Summary
Beskrevet her er bruk av en metyleringsspesifikk probeforsterkningsmetode for å analysere metyleringsnivåer av LINE-1-elementer i mesenchymale stamceller behandlet med osteosarkom-avledede ekstracellulære vesikler. Ultracentrifugering, en populær prosedyre for å skille ekstracellulære vesikler fra føtal storfe serum, er også demonstrert.
Abstract
Metyleringsspesifikk probeforsterkning (MSPA) er en enkel og robust teknikk som kan brukes til å oppdage relative forskjeller i metyleringsnivåer av DNA-prøver. Det er ressurssterk, krever små mengder DNA, og tar rundt 4-5 t praktisk arbeid. I den presenterte teknikken blir DNA-prøver først denaturert og deretter hybridisert til sonder som retter seg mot DNA på enten metylerte eller referansesteder som en kontroll. Hybridisert DNA er delt inn i parallelle reaksjoner, en gjennomgår bare ligation og den andre gjennomgår ligation etterfulgt av HhaI-mediert fordøyelse på unmethylated GCGC sekvenser. De resulterende DNA-fragmentene forsterkes av PCR og skilles av kapillær elektroforese. Metylerte GCGC-nettsteder fordøyes ikke av HhaI og produserer toppsignaler, mens umetylerte GCGC-nettsteder fordøyes og ingen toppsignaler genereres. Sammenligning av de kontrollnormaliserte toppene av fordøyd og ufordøyd versjoner av hver prøve gir metylering dosering forholdet mellom en DNA-prøve. Her brukes MSPA til å oppdage effekten av osteosarkom-avledede ekstracellulære vesikler (EV-er) på metyleringsstatusen til lange interspersed kjernefysiske element-1 (LINE-1) i mesenchymale stamceller. LINE-1s er repeterende DNA-elementer som vanligvis gjennomgår hypometylering i kreft, og i denne kapasiteten kan tjene som en biomarkør. Ultracentrifugering brukes også som en kostnadseffektiv metode for å skille ekstracellulære vesikler fra biologiske væsker (dvs. ved utarbeidelse av EV-utarmet fosterstorfeserum [FBS] og isolere EV-er fra osteosarkomkondisjonerte medier [differensial sentrifugering]). For metyleringsanalyse er tilpassede LINE-1-sonder utformet for å målrette tre metyleringssteder i LINE-1-promotersekvensen og syv kontrollsteder. Denne protokollen demonstrerer bruk av MSPA for LINE-1 metyleringsanalyse og beskriver utarbeidelsen av EV-utarmet FBS ved ultracentrifugering.
Introduction
DNA metylering er en stor epigenetisk modifikasjon som forekommer i menneskelige celler. DNA-metylering refererer til koblingen av metylgrupper til cytosinrester i CpG dinukleotider. Slike dinukleotider finnes vanligvis i klynger (CpG-øyer) i 5'-regionen av gener1. I normale celler finnes de fleste av disse dinukleotider i en umetylert tilstand, noe som tillater DNA-transkripsjon. Forresten, mange kreftformer er forbundet med hypermethylated CpG øyer og transkripsjonomic deaktivering2, spesielt i tumor suppressor gener, som igjen bidrar til ulike kjennetegn på kreft3.
På den annen side er lange ispedd kjernefysiske elementer-1 (LINE-1s eller L1s) repeterende, transposable DNA-elementer som normalt har høye nivåer av metylering på CpG-øyene. Metylering av LINE-1 forhindrer translokasjon og bidrar til å opprettholde genomintegriteten. I flere typer kreft er LINE-1 hypomethylated, noe som resulterer i aktivering og påfølgende retrotransposition-mediert kromosomustabilitet4. LINE-1 står for nesten 17% av det menneskelige genomet5,og metyleringsstatusen kan tjene som en indikator på globale genomiske metyleringsnivåer6. Global LINE-1 hypometylering anses å gå forut for overgangen av celler til en tumor fenotype7; Derfor holder det løfte som en potensiell markør for tidlig kreft utbrudd.
For tiden er det flere metoder for metyleringsanalyse, inkludert pyrosequencing, metyleringsspesifikk PCR, mikroarrayer og kromatinimmunnedbør1. Bruken av neste generasjons sekvensering har også gjort det mulig å innlemme genomomfattende tilnærminger til påvisning av DNA-metylering. Mange av disse metodene er avhengige av bisulfittbehandlet DNA, hvor uformede cytosiner omdannes til uracil og metylerte cytosiner forblir uendret. Men, arbeider med bisulfitt behandlet DNA har flere fallgruver, for eksempel ufullstendige konverteringer av unmethylated cytosines til uracil, partisk forsterkning av sekvenser, og sekvensering feil8.
