Humaniserade NOG Möss för intravaginal HIV-exponering och behandling av HIV-infektion
Summary
Vi har utvecklat ett protokoll för generering och utvärdering av en humaniserad och human immunbrist virusinfekterade NOG musmodell baserad på stamcellstransplantation, intravaginal human immunbrist virus exponering, och droplet digital PCR RNA Kvantifiering.
Abstract
Humaniserade möss ger en sofistikerad plattform för att studera humant immunbristvirus (HIV) virologi och för att testa antivirala läkemedel. Detta protokoll beskriver inrättandet av ett mänskligt immunsystem hos vuxna NOG möss. Här förklarar vi alla praktiska steg från isolering av navelsträngsblod härledda mänskliga CD34 + celler och deras efterföljande intravenös transplantation i möss, till manipulering av modellen genom HIV-infektion, kombination antiretroviral terapi ( cART) och blodprov. Cirka 75.000 hCD34 + celler injiceras intravenöst i möss och nivån av mänsklig chimär, även känd som humanisering, i perifert blod uppskattas längsgående i månader av flöde cytometri. Totalt 75.000 hCD34 + celler ger 20%-50% mänskliga CD45 + celler i perifert blod. Mössen är mottagliga för intravaginal infektion med HIV och blod kan provtas en gång i veckan för analys, och två gånger i månaden under längre perioder. Detta protokoll beskriver en analys för kvantifiering av plasma virusbelastning med droppen digital PCR (ddPCR). Vi visar hur mössen effektivt kan behandlas med en standard-of-care cART regim i kosten. Leveransen av cART i form av vanlig mus chow är en betydande förfining av den experimentella modellen. Denna modell kan användas för preklinisk analys av både systemiska och aktuella pre-exponering profylax föreningar samt för testning av nya behandlingar och hiv bota strategier.
Introduction
Humant immunbristvirus (HIV) är en kronisk infektion med mer än 37 miljoner infekterade individer över hela världen1. Kombination antiviral terapi (cART) är en livräddande terapi, men ett botemedel är fortfarande motiverat. Således finns det ett behov av djurmodeller som speglar det mänskliga immunsystemet och dess svar för att underlätta fortsatt forskning inom hiv. Flera typer av humaniserade möss som kan stödja cell och vävnad engraftment har utvecklats genom att transplantera mänskliga celler i allvarligt immunodeficient möss2. Sådana humaniserade möss är mottagliga för HIV-infektion och ger ett viktigt alternativ till icke-mänskliga primat simian immunbristvirus modeller, eftersom de är billigare och enklare att använda än icke-mänskliga primater. Humaniserade möss har underlättat forskning inom hiv-virusöverföring, patogenes, förebyggande och behandling3,4,5,6,7,8,9,10,11.
Vi presenterar ett flexibelt humaniserat modellsystem för HIV-forskning som utvecklats genom transplantation av navelsträngsblod som härrör från mänskliga stamceller till möss i NOD. Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Sug/JicTac (NOG) bakgrund. Förutom att vara av icke-fetalt ursprung, den praktiska biotekniken av dessa möss är mindre tekniskt krävande jämfört med microsurgical förfaranden som deltar i transplantation av blod-lever-tymus (BLT) konstruktion.
Vi visar hur man etablerar HIV-infektion genom intravaginal överföring och hur man kan övervaka plasma virusbelastning med en känslig droplet digital PCR (ddPCR)-baserade setup. Därefter beskriver vi inrättandet av standard cART ges som en del av den dagliga musdieten. Syftet med dessa kombinerade metoder är att minska stressen för djuren och underlätta storskaliga experiment där tidsförande hantering av varje djur är begränsad12.
