによりEVの存在を確認したが、カルネキシンに対するバンドは認められなかったが、EV単離物の純度を示す。10 μg のタンパク質を、HOS-143B タンパク質ライセートと OS-EV の両方にロードしました。(B)TEMは、分離物中に様々なサイズの無傷のEVの存在を確認した。(C)OS-EVの粒子濃度及び(D)サイズ分布は、NTA測定により測定した。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3:未処理またはOS-EVで処理されたMSCからのLINE-1のメチル化投与量比。灰色の破線は、TP 0 値に対応するベースラインメチル化値を表します。緑色のカラムは、TP 3サンプルに対するOS-EV処理を伴わない、および、TP 7サンプルの場合は青色カラムが同じであるメチル化の平均投与量比を表します。TP 3およびTP 7サンプルは、OS-EVによる治療後のメチル化レベルの低下を示した。しかし、TP3サンプルでは差が大きかったが、ここでEV処理後のメチル化レベルもベースライン値よりも低かった。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
表1:MSPA試薬ミックスレシピとサーモサイクラー/PCRプログラム記載されているボリュームは、1つのDNAサンプルを表す。この段階では2組のチューブがあるので、ポリメラーゼミックスは、以前の混合と同じ数のサンプルを2x個用意する必要があることに留意すべきである。後続のサーモサイクリングプログラムまたはPCRプログラムの詳細は、右に提供されます。
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Discussion
この研究は、MSPAを使用して特定の遺伝的要素のメチル化状態を検出し、定量化する方法を示しています。ここでの焦点はLINE-1でしたが、プローブは遺伝子や配列の範囲をターゲットに設計することができます。さらに、さまざまな用途に利用できるプローブミックスのリストが増えています。MSPAは、亜硫酸水素変換10を必要としないDNAメチル化分析のための簡単で堅牢な技術です。サンプルの準備からデータ分析までの完全な手順は約 2 日かかりますが、実際の実践的な作業は 4 ~ 5 時間しか必要とされません。ここに示すように、少量のDNA(70ng以下)に適用可能です。
メチル化分析プロトコルの最も重要な部分は、この研究におけるLINE-1プローブミックスのようなカスタムプローブミックスの調製である。その長さが異なるために、LINE-1プローブオリゴヌクレオチドは4〜40nMの範囲で合成されたため、溶解ステップとその後の希釈液は、製造業者の指示25に従って慎重に行わなければならなかった。ここで使用されるプロトコルのPCRといくつかのサーモサイクリングプログラムは、元のメーカーのバージョンのものとは異なります。
HhaI酵素に関するいくつかの注意事項があります。まず、ライゲーション-消化ミックスに使用される酵素の体積はメーカーに依存し、熱不活性化に耐性のある酵素のバージョンは、MSPAには適していません。一部の酵素では、不完全な消化のインスタンスがあり、PCR産物の異常な生成物や異常なピークシグナルが形成される可能性があります。最後に、最終的なPCR産物が毛細管電気泳動のために希釈される程度は、プローブによって異なります。初期実行には最適化が含まれる可能性が高く、さまざまな希釈をテストすることをお勧めします。
HHAI媒介DNA消化の選択的性質など、MSPAには一定の制限があります。ハハ私は非メチル化GCGC配列でのみDNAを切断し、CpG島内に位置していても、GとCで囲まれていないCpGジヌクレオチドの他のインスタンスを無視します。その結果、このようなジヌクレオチド(およびプローブの標的配列の外側に位置するもの)のメチル化状態は決定できない。LINE−1プローブミックスは、プロモーター領域24からのさらなるGCGC配列を含むさらなるプローブを含み得、それによってより多くのメチル化部位を表わすことができる。
あるいは、他のメチル化特異的制限酵素、例えばSacIIおよびMlu I、HhaIのそれとは異なる制限部位を有する酵素が、さらにMSPAで使用されることができ、これは、世界的なメチル化レベル26のより広い表現を提供し得る。第二に、TP7サンプルで観察されるように、メチル化投与量比の違いは非常に微妙であり得る。これは、正常な条件下でのグローバルメチル化のレベルが高く、わずかなCpG部位での過渡的な低メチル化事象の影響をほとんど受けないゲノム5のLINE-1のコピー数が多いためである可能性があります。さらに、これらのMCは、分化の段階と細胞周期の段階の点で異種性であり、ベースラインメチル化値に影響を与える可能性があります。最後に、MSPAはDNAメチル化の相対的な違いを検出することしかできないので、この理由から参照サンプルが必要です。このような場合、局所的なメチル化を直接検出する方法がより適切であってもよいが、それらは、亜硫酸水素変換ステップ27を必要とするかもしれない。
この研究では細胞外小胞の使用が含まれるため、細胞分離に必要不可欠な細胞培養培地であるEV枯渇FBSの調製も実証した。超遠心分離は、FBSの残りの部分からEVを効果的に分離することができる安価なプロセスです。しかし、遠心分離の19時間は、限外処理や商用バージョン19などの代替手段よりも時間のかかる方法です。また、遠心分離前にチューブのバランスをとり、その後上澄みの収集を行う場合など、サンプルの取り扱いも慎重に行う必要があります。これらの課題にもかかわらず、それは生物学的流体からEVを分離するための一般的な方法です。
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Disclosures
著者たちは開示するものは何もない。
Acknowledgments
この研究は、ヘルシンキ大学プロジェクト資金(WBS490302、WBS73714112)ヘルシンキ大学病院国立大学レベルの健康研究のための資金(Y1014SUL05、TYH2016130)、フィンランドノルウェー医療財団、セルマとマジャ・リサ・セランダー基金(ミネルバ財団)。私たちは、変更されたMSPAプロトコルを提供し、関連する技術サポートのためにウォルター・パヴィッチに感謝します。ティーム・マザリン(ヘルシンキ大学)がビデオ制作を手伝ってくれたことに感謝しています。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL syringe | Terumo | SS+01T1 | for NTA |
| 24-well plate | Corning | 3524 | MSC cell culture |
| 3730xl DNA Analyzer | Applied Biosystems, ThermoFisher Scientific | 3730XL | |
| 50 mL centrifuge tube | Corning | 430829 | |
| Beckman Optima LE-80K Ultracentrifuge | Beckman | ||
