Summary
我们开发了一种基于干细胞移植、阴道内人体免疫缺陷病毒暴露和滴数字PCR RNA的人性化和人体免疫缺陷病毒感染NOG小鼠模型的生成和评估方案量化。
Abstract
人化小鼠为研究人类免疫缺陷病毒（HIV）病毒学和测试抗病毒药物提供了一个复杂的平台。该协议描述了在成年NOG小鼠中建立人体免疫系统。在这里，我们解释从分离脐带血衍生人类CD34+细胞及其随后静脉移植到小鼠，到通过艾滋病毒感染操作模型，联合抗逆转录病毒疗法的所有实际步骤（cART）和血液取样。约75，000 hCD34+细胞静脉注射到小鼠和人类血化水平，也称为人化，在外周血液纵向估计数月的流动细胞测定。共有75，000个hCD34+细胞在外周血中产生20%~50%的人类CD45+细胞。小鼠易感染阴道内艾滋病毒，血液可每周取样一次进行分析，并每月两次，持续一次。该协议描述了使用滴数字PCR（ddPCR）定量血浆病毒载量的测定。我们展示了如何在饮食中使用标准的护理CART方案来有效地治疗小鼠。以常规小鼠小周的形式交付cART是实验模型的一个重大改进。该模型可用于全身和局部暴露前预防化合物的临床前分析，以及检测新疗法和艾滋病毒治疗策略。
Introduction
人体免疫机能丧失病毒（HIV）是一种慢性感染，全世界有3700多万感染者。联合抗病毒疗法（cART）是一种拯救生命的疗法，但治愈仍有必要。因此，需要动物模型来反映人类免疫系统及其反应，以便促进艾滋病毒的持续研究。通过将人类细胞移植到严重免疫缺陷的小鼠2中，已经开发出多种能够支持细胞和组织移植的人性化小鼠。这种人性化的小鼠容易感染艾滋病毒，为非人类灵长类动物模拟免疫缺陷病毒模型提供了重要的替代品，因为它们比非人类灵长类动物更便宜、更易于使用。人化小鼠促进了HIV病毒传播、发病机制、预防和治疗3、4、5、6、7、8、9、10、11的研究。
我们提出了一个灵活的人性化模型系统，通过移植脐带血衍生的人类干细胞到NOD小鼠中，为HIV研究开发。Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Sug/JicTac （NOG） 背景。除了非胎儿来源外，这些小鼠的实际生物工程在技术上比移植血-肝-胸腺（BLT）结构的显微手术要求低。
我们展示了如何通过阴道内传播建立HIV感染，以及如何监测血浆病毒载量与敏感滴数字PCR（ddPCR）为基础的设置。随后，我们描述了作为日常小鼠饮食的一部分而给出的标准cART的建立。这些组合方法的目的是减轻动物的压力，促进大规模实验，其中处理每只动物的时间是有限的12。
在人类中，CCR5[32/wt]或CCR5+32/ +32基因型导致 HIV 感染传播者/创始人病毒13的易感性降低，在生物工程将具有干细胞的小鼠用于HIV研究时，必须采取一些预防措施。这在我们地区尤其如此，因为CCR5基因中自然发生的变异，特别是#32缺失，在斯堪的纳维亚和波罗的海本地种群中比世界其他地区更普遍14，15。因此，我们的方案包括一种简单、高通量的测定，用于在移植前筛选供体造血干细胞的CCR5变异。
对于阴道内暴露，我们选择了发射器/创始人R5病毒RHPA4259，从感染早期被感染的妇女分离出来，她被感染在阴道内16。我们让小鼠接触的病毒剂量足以使大多数小鼠成功传播，但传播率低于100%。选择这种剂量可以使传播速率有足够的动态范围，使候选药物的抗病毒效应可以在艾滋病毒预防实验中导致受保护动物，并减少治疗研究的病毒载量。
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Protocol
所有脐带血样本均严格按照当地批准的协议进行，包括父母匿名献血的知情同意。根据许可证 2017-15-0201-01312，所有动物实验均严格按照丹麦国家法规进行。
注意：小心处理暴露的艾滋病毒小鼠和血液。用经证实的HIV消毒剂（材料表）清除所有与艾滋病毒接触的表面和液体。
1. 人类CD34+干细胞的分离
- 在计划剖腹产或阴道分娩后，在EDTA涂层的采血管中采集脐带血样本，并符合当地道德批准。
- 根据制造商的协议，通过密度梯度分离从脐带血中分离PMBC。
- 通过先用抗体对成熟细胞的常见标记进行预浓缩，从而从PBMC种群中分离CD34+细胞，从而诱导不希望的谱系细胞与红血球的交联。然后，根据制造商的协议，使用磁珠进行CD34+细胞浓缩。
- 通过在 90 μL 的试青蓝中重新悬浮 10 μL 的细胞悬浮量，通过标准试青蓝排除确定活细胞计数。根据制造商的协议，将10μL的溶液添加到血球仪中，并计算非蓝色细胞。
- 在胎儿牛血清（FBS）中，在1mL的10%DMSO中冷冻保存CD34+细胞，直到小鼠移植当天。
- 可单独冷冻分离（CD34+）和流通细胞（CD34-）的一小部分，以评估CD34+干细胞纯度（每个样本的30，000个细胞）。或者，测试新鲜富集细胞的纯度（见下文步骤2）。
- 冻结一小部分非颗粒流通（CD34-），以测定CCR5+32状态。细胞可以直接冷冻，无需条件冷冻溶液，但如果流过颗粒，颗粒中红血球的存在可以抑制随后的PCR。
2. 通过流式细胞测定评估CD34+干细胞纯度
- 解冻分离的细胞（CD34+）和流通细胞（CD34-）。在室温（RT）FACS缓冲液中，将每个小瓶中的细胞重新悬浮，由磷酸盐缓冲盐水（PBS）中的2%胎儿牛血清（FBS）组成，洗涤细胞。
- 在RT至颗粒细胞的300 x g下离心5分钟。
- 倒下上清液，将细胞重新悬浮在剩余的液体中，然后转移到FACS管中。使用 3 mL 的 FACS 缓冲液重复洗涤步骤。第二次离心后，倒出上清液，将细胞重新悬浮在剩余的液体中。
- 加入5μL的Fc受体阻断溶液（材料表），在RT停留10分钟。请勿冲洗 Fc 受体阻塞溶液。
- 加入含有预定体积抗体的混合物，对抗人类CD3（克隆SK7）BUV395、CD34（克隆AC136）、FITC和CD45（克隆2D1）APC（表1）。在黑暗中，在RT处将细胞保持30分钟。荧光水表必须根据可以使用可用流量细胞计评估的参数来选择，而无需补偿矩阵。