I metyleringsspesifikk probeforsterkning (MSPA) retter sonder bestående av to oligonucleotides DNA-sekvenser som inneholder et begrensningssted (GCGC) for det metyleringsfølsomme restriksjonsenzymet HhaI9. Etter at sondene hybridiserer til DNA, er hver prøve delt inn i to sett. Sonder i det første settet gjennomgår ligation, mens sonder i det andre settet gjennomgår ligation etterfulgt av HhaI-mediert fordøyelse på umetylerte CGCG-steder. Begge settene med prøver forsterkes deretter av PCR, og produktene er adskilt av kapillær elektroforese. Sonder på umetylerte steder fordøyes av HhaI og forsterkes ikke under PCR, noe som resulterer i ingen toppsignaler. Derimot er sonder på metylerte steder beskyttet mot fordøyelsen og forsterkes derfor under PCR, og genererer deretter toppsignaler10.
MSPA har flere fordeler fremfor alternative metoder. For det første krever det en lav mengde DNA (50–100 ng) og er godt egnet for analyse av DNA fra formalin-faste parafininnebygde prøver10. Det krever ikke bisulfittbehandlet DNA; faktisk er det uegnet for DNA som er modifisert på denne måten. Mange prøver kan analyseres samtidig, og MSPA-sonder kan utformes slik at de målretter mot flere gener eller sekvenser samtidig. I tillegg er sondene spesifikke og følsomme for metylert DNA da HhaI-begrensningsstedet tilsvarer en sekvens som er typisk for CpG-øyene10.
Denne studien undersøkte effekten av osteosarkom (OS)-avledet ekstracellulære vesikler (EV- er) på LINE-1-metylering i fettvevsavledede mesenchymale stamceller (AT-MSCer; Figur 1). EV-er er nanoskala, membranbundne vesikler utskilt av de fleste celletyper. De bærer proteiner, lipider, mRNA, microRNA og flere molekyler fra overordnede celler11,12. Ev-er medierer intercellulær kommunikasjon og spiller viktige roller i flere patofysiologiske forhold13,14. En fersk studie viste at kreftavledede EV-er kan overføre aktive LINE-1 til mottakerceller15. Det har blitt rapportert tidligere at EV fra HOS-143B cellelinjen kan endre metyleringstatus for LINE-1 i MSCer, i tillegg til andre genetiske effekter16.
Når voksende celler for EV isolasjon, er det viktig å bruke EV-utarmet føtal storfe serum [FBS] i vekstmediet, siden FBS-avledede EV-er kan forstyrre EV fra andre kilder og hemme resultatene17,18. Ultracentrifugering er en av de vanligste metodene for å tømme EV-er fra FBS. Det er en relativt enkel og kostnadseffektiv prosedyre sammenlignet med alternativer som ultrafiltrering og kommersiell EV-utarmet FBS19. Her demonstrerer protokollen også hvordan man forbereder EV-utarmet FBS ved ultracentrifugering.
Denne artikkelen presenterer en detaljert protokoll for de nevnte teknikkene, fra isolering av EV-er fra en OS-cellelinje til metyleringsanalyse av LINE-1 i OS-EV-behandlede MCer (figur 1).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Denne studien ble godkjent av Etikkkomiteen i Helsinki og Uusimaa Hospital District (etisk godkjenning D. Nr. 217/13/03/02/2015).
1. Utarbeidelse av EV-utarmet FBS ved ultracentrifugering
- Ta FBS i (ultra)sentrifugerør og plasser dem i ultracentrifuge bøtter. For å sikre at ultracentrifugeringen går jevnt og trygt, balanserer bøttene innenfor 10 mg av hverandre.
- Legg bøttene på en svingende rotor (type SW28, k-faktor 246). Plasser rotoren i ultracentrifuge og kjør på 100.000 x g i 19 timer ved 4 °C.
- Samle forsiktig det lyse øvre laget av supernatanten (ca. ni tiendedeler) og overfør til et 50 ml rør. Ikke forstyrr eller pipette den mørkebrune pelleten, da den inneholder EV-er fra FBS.
- Før supernatanten gjennom et 0,22 μm filter i et nytt 50 ml rør.
- Legg til filtersteriliserte, EV-utarmede FBS til cellekulturmedier når du vokser celler for EV-isolasjon.
2. Isolering av osteosarkom-avledede EV-er
- Plate OS-celler (HOS-143B cellelinje) i en T-175 kolbe med RPMI 1640 medium, supplert med 10% normal FBS og 1% antibiotika (100 U / ml penicillin, 0,1 mg / ml streptomycin). Plasser kolben i en inkubator ved 37 °C og 5 % CO2.