| BlueStar Prestained Protein Marker | Nippon Genetics | MWP03 | WB: protein marker |
| Calnexin (clone C5C9) | Cell Signaling Technology | 2679 | WB, dilution 1:800 |
| CD63 (clone H5C6) | BD Biosciences | 556019 | WB, dilution 1:1000 |
| Centrifuge 5702 R | Eppendorf | 5703000010 | For conditioned media and cells |
| Centrifuge 5810 | Eppendorf | 5810000010 | For spinning down 96-well plate |
| Centrifuge tube (polyallomer, 14x95 mm) | Beckman | 331374 | Ultracentrifugation |
| DMEM/F-12 + GlutaMAX medium | Gibco, Life Technologies | 31331-028 | For AT-MSC culture |
| Fetal bovine serum | Gibco, Life Technologies | 10270-106 | |
| GeneScan 500 LIZ size standard | Applied Biosystems, Life Technologies | 4322682 | for capillary electrophoresis |
| GenomePlex Complete Whole Genome Amplification (WGA) Kit | Sigma | WGA2-10RXN | for MSPA negative control |
| Hi-Di formamide | Applied Biosystems, Life Technologies | 4311320 | for capillary electrophoresis |
| HOS-143B cell line | ATCC | CRL-8303 | |
| Hsp70 (clone 5G10) | BD Biosciences | 554243 | WB, dilution 1:1000 |
| IRDye 800CW Goat anti-mouse | Li-Cor | 926-32210 | WB: secondary |
| IRDye 800CW Goat anti-rabbit | Li-Cor | 926-32211 | WB: secondary |
| LINE-1 probe-mix primers | IDT | Sequences in Table 1 | |
| MicroAmp Optical 96-well reaction plate with barcode | Applied Biosystems, Life Technologies | 4306737 | also requires sealing film |
| Micro BCA Protein Assay kit | ThermoFisher Scientific | 23235 | measure protein concentration |
| MiniProtean TGX 10% gels | Bio-Rad | 456-1034 | WB: gel electrophoresis |
| NanoSight LM14C | Malvern Instruments | for NTA | |
| Nitrocellulose membrane 0.2 µm | Bio-Rad | 1620112 | WB: protein transfer |
| NucleoSpin Tissue XS | Macherey-Nagel | 740901.50 | for DNA extraction |
| Odyssey Blocking Buffer | Li-Cor | 927-40000 | WB: blocking, antibodies |
| PBS, 1X | Corning | 21-040-CVR | |
| Penicillin-streptomycin | Gibco, Life Technologies | DE17-602E | Antibiotics for culture media |
| Protein LoBind tube, 0.5 mL | Eppendorf | 22431064 | For storing Evs |
| REVERT Total Protein Stain and Wash Solution Kit | Li-Cor | 926-11015 | WB: total protein staining |
| RKO cell line | ATCC | CRL-2577 | for MSPA positive control |
| RPMI medium 1640 + GlutaMAX | Gibco, Life Technologies | 61870-010 | For HOS-143B cell culture |
| SALSA MLPA HhaI enzyme | MRC-Holland | SMR50 | |
| SALSA MLPA reagent kit | MRC-Holland | EK1-FAM | |
| SALSA MLPA P300 probe-mix | MRC-Holland | P300-100R | |
| Swinging rotor SW-28 | Beckman Coulter | 342207 | Ultracentrifugation |
| Syringe filter, 0.22 µm | Jet Biofil | FPE-204-030 | sterile filtering FBS |
| Tecnai 12 | FEI Company | equipped with Gatan Orius SC 1000B CCD-camera (Gatan Inc., USA); for TEM |
|
| TBS, 1X tablets | Medicago | 09-7500-100 | WB: buffer |
| Trans-Blot Turbo | Bio-Rad | WB: transfer | |
| Thermal cycler | ThermoFisher Scientific | TCA0096 | |
| TrypLE Express | Gibco | 12604-021 | for trypsinization of cells |
| TSG101 (clone 4A10) | Sigma | SAB2702167 | WB, dilution 1:500 |
References
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