- 用3 mL的FACS缓冲液清洗细胞。
- 在RT处以300 x g离心5分钟，以颗粒细胞。
- 倒出上清液，将细胞重新悬浮在剩余的液体中。
- 重复此洗涤步骤 2x，以确保已去除所有未结合的抗体。
- 在流式细胞仪（材料表）上记录样品，并用适当的软件进行数据分析。浇注策略如图1A+F所示。
3. 脐带血中CCR5+32变异的基因筛查
- 用含有200 μM dNTP混合物、0.01 U/μL高保真DNA聚合酶的PCR混合物，以及表2中详述的正向和反向底漆，孵育1.25μL的非颗粒流通。
- 将无核酸酶水的体积调节到每个PCR反应约12.5μL。
- 使用表3中详述的PCR循环程序扩增基因组片段。
- 在2%的甘蔗凝胶13上分离PCR产品。
- 来自野生型等位子和β32等位子的PCR产物分别产生196个碱基对和164个碱基对带的PCR片段，使它们很容易通过凝胶电泳13（图1G）来区分。
4. 静脉干细胞移植
注：让一个人在实验室中准备细胞，另一个人准备小鼠和工作空间进行移植是一种有效的方法。
- 在动物设施中，在计划移植干细胞前4~6小时，照射6-7周大雌性NOD。Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Sug/JicTac （NOG） 小鼠 （材料表） 与 0.75 Gy 与 Cs137源。最佳预处理剂量可能因小鼠年龄、辐射源和其他因素而异。这个过程使动物成功地与人类干细胞结合。
- 在动物设施中，在将小鼠或细胞带入工作空间之前，先准备流动工作台工作区和所有试剂。
- 放置无菌蓝色垫以覆盖流动台的工作表面。准备无菌纱布和锐化容器。
- 将用70%乙醇消毒的加热灯放在流动台中，在加热下方放置一个空无菌的鼠标笼。
- 在实验室中，解冻分离的CD34+细胞，并将其稀释至9 mL的37°C普通RPMI中。
- 在RT处以350 x g离心细胞5分钟，通过吸入丢弃上清液，并在37°C下将颗粒重新悬浮在1 mL的普通RPMI中。
- 通过试孔蓝排除确定细胞计数，并将音量调整到每只鼠标 200 μL。额外考虑后续处理步骤可能造成的损失。
- 准备每200μL将75，000个CD34+细胞移植到每只小鼠体内。
- 在移植前，细胞在运送到动物设施时可保持在4°C。避免将细胞留在冰上以减少聚集或聚集。
- 在动物设施中，将笼子与小鼠一起放入流动台，并将小鼠转移到加热灯下的笼子以稀释血管。把笼子的一端远离热源，这样老鼠在变热后就可以远离热源。已经移动到笼子末端的老鼠，远离热源，足够温暖，可以成功注射尾静脉。
- 将 1 mL 润滑注射器加载到 800 μL 标记以上，并带有悬浮 CD34+ 细胞。使用润滑的 1 mL 注射器将极大地缓解静脉注射，并提高该技术的精度。
- 连接 30 G 13 mm 针头，并准备针头和注射器进行注射。这种操作顺序允许加快注射器的加载速度，同时保护移植细胞的完整性，因为在通过这种小量针快速吸入细胞期间可能发生损伤。通过按下柱塞，将液体取出至针的 200 μL 标记，将针轮毂填充液体。
- 将加热的鼠标（步骤 4.6）放入用于静脉注射的抑制器中。小心地将200 μL的细胞悬浮液注入小鼠的尾静脉。花 2 s 执行跳投，并在注射完成后将针插入约 2 s。这可确保细胞在取出针头之前已经充分迁移到远离注射部位的地方。
- 必要时，用无菌纱布擦拭小鼠尾巴，以去除任何可见的血液。将鼠标放回非加热家庭笼中。对剩余的小鼠重复注射过程。
5. 血液收集和处理进行分析
注：在人类干细胞移植后3~5个月，可通过流式细胞测定评估外周血的人体细胞移植。
- 使用当地IACUC批准的技术从小鼠身上抽取血液样本。
- 将总血量的70~100μL收集到含有10μL0.5M EDTA（pH = 8.0）的无菌PCR微离心管中，以避免血液凝固。
6. 通过流动细胞学评估人体移植物
- 将40~50μL的血液输送到FACS管。
- 加入5μL的Fc受体阻断溶液，以防止抗体的非特异性结合，并在RT停留10分钟。
- 加入含有CD4（克隆SK3）BUV 496的小鼠抗人抗体混合物， CD8（克隆RPA-T8）BV421，CD3（克隆OKT3）FITC，CD19（克隆sj25c1）PE-Cy7，CD45（克隆2D1）APC（表4），在RT处在黑暗中染色30分钟。
- 在每个管中加入2 mL适当的红细胞乳化缓冲液，以对红血球进行分管。使用专为红细胞赖沙前抗体染色配制的赖合缓冲液（材料表中给出了一个合适的示例）。涡旋简要，以确保细胞在解液中的均匀分布，并在RT处保持10分钟。
- 加入2 mL的FACS缓冲液，以阻止发疮反应。
- 在RT处以300 x g离心5分钟，以颗粒细胞。
- 轻轻倒出上清液和涡流，直到细胞被重新悬浮。
- 在RT处300 x g下加入3 mL的FACS缓冲液和离心机5分钟。
- 倒出上清液，重新悬浮细胞。
- 将样品记录在适当的流量细胞仪上，并使用适当的软件（材料表）进行分析。具有代表性的分析和结果如图2和图3所示。
7. 阴道内艾滋病毒暴露
注：用于小鼠阴道内暴露的病毒可以使用先前公布的协议17产生。该病毒保持在-80°C，并在位置之间传播，同时根据当地批准的协议储存在干冰上。病毒储存在干冰上，直到小鼠接触前。该病毒可稀释成普通RPMI（避免含有抗生素或血清添加剂的RPMI），以便在接触前达到适当的浓度（21，400 IUs用于此IVAG暴露）。一旦产生，在整个过程中将稀释的库存保存在湿冰上，以避免解冻后，如果稀释的病毒被放回干冰上，就会发生冻融循环。
- 在将鼠标或病毒带入流台之前，请准备好图 4所示的所有设备和流台工作台工作区（类似于步骤 4.2）。
- 在艾滋病毒暴露过程中，将加热灯对焦放在鼠标所在的工作空间中心。加热灯将确保小鼠的体温不会降低。也可以使用控制温度的其他设备（例如，根据当地 IACUC 法规18，加热凝胶垫或循环温水毯）。