- Når kolben er 70% -80% konfluent, vaske cellene med fosfatbufret saltvann (PBS) deretter vokse dem i media som inneholder 10% EV-utarmet FBS (heretter referert til som EV-utarmet media).
MERK: 1 x 106 HOS-143B-celler belagt i en T175-kolbe når 70 % samtidighet etter ca. 60 timer. - I løpet av de neste 48 h, samle betinget media fra osteosarkom celler etter hver 24 h og legge frisk EV utarmet media.
- Sentrifuge kondisjonert media ved 2500 x g for 20 min ved 4 °C for å fjerne celler og celleavfall. Overfør supernatanten til et nytt rør, og la rundt 2 ml media nederst.
MERK: Hvis det ikke fortsetter direkte med EV-isolasjon på dette stadiet, kan supernatanten lagres ved -80 oC. - Hell supernatanten i ultracentrifugerør og balansere dem som tidligere. Sentrifuge rørene ved 100.000 x g i 2 timer ved 4 °C.
- Kast forsiktig supernatanten, og la rundt 1 ml stå nederst. Tilsett rundt 20 ml PBS (0,1 μm filtrert) til røret og pipetten forsiktig for å vaske og suspendere EV-pelleten på nytt.
- Balansere rørene og utføre en ny runde med ultracentrifugering med de samme innstillingene.
- Fjern forsiktig supernatanten og resuspender EV-pelleten i 200 μL PBS ved å forsiktig pipettere. Oppbevar TV-ene i lavbindingsrør.
MERK: EV-er kan brukes med en gang eller ser si -80 °C til de er nødvendige.
3. Karakterisering av OS-EVs
MERK: Rensede EV-er kan karakteriseres ved vestlig blotting (WB), nanopartikkelsporingsanalyse (NTA) og transmisjonselektronmikroskopi (TEM)16.
- Utfør WB i henhold til standardprotokollen16 med EV-markører CD63, TSG101 og Hsp70, og med calnexin som en negativ kontroll for å indikere renhet i EV-prøven20.
- For NTA må du først fortynne EV-prøven i 0,1 μm filtrert eavlemlos PBS for å oppnå (ideelt) 30–100 partikler per ramme.
- Ta rundt 500 μL av prøven inn i en 1 ml sprøyte og legg den i innløpsporten på NTA-instrumentet. Kontroller at det er nok partikler per ramme, for nøyaktige målinger.
- Åpne NTA-programvaren og ta opp fem videoer av 60-tallets varighet, ved hjelp av kameranivå 13 ved omgivelsestemperatur. Under analysen bruker du deteksjonsterskelen = 5 og gevinst = 10.
- Analyser EV-prøver fra TEM som beskrevet tidligere21.
4. AT-MSC kultur
MERK: Humant fettvev for mesenchymal stamcelleisolasjon ble gitt som fettsuging aspirer (Department of Plastic Surgery, Laser Tilkka Ltd., Finland). Skriftlig informert samtykke ble tatt fra lipoaspirdonorene, som gjennomgikk elektive fettsugingsprosedyrer.
- Isolere AT-MCer fra fettsuging aspirer ved hjelp av standard mekaniske og enzymatiske isolasjonsmetoder22.
MERK: Små og mellomganger fra andre kilder (inkludert kommersielle cellelinjer) kan også brukes. - Kulturceller i DMEM /F-12 media supplert med 10% FBS og 1% antibiotika.
5. Behandling av mla-er med OS-EV-er
- Plate 15.000 AT-MSCer per brønn i en 24 brønnplate.
- Etter 24 timer, fjern de gamle mediene, vask celler med PBS, og bytt til EV-utarmet media.
- Behandle celler med OS-EVs (ved en partikkelkonsentrasjon på 1 x 106 EV-er per celle) på dag 1 (24 timer etter cellevedhet), dag 3 (48 timer etter dag 1) og dag 5 (96 timer etter dag 1).
- Stopp OS-EV-behandlingen for tidspunkt (TP) 0 prøver på dag 1, TP 3 prøver på dag 3 og TP 7 prøver på dag 7 (48 timer etter dag 5).
MERK: Andre tidsplaner for tidspunkter i henhold til de eksperimentelle planene kan også følges.
- Stopp OS-EV-behandlingen for tidspunkt (TP) 0 prøver på dag 1, TP 3 prøver på dag 3 og TP 7 prøver på dag 7 (48 timer etter dag 5).