- 将无菌 20 μL 移液器吸头和适当的移液器放入工作台。在工作台上放置一个装有液体消毒剂（材料表）的容器，以便立即使与病毒接触的材料和液体失活。
- 将鼠标放入装有 3% 无二苯气体和纸巾的室内。这个百分比的气体将在2-4分钟内麻醉动物。与免疫缺陷小鼠使用的所有其他材料一样，麻醉设备在使用前必须经过适当消毒。
- 麻醉后，将鼠标转移到加热灯下的无菌蓝色垫上。将鼠标鼻塞插入面罩，提供连续 3% 的子胶气体以保持麻醉。将鼠标放在尾部底部，胃朝上，手支撑鼠标，如图4所示。
- 使用无菌移液器尖端，通过轻轻地朝上向向上抚摸来刺激生殖器区域，以诱导直肠排空，减轻阴道的压力。
- 小心裸露阴道开口，将鼠标尾巴包裹在手指上，使外阴自然打开，也许使用无菌移液器尖端进行轻微的微微。
- 将移液器尖端和移液器 20 μL 的病毒一入小鼠阴道，而不会产生气泡。不要将尖端插入阴道深处。相反，随着外阴打开，将移液器尖端放在阴道开口的水平，避免深入，以消除在接种过程中擦伤的可能性，释放病毒，并允许重力将病毒拉入阴道。或者，使用22 G 1.25毫米钝端直针，如韦塞利诺维奇等人6所述。
- 将鼠标保持在此位置，阴道朝上接触后 5 分钟，以避免病毒悬浮液的重力泄漏。
- 小心地将鼠标放入家庭笼子，注意将鼠标放在其背上。
8. 在病毒载量分析之前处理血液样本
- 如上文第 5 节所述，采集血液。
- 在RT处以500 x g将血液样本离心5分钟，以分离血浆和细胞。
- 收集40μL的血浆，用于病毒载量测量，放入新的无菌PCR批准的微离心管中，并在-80°C下储存至少1小时，直到进一步处理。在RNA提取之前冷冻所有样品非常重要，以避免将RNA分离前未冻结的样品中的RNA水平与RNA分离前冷冻的样品进行比较的风险。
- 通过添加40μL的悬浮介质（PBS，带2.5%牛血清白蛋白、50U/mL青霉素和链霉素，以及10U/mLDNase，在0.22μm下进行无菌过滤），将血液体积调整回原始体积。
- 将调整后的15μL血量转移到新的PCR批准的微离心管。
- 加入1mL的1xRBC解毒溶液（材料表），涡旋，并在RT孵育10分钟。
- 在RT至颗粒细胞的9，600 x g下离心1分钟。
- 吸气上清液，只留下微小的白细胞颗粒，因为红细胞污染可以抑制PCR。
- 将颗粒储存在-80°C至少1小时，直到进一步加工。
注： 可选，步骤 8.4 中剩余的任何血液可用于流式细胞测定分析，如步骤 6 中所述。
9. 使用蛋白酶K提取法提取DNA
- 使用蛋白酶 K 提取方法从外周细胞颗粒中提取 DNA（在步骤 8.8 中生成），如下所述。该方法已被证明可以从少量血液中提取最高的DNA产量，如本研究中使用的连续血液收集所需的DNA产量。
- 将25μL蛋白酶K（20μg/mL）加入0.1M Tris缓冲液的1mL。
- 短暂涡旋蛋白酶K溶液。
- 将50μL蛋白酶K溶液加入每个细胞颗粒中，以消化。
- 通过上下移液混合，确认细胞颗粒的再悬浮。
- 在 56°C 的转速 400 rpm（取决于仪器）上摇动热摇床（材料表），1 小时，磁带管向下摇动，如有必要，将其保持到位。
- 立即在同一热摇器中，使蛋白酶 K 失去活性，温度变化至 95°C，而晃动持续 20 分钟。
- 每个样品的漩涡。
- 将每个样品置于-80°C至少30分钟。
- 解冻，然后在17，000 x g下将样品离心1分钟，在RT处将不需要的细胞碎片颗粒化。
- 将含DNA的上清液放入新的微离心管中。
- DNA模板已准备好用于 PCR。DNA模板可储存在-80°C。
10. 病毒RNA的RNA提取、cDNA合成和ddPCR定量
- 按照制造商的协议（材料表），使用病毒RNA分离试剂盒从解冻的小鼠血浆中分离RNA。
- 将样品添加到柱中后，添加列内DNase处理步骤，以确保去除血浆样本中的所有DNA。
- 对于每个样品，向柱中加入95 μL的无RNaseDNase溶液（混合2μL无RNA酶和98μL反应缓冲液），并在RT孵育15分钟。
- 在进一步加工之前，将RNA样品储存在-80°C至少1小时。在RNA提取后冻结所有样品非常重要，在比较未冻结的样品与冷冻的样品时，避免有偏差的风险。
- 使用前20所述试剂使用逆转录酶步骤合成cDNA。确保向cDNA反应中加入0.5 μL的RN酶抑制剂，以避免RNA降解。
- 使用表5中详述的程序执行cDNA合成。
- 将 cDNA 样品储存在 -80°C 至少 1 小时。在cDNA合成后冻结所有样品，在比较未冻结的样品与冷冻样品时，必须避免偏置风险。
- 为 ddPCR 准备样品，如下所示：
- 将3μL的cDNA样品与11 μL的ddPCR探针混合物（无dUTP）20、250 nM微槽结合探针和900 nM每个正向和反向引漆混合，如表6所示。
- 使用无核酸酶水，将PCR总体积调节至22μL。
- 根据制造商的协议和以前的说明20，乳化PCR与滴子生成油混合在液滴发生器上的探头。
- 运行 PCR 程序，如表 7中所述。
注：此处显示的引色/探针序列和 PCR 程序经过专门设计和优化，用于敏感检测 HIV 病毒株 RHPA4259。引出和探针序列可以很容易地调整，以检测任何其他艾滋病毒株的选择。 - 检测滴滴读取器上样品中的水滴荧光，并根据制造商的协议使用适当的软件分析结果。
11. 治疗含CART的菜
- 用含有4，800毫克/千克拉脱格拉维尔（RAL）、720毫克/千克苯丙酸二酯（TDF）和520毫克/千克水三基苯丙酸酯（FTC）21（表8）的颗粒喂养小鼠。这些剂量确定假设一只老鼠重25克，每天吃4克的菜。这相当于每日剂量为768毫克/千克RAL、2.88毫克/千克TDF和83毫克/千克FTC21。
- 使用由外部供应商（见材料表）准备的处方药的cART饮食。其他公司也可能生产这种方案。使用彩色的cART饮食，以容易区分它与普通小鼠。
- 生产一个控制周饮食，没有CART在标准棕色，以方便区分。