- Trekk ut DNA fra mLA-ene ved hjelp av en passende metode. Inkluder positive og negative kontrollprøver for dataanalysen.
6. LINE-1 metyleringanalyse
- Design de tilpassede LINE-1 sonde primere, som gjort tidligere av Pavicic et al.23. For metyleringssonder velger du tre sekvenser som inneholder HhaI-begrensningsområdet innenfor arrangørregionen line-1. For kontrollsonder velger du syv sekvenser som mangler HhaI-begrensningsstedet fra resten av LINE-1-sekvensen.
MERK: LINJE-1-sekvensen er tilgjengelig i GenBank-databasen24 (L1.2, tiltredelsesnr. AH005269.2). Bruk MSPA-produsentens instruksjoner for utforming av sondene25. - Fortynn 70 ng DNA-prøve i TE-buffer til et volum på 5 μL.
- Utfør påfølgende termosykling og PCR-trinn som nevnt i tabell 1. Varm prøvene i 10 min ved 98 °C, og avkjøl deretter til 25 °C.
- Tilsett 3 μL sondehybridiseringsblanding i hver prøve og kjør termocycleren slik at sondene kan hybridisere til DNA-et.
- Ved romtemperatur (RT) tilsett 13 μL post-hybridiseringsblanding til hver prøve. Overfør 10 μL til et ekstra rør.
- Plasser begge settmedrørene i termocycleren og inkuber ved 48 °C i minst 1 min.
- Mens prøvene er ved 48 °C, tilsett 10 μL av ligationblandingen til det første settet med rør (ufordøyd serie) og 10 μL av ligation-fordøyelsesblandingen til det andre settet med rør (fordøyd serie). Kjør neste termocyclerprogram.
- Snurr ned rørene og sett termocycleren samtidig til 72 °C.
- Tilsett 5 μL polymeraseblanding til hvert rør og plasser rørene i termocycleren. Kjør PCR-programmet.
- Mens PCR-programmet kjører, må du klargjøre en løsning på 1 ml formamid som inneholder 2,5 μL størrelsesstandard. Pipette 10 μL av denne løsningen til hver brønn av en optisk 96 brønnplate (med strekkode).
- Etter PCR, fortynn de ufordøyd og fordøyd prøver til 1:100 og 1:200 henholdsvis i ultrarent vann. Tilsett 2 μL fortynnet PCR-produkt til 96-brønnplaten. Sentrifuge platen på 200 x g for 15-20 s for å fjerne luftbobler.
- Utfør fragmentanalyse av prøver etter kapillær elektroforese.
MERK: Platen skal oppbevares ved 4 °C i mørket til analysen.
7. Fragmenter dataanalyse
- Åpne kapillær elektroforese resulterer i en elektropherogram analyse programvare.
- Velg MLPA fra menyen under Panel-kolonnen. Klikk på Panel-overskriften og trykk CTRL+D for å bruke MLPA på alle eksempler.
- På samme måte angir du analysemetoden til Microsatellite-standard for alle eksempler.
- Velg alle eksempler og klikk på Grønn avspilling-knappen for å analysere prøvene i henhold til de valgte innstillingene.
- Velg alle eksempler og klikk på Graf-knappen for å visualisere probetoppene.
- Zoom inn på toppområdet for høyere oppløsning av de enkelte sondetoppene. Kontroller at alle 10 toppene som tilsvarer sondene fra LINE-1-sondeblandingen er merket. Kast flere topper (<95 bp og >160 bp).
- Eksporter resultatene i CSV-formatet (kommadelt verdier) i kategorien Genotypes.
- Åpne filen CSV i en dataanalyseprogramvare, og sorter dataene i kolonner.
- Label de tre metylering området topper basert på deres omtrentlige størrelser (L1-1m på 153 bp, L1-2m på 119 bp, L1-3m på 133 bp). De resterende syv toppene tilsvarer kontrollsondene.
MERK: Her brukes verdiene til L1-2m-sondetoppene, som har en størrelse på 117 bp, siden den regionen har blitt brukt i de fleste LINE-1-metyleringsanalyser23. - For hver prøve (ufordøyd og fordøyd), beregner du sumtoppområdet for alle syv kontrolltopper. Del toppområdet for hver LINE-1-sonde med denne summen.
- For hver DNA-prøve deler du verdien av den fordøyde prøven med den ufordøyde prøven for å oppnå doseringsforholdet (DM)ved hjelp av følgende ligning:
Hvor: DM er metylering dosering ratio, Ax er området under topp x (f.eks L1-2m topp), og Actrl er summen toppområdet av alle syv kontroll sonder.
- Label de tre metylering området topper basert på deres omtrentlige størrelser (L1-1m på 153 bp, L1-2m på 119 bp, L1-3m på 133 bp). De resterende syv toppene tilsvarer kontrollsondene.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Hovedmålet med denne studien var å evaluere de epigenetiske effektene av OS-EVs på MSCer. OS-EVs ble isolert fra HOS-143B-celler ved hjelp av standard differensialsentrifugeringsmetode. Uttrykk for de typiske EV-markørene CD63, Hsp70 og TSG101 ved vestlig blotting bekreftet tilstedeværelsen av OS-EV-er. (Figur 2A). Fravær av calnexin signal indikerte renhet av OS-EV isolat. Ytterligere indikasjon på renhet ble observert med TEM, med intakte vesikler av forskjellige størrelser som var tilstede (figur 2B). Den gjennomsnittlige OS-EV partikkelkonsentrasjonen var 7,63x1011/ml (figur 2C). Størrelsesfordelingen av EV-er varierte fra 50–500 nm, og rundt 80 % av partiklene falt innenfor 50–200 nm-området (figur 2D).
AT-MSCer ble behandlet med OS-EVs og DNA ble hentet fra MCene på forskjellige tidspunkter. LINE-1 metylering ble analysert av MS-MLPA og beregnet i form av metylering dosering ratio. Resultater fra TP 0 ble brukt til å bestemme baseline metyleringsnivåer (stiplet linje) (figur 3). Ved TP 3 (grønne kolonner) ble det observert en reduksjon i gjennomsnittlig doseforhold for linje-1 metylering i MSCer når de ble behandlet med OS-EV-er, som faller under baseline metyleringsnivåer. Dette hypometyleringfenomenet var mer subtilt ved TP 7 (blå kolonner), og gjennomsnittlig metytingdoseringsforhold var litt høyere i både ubehandlede og EV-behandlede kjønnssykdommer sammenlignet med grunnlinjen.
Figur 1: Eksperimentell arbeidsflyt. EV-er ble isolert fra HOS-143B-celler ved differensialsentrifugering og preget av vestlig blotting, TEM og NTA. AT-MSCer ble behandlet med OS-EVs på forskjellige tidspunkter (TP 0, 3, en 7). DNA ble hentet fra msCs og LINE-1 metylering ble analysert av MSPA. Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Karakterisering av EV-er. (A) Tilstedeværelsen av EV-markører CD63, Hsp70 og TSG101 bekreftet tilstedeværelsen av EV-er ved vestlig blotting, mens ingen bånd ble observert for calnexin, noe som indikerer renheten til EV-isolaten. 10 μg protein ble lastet for både HOS-143B proteinlysat og OS-EVs. (B) TEM bekreftet tilstedeværelsen av intakte EV-er av forskjellige størrelser i isolat. (C) Partikkelkonsentrasjon og (D) størrelsesfordeling av OS-EV-er ble bestemt av NTA-målinger. Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.
Figur 3: Doseringsforhold for metylering av LINE-1 fra MC-er enten ubehandlet eller behandlet med OS-EV-er. Den stiplede grå linjen representerer baseline metyleringsverdi, som tilsvarer TP 0-verdier. Grønne kolonner representerer gjennomsnittlige doseringsforhold uten og med OS-EV-behandling for TP 3-prøver, mens blå kolonner representerer det samme for TP 7-prøver. Både TP 3- og TP 7-prøvene viste en reduksjon i metyleringsnivåer etter behandling med OS-EV-er. Forskjellen var imidlertid større i TP 3-prøver, hvor metyleringsnivået etter EV-behandling også var lavere enn baselineverdien. Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.
Tabell 1: MSPA reagens blanding oppskrifter og termocycler / PCR programmer. De nevnte volumene representerer en DNA-prøve. Det bør bemerkes at polymeraseblandingen skal tilberedes for 2x så mange prøver som tidligere mikser, siden det er to sett med rør på dette stadiet. Detaljer om det påfølgende termosykling eller PCR-programmet er gitt til høyre.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne studien illustrerer hvordan MSPA kan brukes til å oppdage og kvantifisere metyleringsstatusen til et bestemt genetisk element. LINE-1 var fokusher, men sondene kan utformes for å målrette en rekke gener og sekvenser. Videre er det en voksende liste over sondeblandinger tilgjengelig for ulike applikasjoner. MSPA er en enkel og robust teknikk for DNA metylering analyse som ikke krever bisulfitt konvertering10. Den fullstendige prosedyren fra prøveforberedelse til dataanalyse tar rundt 2 dager, men innebærer bare 4–5 t faktisk praktisk arbeid. Det gjelder for små mengder DNA (så lavt som 70 ng), som demonstrert her.