- 对于启动cART，准备无菌小鼠笼子，加入含CART的周食，然后将小鼠从旧笼子转移到新的笼子。
- 通过目视检查监测小鼠的重量和含CART的咀嚼量，以确保小鼠适应变化。
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Representative Results
图1描述了干细胞纯度分析的浇注策略。图 1A_C显示了纯化 CD34+ 总体，图 1D_F CD34- 流通用于说明在隔离过程中丢失的 CD34+ 总体的最小数量。分离的CD34+干细胞纯度在85%~95%之间，T细胞污染率低于1%。图1G描绘了一个成人控制捐赠者的CCR5带，其基因型为CCR5+32/wt，其次是两个CCR5wt/wt和一个CCR5+32/wt干细胞捐赠者的带。 基因型CCR5+32/wt在19个捐赠者组中的频率为15.8%（图1H）。这与丹麦14、15号报告基因型的流行病学研究一致，在丹麦高达23.6%的被调查者中，基因型占15%。
小鼠外周血中的人类CD45+水平在人类CD34+干细胞移植后3~5个月通过流式细胞测定。浇注策略如图2A+E所示。图3A和图3B说明了10至16只从两个不同的捐赠者获得干细胞的小鼠之间的变异性。移植75，000个hCD34+细胞在外周血中产生20%~50%的人类CD45+。所有小鼠都发展出人类B细胞和T细胞，包括CD4和CD8+T细胞。
对于创伤性阴道内暴露，使用了图 4中描述的设置。老鼠在密闭的腔室中麻醉，在接触过程中被麻醉。小鼠在接触后阴道朝上5分钟，以确保病毒溶液与粘膜表面接触。
图5A显示了使用此模型观察到的64%的HIV传播成功率。小鼠接受21，400个感染单位（IU）的RHPA4259阴道内的挑战。这种剂量导致64%的小鼠在阴道接触后感染艾滋病毒。为了进行比较，包括来自通过静脉注射途径暴露的两组不同小鼠的数据。不出所料，100%的小鼠感染了类似剂量的RHPA和使用这种途径的额外菌株（YU2）。100%的小鼠成为HIV®。
图5B描绘了三只感染了HIV并切换到含有标准CART饮食的小鼠的代表性结果。在40天的CART之后，老鼠被切换回常规的小鼠。在此检测设置中，病毒载量检测的限值为 725 份/mL。病毒载量在CART 4周后均低于检测限值。停止cART后，病毒反弹，镜像临床数据22。CART上的小鼠容忍饮食的变化，如图5C所示。
图1：代表性流细胞学门控策略，用于验证干细胞纯度和CCR5供体变异状态。（A+C）用于隔离 CD34+ 细胞群的浇注策略。面板A和B中分别排除双子板和碎屑（FSC-A vs. FSC-H 和 FSC-A vs. SSC-A）。（C） CD34+ 干细胞和CD3+T细胞污染的频率。（D+F）CD34- 流通浇注策略。门中的百分比按父人口的一小部分计算。（G） CCR5+32/wt PCR 分析的结果.通道1：来自人类CCR5+32/wt供体DNA，通道2和3：两个CCR5 wt/wt人类干细胞捐献者，通道4：CCR5+32/wt人类干细胞捐献者。 （H） 我们19个干细胞样本中基因型CCR5+32/wt的频率为15.8%。 请点击此处查看此图的较大版本。
图2：用于验证人细胞移植和分化的流式细胞测量门控策略。通过流式细胞学对人工化小鼠的单核细胞总体进行了分析。（A） 人类CD45+细胞的百分比被确定为记录事件总数的一小部分。（B） 根据 FSC-A/FSC-H 门控，随后排除了双子门。（C） 真正的淋巴细胞群是根据大小和粒度定义的。（D） 淋巴细胞被定性为CD3+（T细胞）或CD19+（B细胞）。（E） CD3+ T细胞是CD4+ T细胞或CD8+T细胞。门中的百分比按父人口的一小部分计算。请点击此处查看此图的较大版本。
图3：在干细胞移植后4-5个月，从两个不同的人类捐赠者产生的10只和16只小鼠的细胞亚型分数具有代表性的人性化水平。（A） 对10和（B）16只human小鼠的单核细胞群（MNC）进行了分析，并如图2所示进行封闭分析。人类CD45+细胞的分数呈现为%hCD45（占MNC总量），%B和%T细胞为hCD45的一小部分。T细胞随后分为%CD4和%CD8。每个数据点表示一个鼠标。数据以均值 = SD 形式呈现。请点击此处查看此图的较大版本。
图4：针对小鼠阴道内暴露的实验实验室台设置。通过阴道内途径进行人体化小鼠HIV暴露的实验设置。该过程在流动台中进行，在使用前所有试剂和表面均已消毒。请点击此处查看此图的较大版本。
图5：不同接触途径的HIV菌株传播率，以及病毒抑制中含CART的菌株的疗效和安全性。（A） 人化的NOG小鼠通过阴道内或静脉注射途径成功感染了两种不同的HIV病毒株。小鼠在阴道内接触了 21，400 IUs 的 RHPA4259，5，157 IUs IV 与 RHPA4259，或 3，000 IUs IV 与 YU2。本议定书不包括关于人化小鼠IV接触的详细信息。艾滋病毒感染通过小鼠治疗成功治疗。（B） CART上所有三只小鼠的病毒载量降至检测水平以下，在CART停止后出现反弹。虚线表示量化限制为 725 份/mL。喂食cART的小鼠体重发育与同一时期吃非CART的小鼠相似，表明没有味觉偏好或cART饮食的副作用。（C） 重量与 CART 的开始相比呈现为折叠变化。每个数据点代表三个动物的平均值 = SD。请点击此处查看此图的较大版本。
| 抗体靶点 | 克隆 | 荧光 |
| CD3 | 克隆SK7 | BUV395 |
| CD34 | 克隆 AC136 | FITC |
| CD45 | 克隆 2D1 | Apc |
表1：用于测定干细胞纯度的抗体。建议多色流式细胞测定面板用于干细胞纯度评价。所列是抗体靶点、克隆和荧光。
| CCR5_32 检测 | 引 |
| 正向引漆 | 5'CTTCTACAGCT'3 |
| 反向引漆 | 5'TGAAGATAGCCCACAGCC'3 |
表2：CCR5_32变型检测PCR引基。用于检测CCR5基因中32 bp缺失的正向和反向引源。