Den viktigste delen av metyleringsanalyseprotokollen er utarbeidelsen av tilpassede sondeblandinger, for eksempel LINE-1-sondeblandingen i denne studien. På grunn av deres forskjellige lengder ble LINE-1-sondeoligonucleotides syntetisert i området 4-40 nM, så oppløsningstrinnet og påfølgende fortynninger måtte utføres nøye, i henhold til produsentens instruksjoner25. PCR og flere termosykling programmer av protokollen som brukes her skiller seg fra de i den opprinnelige produsentens versjon.
Det er noen forholdsregler knyttet til HhaI-enzymet. For det første avhenger volumet av enzymet som brukes i ligation-fordøyelsesblandingen, på produsenten, og versjoner av enzymet som er motstandsdyktige mot varmeinaktivering, er ikke egnet for MSPA. Med noen enzymer kan det være tilfeller av ufullstendig fordøyelse, noe som ville resultere i dannelse av defekte PCR-produkter og avvikende toppsignaler. Til slutt, i hvilken grad de endelige PCR-produktene fortynnes for kapillær elektroforese, avhenger av sondene. Første kjøringer vil sannsynligvis innebære optimaliseringer, som det anbefales å teste en rekke fortynninger.
Det er visse begrensninger av MSPA, for eksempel den selektive naturen til HhaI-mediert DNA fordøyelse. Hha (andre) Jeg cleaves DNA bare på unmethylated GCGC sekvenser og ignorerer andre forekomster av CpG dinukleotider som ikke er omsluttet av en G og C, selv om de er plassert innenfor CpG øyene. Som et resultat kan metyleringsstatusen til slike dinukleotider (og de som er plassert utenfor målsekvensen til sondene) ikke bestemmes. LINE-1-sondeblandingen kan inneholde flere sonder som inneholder flere GCGC-sekvenser fra arrangørregionen24,og dermed representerer et større antall metyleringssteder.
Alternativt, andre metylering-spesifikke begrensningenzymer, som SacII og MluI, som har en annen begrensning nettsted enn hhajeg kan brukes i tillegg i MSPA, som kan gi en bredere representasjon av globale metylering nivåer26. For det andre, som observert med TP 7 prøver, kan forskjellene i metylering dosering forholdet være ganske subtile. Dette kan skyldes det høye kopiantallet LINE-1s i genomet5, som har høye nivåer av global metylering under normale forhold og vil i stor grad være upåvirket av forbigående hypometyleringshendelser på bare noen få CpG-nettsteder. Videre er MCene heterogene når det gjelder differensieringsstadiet og i cellesyklusen, noe som kan påvirke baseline metyleringsverdien. Til slutt kan MSPA bare oppdage relative forskjeller i DNA-metylering og krever referanseprøver av denne grunn. I slike tilfeller kan metoder som direkte oppdager lokal metylering være mer hensiktsmessig, selv om de kan kreve bisulfitetkonverteringtrinn27.
Siden denne studien involverte bruk av ekstracellulære vesikler, demonstrerte vi også utarbeidelsen av EV-utarmet FBS, som er en viktig del av cellekulturmedier for EV-isolasjon. Ultracentrifugation er en billig prosess som effektivt kan skille EV-er fra resten av FBS. Men 19 h av sentrifugering gjør det til en mer tidkrevende metode enn alternativer, for eksempel ultrafiltrering og kommersielle versjoner19. Ultracentrifugering krever også nøye håndtering av prøven, for eksempel ved balansering av rørene før sentrifugering og innsamling av supernatanten etterpå. Til tross for disse utfordringene er det en populær metode for å skille EV-er fra biologiske væsker.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble finansiert av Universitetet i Helsinki prosjektfinansiering (WBS490302, WBS73714112) Helsinki Universitetssykehus Statlig finansiering for universitetsnivå helseforskning (Y1014SUL05, TYH2016130), finsk-Norsk Medisinsk Foundation, og Selma og Maja-Lisa Selander Fund (Minerva Foundation). Vi takker Walter Pavicic for å ha gitt den modifiserte MSPA-protokollen og for relatert teknisk støtte. Vi er takknemlige til Teemu Masalin (Universitetet i Helsinki) for å hjelpe oss med videoproduksjon.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL syringe | Terumo | SS+01T1 | for NTA |