| 不。周期 | 1 | 45 | 1 | ∞ |
| 温度 （°C） | 98 | 98/63/72 | 72 | 10 |
| 时间 | 30 s | 10 s/30 s/15 s | 5分钟 | ∞ |
表3：CCR5_32变型检测PCR程序。用于扩增CCR5基因的PCR循环程序。
| 抗体靶点 | 克隆 | 荧光 |
| CD4 | SK3 | BUV 496 |
| CD8 | RPA-T8 | BV421 |
| CD3 | OKT3 | FITC |
| CD19 | sj25c1 | PE-Cy7 |
| CD45 | 2D1 | Apc |
表4：用于测定小鼠人体化的抗体。建议多色流式细胞学面板进行人性化。所列是抗体靶点、克隆和荧光。
| 不。周期 | 1 | 1 | ∞ |
| 温度 （°C） | 51 | 80 | 4 |
| 时间 | 45分钟 | 15分钟 | ∞ |
表5：cDNA扩增程序。用于将互补链DNA扩增到病毒RNA的程序。
| 艾滋病毒定量 | 引 |
| 正向引漆 | 5'AGGGAGAAAA'3 |
| 反向引漆 | 5'CAAGGAATGGGTTT'3 |
| FAM 探头 | 5'ATCCCCACTCAACAGGC'3 |
表6：艾滋病毒ddPCR引种。用于ddPCR病毒cDNA扩增的引基器和探针。
| 不。周期 | 1 | 39 | 1 | ∞ |
| 温度 （°C） | 95 | 95/54.5 | 98 | 4 |
| 时间 | 10分钟 | 30 秒/1 分钟 | 10分钟 | ∞ |
表7：艾滋病毒ddPCR方案。用于扩增病毒RNA的PCR循环程序。
| 拉尔特格拉维尔（RAL） | 4800毫克/千克 |
| 特诺福韦异丙二体 （TDF） | 720毫克/千克 |
| 埃特里塔宾（联邦贸易委员会） | 520毫克/千克 |
表8：小鼠CART周食。老鼠周饮食是制定如先前公布的21。食物以标准小鼠为基准，生产后，以25 kGy和双袋进行辐照。在-20°C下储存，直到使用。
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Discussion
严重免疫功能低下的小鼠菌株NOD。Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Sug/JicTac （NOG） 非常适合人体细胞和组织移植。这些小鼠的先天和适应性免疫途径都受到损害。NOG和NSG小鼠有Prkdcscid突变，导致有缺陷的T和B细胞功能。此外，这些小鼠缺乏功能白细胞介素-2受体β链（常见的伽马链，IL2rg），这是许多关键细胞因子（如IL-2、IL-4、IL-7、IL-9、IL-15和IL-21）结合复合物中不可或缺的。免疫缺陷小鼠，如NOG，移植了人体免疫系统，是研究艾滋病毒传播和免疫学的有力工具。在这些领域，使用人化小鼠的贡献已被广泛审查2，23，24，25，26。利用这些老鼠研究人类先天免疫反应也越来越受到重视27，28。
本手稿的目的是提供从幼鼠到艾滋病毒传播和治疗数据的全面小鼠和ddPCR程序协议。我们的系统利用ddPCR对病毒RNA和DNA进行定量。在ddPCR反应中，反应物被分割成多达20，000个液滴，每个液滴都含有一个单独的微PCR反应。球滴内目标的放大导致该滴的荧光信号为正。因此，读出是二进制的，通过应用泊信统计分析，阳性反应的数量可以直接转换为原始样本中的一些模板副本。ddPCR 的好处在于它能够直接量化独立于标准曲线的目标。这在分析RNA样品时特别有吸引力，由于其弯曲性质29，很难用作PCR标准曲线。此外，通过分析同一样本的多个副本并合并最终样品定量的单个数据点，ddPCR的二进制性质使得降低样本29每mL的模板副本检测限制成为可能。这在人性化的鼠标环境中尤其重要，因为只有有限的样品材料可用，并且需要高灵敏度。
给人化小鼠的CART的给下，可以通过口服腹腔或腹腔内注射，用cART30，31，32的溶液，最近显示，通过配方到饮食21。我们的主要目标之一是在小鼠饮食中实施 cART 方案，以减少由于其他药物输送方法固有的额外处理步骤对动物的潜在压力。老鼠吃的药的剂量可以根据老鼠每天平均食物摄入量33准确估计。通过饮食口服是最简单的分娩途径，既减轻了动物的压力，又减轻了处理者的工作量。我们根据先前发表的关于人类化小鼠的研究21，30，将抗病毒药物组合。此外，我们的cART策略在临床上是相关的，因为临床上使用的药物组合是由全球患者口服的。
注意到使用NOG小鼠的某些限制。重要的是，这些小鼠中的人类T细胞是在小鼠胸腺环境中培养的，而不是人类环境。最近的重点是产生异种受体菌株，为开发强大的人体免疫反应提供良好的环境。这些新菌株包括免疫缺陷小鼠，它们为人类MHC分子（如A2）转基因。这些模型支持HLA限制抗原T细胞反应，导致适应性免疫系统更好的成熟和作用功能34。另一种方法是用关键的人类细胞因子代替小鼠基因，用于IL-3/GM-CSF35、IL-636、IL-1537、TPO、M-CSF38和 IL-7/TSLP31。这种模型因其能够更好地分化先天细胞类型而获得了更多的关注。我们的方案很容易适应使用任何这种增强遗传背景免疫缺陷菌株的小鼠的人性化和艾滋病毒感染。
总之，上述方法的简便性和实用性有助于在体内与艾滋病毒有关的领域开展研究。人性化小鼠是指导研究产生更好研究假设的有力工具。随着人类转基因小鼠的产生，我们相信我们的标准化协议将有助于简化不同研究环境中的实验程序。
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Disclosures
提交人声明没有利益冲突。
Acknowledgments