| 24-well plate | Corning | 3524 | MSC cell culture |
| 3730xl DNA Analyzer | Applied Biosystems, ThermoFisher Scientific | 3730XL | |
| 50 mL centrifuge tube | Corning | 430829 | |
| Beckman Optima LE-80K Ultracentrifuge | Beckman | ||
| BlueStar Prestained Protein Marker | Nippon Genetics | MWP03 | WB: protein marker |
| Calnexin (clone C5C9) | Cell Signaling Technology | 2679 | WB, dilution 1:800 |
| CD63 (clone H5C6) | BD Biosciences | 556019 | WB, dilution 1:1000 |
| Centrifuge 5702 R | Eppendorf | 5703000010 | For conditioned media and cells |
| Centrifuge 5810 | Eppendorf | 5810000010 | For spinning down 96-well plate |
| Centrifuge tube (polyallomer, 14x95 mm) | Beckman | 331374 | Ultracentrifugation |
| DMEM/F-12 + GlutaMAX medium | Gibco, Life Technologies | 31331-028 | For AT-MSC culture |
| Fetal bovine serum | Gibco, Life Technologies | 10270-106 | |
| GeneScan 500 LIZ size standard | Applied Biosystems, Life Technologies | 4322682 | for capillary electrophoresis |
| GenomePlex Complete Whole Genome Amplification (WGA) Kit | Sigma | WGA2-10RXN | for MSPA negative control |
| Hi-Di formamide | Applied Biosystems, Life Technologies | 4311320 | for capillary electrophoresis |
| HOS-143B cell line | ATCC | CRL-8303 | |
| Hsp70 (clone 5G10) | BD Biosciences | 554243 | WB, dilution 1:1000 |
| IRDye 800CW Goat anti-mouse | Li-Cor | 926-32210 | WB: secondary |
| IRDye 800CW Goat anti-rabbit | Li-Cor | 926-32211 | WB: secondary |
| LINE-1 probe-mix primers | IDT | Sequences in Table 1 | |
| MicroAmp Optical 96-well reaction plate with barcode | Applied Biosystems, Life Technologies | 4306737 | also requires sealing film |
| Micro BCA Protein Assay kit | ThermoFisher Scientific | 23235 | measure protein concentration |
| MiniProtean TGX 10% gels | Bio-Rad | 456-1034 | WB: gel electrophoresis |
| NanoSight LM14C | Malvern Instruments | for NTA | |
| Nitrocellulose membrane 0.2 µm | Bio-Rad | 1620112 | WB: protein transfer |
| NucleoSpin Tissue XS | Macherey-Nagel | 740901.50 | for DNA extraction |
| Odyssey Blocking Buffer | Li-Cor | 927-40000 | WB: blocking, antibodies |
| PBS, 1X | Corning | 21-040-CVR | |
| Penicillin-streptomycin | Gibco, Life Technologies | DE17-602E | Antibiotics for culture media |
| Protein LoBind tube, 0.5 mL | Eppendorf | 22431064 | For storing Evs |
| REVERT Total Protein Stain and Wash Solution Kit | Li-Cor | 926-11015 | WB: total protein staining |
| RKO cell line | ATCC | CRL-2577 | for MSPA positive control |
| RPMI medium 1640 + GlutaMAX | Gibco, Life Technologies | 61870-010 | For HOS-143B cell culture |
| SALSA MLPA HhaI enzyme | MRC-Holland | SMR50 | |
| SALSA MLPA reagent kit | MRC-Holland | EK1-FAM | |
| SALSA MLPA P300 probe-mix | MRC-Holland | P300-100R | |
| Swinging rotor SW-28 | Beckman Coulter | 342207 | Ultracentrifugation |
| Syringe filter, 0.22 µm | Jet Biofil | FPE-204-030 | sterile filtering FBS |
| Tecnai 12 | FEI Company | equipped with Gatan Orius SC 1000B CCD-camera (Gatan Inc., USA); for TEM |
|
| TBS, 1X tablets | Medicago | 09-7500-100 | WB: buffer |
| Trans-Blot Turbo | Bio-Rad | WB: transfer | |
| Thermal cycler | ThermoFisher Scientific | TCA0096 | |
| TrypLE Express | Gibco | 12604-021 | for trypsinization of cells |
| TSG101 (clone 4A10) | Sigma | SAB2702167 | WB, dilution 1:500 |
References
- Esteller, M. Cancer epigenomics: DNA methylomes and histone-modification maps. Nature Reviews Genetics. 8, 286-298 (2007).
- Herman, J. G., Baylin, S. B. Gene silencing in cancer in association with promoter hypermethylation. New England Journal of Medicine. 349, 2042-2054 (2003).
- Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of Cancer: The Next Generation. Cell. 144 (5), 646-674 (2011).
- Howard, G., Eiges, R., Gaudet, F., Jaenisch, R., Eden, A. Activation and transposition of endogenous retroviral elements in hypomethylation induced tumors in mice. Oncogene. 27, 404-408 (2008).