作者要感谢奥胡斯大学生物医药动物设施的工作人员，特别是Jani Kür女士的殖民地维护工作和跟踪老鼠重量。作者要感谢弗洛里安·克莱因教授制定护理标准CART和指导。以下试剂是通过NIH艾滋病试剂项目，艾滋病司，NIAID，NIH：pRHPA.c/2635（cat# 11744）从约翰·卡佩斯博士和克里斯蒂娜·奥奇森鲍尔博士那里获得。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Blue pad | VWR | 56616-031 | Should be sterilized prior to use |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A8022 | |
| CD19 (clone sj25c1) PE-Cy7 | BD Bioscience | 557835 | |
| CD3 (clone OKT3) FITC | Biolegend | 317306 | |
| CD3 (clone SK7) BUV395 | BD Bioscience | 564001 | |
| CD34 (clone AC136) FITC | Miltenyi | 130-113-740 | |
| CD4 (clone SK3) BUV 496 | BD Bioscience | 564652/51 | |
| CD45 (clone 2D1) APC | Biolegend | 368511/12 | |
| CD8 (clone RPA-T8) BV421 | BD Bioscience | 562428 | |
| ddPCR Supermix for probes (no dUTP) | Bio-Rad | 1863025 | |
| DMSO | Merck | 10,02,95,21,000 | |
| DNAse | Sigma | D4263 | For suspension buffer |
| dNTP mix | Life Technologies | R0192 | |
| Dulbeccos phosphate-buffered saline (PBS) | Biowest | L0615-500 | |
| EasySep Human Cord Blood CD34 Positive Selection Kit II | Stemcell | 17896 | |
| EDTA | Invitrogen | 15575-038 | |
| FACS Lysing solution 10X | BD | 349202 | Dilute 1:10 in dH20 immediately before use |
| FACS tubes (Falcon 5 mL round-botton) | Falcon | 352052 | |
| Fc Receptor blocking solution (Human Trustain FcX) | Biolegend | 422302 | |
| Fetal bovine serum | Sigma | F8192-500 | |
| Ficoll-Paque PLUS | GE Healthcare | 17144002 | |
| Flowjo v.10 | |||
| Gauze | Mesoft | 157300 | Should be sterilized prior to use |
| Heating lamp | Custom made | ||
| Hemacytometer (Bürker-Türk) | VWR | DOWC1597418 | |
| Isoflurane gas | Orion Pharma | 9658 | |
| LSR Fortessa X20 flow cytometer | BD | ||
| Microcentrifuge tubes, PCR-PT approved | Sarstedt | 72692405 | |
| Mouse cART food | ssniff Spezialdiäten GmbH | Custom made product | |
| Mouse restrainer | Custom made product | ||
| Needle, Microlance 3, 30G ½" | BD | 304000 | |
| NOG mice NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Sug/JicTac | Taconic | NOG-F | |
| Nuclease-free water | VWR chemicals | 436912C | |
| Nucleospin 96 Virus DNA and RNA isolation kit | Macherey-Nagel | 740691 | |
| PCR-approved microcentrifuge tubes | Sarstedt | 72.692.405 | |
| Penicillin-Streptomycin solution 100X | Biowest | L0022-100 | |
| Phusion Hot Start II DNA polymerase | Life Technologies | F549S | |
| Pipette tips, sterile, ART 20P Barrier | ThermoScientific | 2149P | |
| Proteinase K | NEB | 100005398 | |
| QuantaSoft software | Bio-Rad | ||
| QX100 Droplet Generator | Bio-Rad | 1886-3008 | |
| QX100 Droplet Reader | Bio-Rad | 186-3003 | |
| RBC lysis solution | Biolegend | 420301 | |