- Lander, E. S., et al. Initial sequencing and analysis of the human genome. Nature. 409, 860-921 (2001).
- Rodriguez, J., et al. Chromosomal instability correlates with genome-wide DNA demethylation in human primary colorectal cancers. Cancer Research. 66, 8462 (2006).
- Feinberg, A. P., Ohlsson, R., Henikoff, S. The epigenetic progenitor origin of human cancer. Nature Reviews Genetics. 7, 21-33 (2006).
- Bock, C., et al. BiQ Analyzer: visualization and quality control for DNA methylation data from bisulfite sequencing. Bioinformatics. 21 (11), 4067-4068 (2005).
- Schouten, J. P., et al. Relative quantification of 40 nucleic acid sequences by multiplex ligation-dependent probe amplification. Nucleic Acids Research. 30, 57 (2013).
- Nygren, A. O. H., et al. Methylation-Specific MLPA (MS-MLPA): simultaneous detection of CpG methylation and copy number changes of up to 40 sequences. Nucleic Acids Research. 33 (14), 128 (2005).
- El Andaloussi, S., Mager, I., Breakefield, X. O., Wood, M. J. Extracellular vesicles: biology and emerging therapeutic opportunities. Nature Reviews Drug Discovery. 12, 347-357 (2013).
- Vallabhaneni, K. C., et al. Extracellular vesicles from bone marrow mesenchymal stem/stromal cells transport tumor regulatory microRNA, proteins, and metabolites. Oncotarget. 6 (7), 4953-4967 (2015).
- Ratajczak, J., Wysoczynski, M., Hayek, F., Janowska-Wieczorek, A., Ratajczak, M. Z. Membrane- derived microvesicles: important and underappreciated mediators of cell-to-cell communication. Leukemia. 20, 1487-1495 (2006).
- Lee, T. H., et al. Microvesicles as mediators of intercellular communication in cancer- the emerging science of cellular "debris". Seminars in Immunopathology. 33, 455-467 (2011).
- Kawamura, Y., Calle, A. S., Yamamoto, Y., Sato, T., Ochiya, T. Extracellular vesicles mediate the horizontal transfer of an active LINE-1 retrotransposon. Journal of Extracellular Vesicles. 8, 1643214 (2019).
- Mannerström, B., et al. Epigenetic alterations in mesenchymal stem cells by osteosarcoma-derived extracellular vesicles. Epigenetics. 14 (4), 352-364 (2019).
- Shelke, G. V., Lässer, C., Gho, Y. S., Lötvall, J. Importance of exosome depletion protocols to eliminate functional and RNA-containing extracellular vesicles from fetal bovine serum. Journal of Extracellular Vesicles. 3, 24783 (2014).
- Wei, Z., Batagov, A. O., Carter, D. R., Krichevsky, A. M. Fetal bovine serum RNA interferes with the cell culture derived extracellular RNA. Scientific Reports. 6, 31175 (2016).
- Kornilov, R., et al. Efficient ultrafiltration-based protocol to deplete extracellular vesicles from fetal bovine serum. Journal of Extracellular Vesicles. 7, 1422674 (2018).
- Théry, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids. Current Protocols in Cell Biology. 30 (1), 1-29 (2006).
- Puhka, M., et al. Metabolomic profiling of extracellular vesicles and alternative normalization methods reveal enriched metabolites and strategies to study prostate cancer-related changes. Theranostics. 7 (16), 3824 (2017).
- Peltoniemi, H. H., et al. Stem cell enrichment does not warrant a higher graft survival in lipofilling of the breast: A prospective comparative study. Journal of Plastic, Reconstructive & Aesthetic Surgery. 66 (11), 1494-1503 (2013).
- Pavicic, W., Joensuu, E. I., Nieminen, T., Peltomäki, P. LINE-1 hypomethylation in familial and sporadic cancer. Journal of Molecular Medicine. 90, 827-835 (2012).
- L1.2 sequence on GenBank (accession number: AH005269.2). , Available from: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/AH005269 (2000).
- Designing synthetic MLPA probes (v04). MRC-Holland. , Available from: https://support.mlpa.com/downloads/files/designing-synthetic-mlpa-probes (2018).
- Takara Bio Inc. , Available from: https://www.takarabio.com/us/products/cell_biology_and_epigenetics/epigenetics/dna_preparation/msre_overview (2018).
- Pisanic, R., et al. Long interspersed nuclear element 1 retrotransposons become deregulated during the development of ovarian cancer precursor lesions. The American Journal of Pathology. 189 (3), 513-520 (2019).