| RNase-free DNAse size F + reaction buffer | Macherey-Nagel | 740963 | |
| RNAseOUT Recombinant Ribonuclease inhibitor | ThermoScientific | 10777-019 | |
| RPMI | Biowest | L0501-500 | Dissolve in H20 |
| Softject 1 mL syringe | Henke Sass Wolf | 5010-200V0 | |
| Superscript III Reverse Transcriptase | ThermoFisher Scientific | 18080044 | |
| Thermoshaker | VWR | 89370-910 | |
| Trypane blue | Sigma | T8154 | |
| Ultrapure 0.5 EDTA, pH 8.0 | ThermoFisher Scientific | 15575-020 | |
| Virkon S (virus disinfectant) | Dupont | 7511 |
References
- WHO. GHO | By category | Antiretroviral therapy coverage - Data and estimates by WHO region (2018). World Health Organization. , Available from: http://apps.who.int/gho/data/node.main.626 (2018).
- Skelton, J. K., Ortega-Prieto, A. M., Dorner, M. A Hitchhiker's guide to humanized mice: new pathways to studying viral infections. Immunology. 154 (1), 50-61 (2018).
- Denton, P. W., Krisko, J. F., Powell, D. A., Mathias, M., Kwak, Y. T. Systemic Administration of Antiretrovirals Prior to Exposure Prevents Rectal and Intravenous HIV-1 Transmission in Humanized BLT Mice. PLoS ONE. 5 (1), 8829 (2010).
- Zou, W., et al. Nef functions in BLT mice to enhance HIV-1 replication and deplete CD4 + CD8 + thymocytes. Retrovirology. 9 (1), 44 (2012).
- Berges, B. K., Akkina, S. R., Folkvord, J. M., Connick, E., Akkina, R. Mucosal transmission of R5 and X4 tropic HIV-1 via vaginal and rectal routes in humanized Rag2 -/- γc -/- (RAG-hu) mice. Virology. 373 (2), 342-351 (2008).
- Veselinovic, M., Charlins, P., Akkina, R. Modeling HIV-1 Mucosal Transmission and Prevention in Humanized Mice. Methods Mol Biol. , 203-220 (2016).
- Neff, C. P., Kurisu, T., Ndolo, T., Fox, K., Akkina, R. A topical microbicide gel formulation of CCR5 antagonist maraviroc prevents HIV-1 vaginal transmission in humanized RAG-hu mice. PLoS ONE. 6 (6), 20209 (2011).
- Neff, P. C., Ndolo, T., Tandon, A., Habu, Y., Akkina, R. Oral pre-exposure prophylaxis by anti-retrovirals raltegravir and maraviroc protects against HIV-1 vaginal transmission in a humanized mouse model. PLoS ONE. 5 (12), 15257 (2010).
- Veselinovic, M., et al. HIV pre-exposure prophylaxis: Mucosal tissue drug distribution of RT inhibitor Tenofovir and entry inhibitor Maraviroc in a humanized mouse model. Virology. 464-465, 253-263 (2014).
- Akkina, R., et al. Humanized Rag1-/-γc-/- mice support multilineage hematopoiesis and are susceptible to HIV-1 infection via systemic and vaginal routes. PLoS ONE. 6 (6), 20169 (2011).
- Zhou, J., et al. Systemic administration of combinatorial dsiRNAs via nanoparticles efficiently suppresses HIV-1 infection in humanized mice. Molecular Therapy. 19 (12), 2228-2238 (2011).
- Balcombe, J. P., Barnard, N. D., Sandusky, C. Laboratory routines cause animal stress. Contemporary Topics in Laboratory Animal Science. 43 (6), 42-51 (2004).
- Trecarichi, E. M., et al. Partial protective effect of CCR5-Delta 32 heterozygosity in a cohort of heterosexual Italian HIV-1 exposed uninfected individuals. AIDS Research and Therapy. 3 (1), (2006).
- Novembre, J., Galvani, A. P., Slatkin, M. The geographic spread of the CCR5 Δ32 HIV-resistance allele. PLoS Biology. 3 (11), 1954-1962 (2005).
- Solloch, U. V., et al. Frequencies of gene variant CCR5-Δ32 in 87 countries based on next-generation sequencing of 1.3 million individuals sampled from 3 national DKMS donor centers. Human Immunology. 78 (11-12), 710-717 (2017).
- Ochsenbauer, C., et al. Generation of Transmitted/Founder HIV-1 Infectious Molecular Clones and Characterization of Their Replication Capacity in CD4 T Lymphocytes and Monocyte-Derived Macrophages. Journal of Virology. 86 (5), 2715-2728 (2012).
- Andersen, A. H. F., et al. Long-Acting, Potent Delivery of Combination Antiretroviral Therapy. ACS Macro Letters. 7 (5), 587-591 (2018).
- Caro, A. C., Hankenson, F. C., Marx, J. O. Comparison of thermoregulatory devices used during anesthesia of C57BL/6 mice and correlations between body temperature and physiologic parameters. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science JAALAS. 52 (5), 577-583 (2013).
- Gatlin, J., Padgett, A., Melkus, M. W., Kelly, P. F., Garcia, J. V. Long-term engraftment of nonobese diabetic/severe combined immunodeficient mice with human CD34+ cells transduced by a self-inactivating human immunodeficiency virus type 1 vector. Human Gene Therapy. 12 (9), 1079-1089 (2001).
- Leth, S., et al. HIV-1 transcriptional activity during frequent longitudinal sampling in aviremic patients on antiretroviral therapy. AIDS. 30 (5), 713-721 (2016).
- Halper-Stromberg, A., et al. Broadly neutralizing antibodies and viral inducers decrease rebound from HIV-1 latent reservoirs in humanized mice. Cell. 158 (5), 989-999 (2014).
- Rothenberger, M. K., et al. Large number of rebounding/founder HIV variants emerge from multifocal infection in lymphatic tissues after treatment interruption. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (10), 1126-1134 (2015).
- Rongvaux, A., et al. Human Hemato-Lymphoid System Mice: Current Use and Future Potential for Medicine. Annual Review of Immunology. 31 (1), 635-674 (2013).
- Walsh, N. C., et al. Humanized Mouse Models of Clinical Disease. Annual Review of Pathology: Mechanisms of Disease. 12 (1), 187-215 (2017).
- Denton, P. W., García, J. V. Humanized mouse models of HIV infection. AIDS Reviews. 13 (3), 135-148 (2011).
- Denton, P. W., Søgaard, O. S., Tolstrup, M. Using animal models to overcome temporal, spatial and combinatorial challenges in HIV persistence research. Journal of Translational Medicine. 14 (1), (2016).
- Andersen, A. H. F., et al. cAIMP administration in humanized mice induces a chimerization-level-dependent STING response. Immunology. 157 (2), 163-172 (2019).
- Tanaka, S., et al. Development of Mature and Functional Human Myeloid Subsets in Hematopoietic Stem Cell-Engrafted NOD/SCID/IL2r KO Mice. The Journal of Immunology. 188 (12), 6145-6155 (2012).
- Quan, P. L., Sauzade, M., Brouzes, E.
- Denton, P. W., et al. Generation of HIV Latency in Humanized BLT Mice. Journal of Virology. 86 (1), 630-634 (2012).
- Li, Y., et al. A human immune system mouse model with robust lymph node development. Nature Methods. 15 (8), 623-630 (2018).
- Satheesan, S., et al. HIV Replication and Latency in a Humanized NSG Mouse Model during Suppressive Oral Combinational Antiretroviral Therapy. Journal of Virology. 92 (7), 02118 (2018).
- Bachmanov, A. A., Reed, D. R., Beauchamp, G. K., Tordoff, M. G. Food intake, water intake, and drinking spout side preference of 28 mouse strains. Behavior Genetics. 32 (6), 435-443 (2002).
- Shultz, L. D., et al. Generation of functional human T-cell subsets with HLA-restricted immune responses in HLA class I expressing NOD/SCID/IL2r null humanized mice. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (29), 13022-13027 (2010).
- Willinger, T., et al. Human IL-3/GM-CSF knock-in mice support human alveolar macrophage development and human immune responses in the lung. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (6), 2390-2395 (2011).
- Hanazawa, A., et al. Generation of human immunosuppressive myeloid cell populations in human interleukin-6 transgenic NOG mice. Frontiers in Immunology. 9, FEB (2018).
- Huntington, N. D., et al. IL-15 trans-presentation promotes human NK cell development and differentiation in vivo. The Journal of Experimental Medicine. 206 (1), 25-34 (2009).
- Rongvaux, A., et al. Development and function of human innate immune cells in a humanized mouse model. Nature Biotechnology. 32 (4), 364-372 (2014).