Hos människa orsakar en CCR5Δ32/wt eller CCR5Δ32/ Δ32 genotyp minskad känslighet för HIV-infektion med sändare/grundare virus13, och vissa försiktighetsåtgärder måste vidtas när bioengineering humaniserade möss med stamceller i syfte att hiv-studier. Detta gäller särskilt i vår region eftersom naturligt förekommande varianter i CCR5-genen, särskilt Δ32-borttagningar, är vanligare i skandinaviska och baltiska inhemska populationer jämfört med resten av världen14,15. Således innehåller vårt protokoll en enkel, hög genomströmning analys för screening givare hematopoietiska stamceller för CCR5 varianter före transplantation.
För intravaginal exponering valde vi sändaren / grundaren R5 virus RHPA4259, isolerad från en kvinna i ett tidigt skede av infektion som smittades intravaginally16. Vi exponerade mössen för en virusdos som var tillräcklig för att ge framgångsrik överföring i de flesta möss, men under en 100% överföringshastighet. Att välja en sådan dos möjliggör ett tillräckligt dynamiskt omfång i överföringshastigheten så att antivirala effekter av en läkemedelskandidat kan resultera i skyddade djur i hiv-förebyggande experiment och minskad virusmängd för behandlingsstudier.
Protocol
Representative Results
Discussion
Den allvarligt immunkomprometterade mus stam NOD. Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Sug/JicTac (NOG) är extremt väl lämpad för transplantation av mänskliga celler och vävnader. Både medfödda och adaptiva immunvägar hos dessa möss äventyras. NOG och NSG möss hysa en Prkdcscid mutation som resulterar i defekta T och B cell funktion. Dessutom saknar dessa möss en funktionell interleukin-2-receptor γ-kedja (gemensam gammakedja, IL2rg) som är oumbärlig i b…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna vill tacka biomedicin Animal Facility personal vid Århus universitet, särskilt Ms Jani Kær för koloni underhåll insatser och för att spåra mus vikter. Författarna vill tacka professor Florian Klein för att utveckla standard-of-care cART och för vägledning. Följande reagens erhölls genom NIH AIDS Reagensprogram, sektionen för aids, NIAID, NIH: pRHPA.c/2635 (katt# 11744) från Dr John Kappes och Dr Christina Ochsenbauer.
Materials
| Blue pad | VWR | 56616-031 | Should be sterilized prior to use |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A8022 | |
| CD19 (clone sj25c1) PE-Cy7 | BD Bioscience | 557835 | |
| CD3 (clone OKT3) FITC | Biolegend | 317306 | |
| CD3 (clone SK7) BUV395 | BD Bioscience | 564001 | |
| CD34 (clone AC136) FITC | Miltenyi | 130-113-740 | |
| CD4 (clone SK3) BUV 496 | BD Bioscience | 564652/51 | |
| CD45 (clone 2D1) APC | Biolegend | 368511/12 | |
| CD8 (clone RPA-T8) BV421 | BD Bioscience | 562428 | |
| ddPCR Supermix for probes (no dUTP) | Bio-Rad | 1863025 | |
| DMSO | Merck | 10,02,95,21,000 | |
| DNAse | Sigma | D4263 | For suspension buffer |
| dNTP mix | Life Technologies | R0192 | |
| Dulbeccos phosphate-buffered saline (PBS) | Biowest | L0615-500 | |
| EasySep Human Cord Blood CD34 Positive Selection Kit II | Stemcell | 17896 | |
| EDTA | Invitrogen | 15575-038 | |
| FACS Lysing solution 10X | BD | 349202 | Dilute 1:10 in dH20 immediately before use |
| FACS tubes (Falcon 5 mL round-botton) | Falcon | 352052 | |
| Fc Receptor blocking solution (Human Trustain FcX) | Biolegend | 422302 | |
| Fetal bovine serum | Sigma | F8192-500 | |
| Ficoll-Paque PLUS | GE Healthcare | 17144002 | |
| Flowjo v.10 | |||
| Gauze | Mesoft | 157300 | Should be sterilized prior to use |
| Heating lamp | Custom made | ||
| Hemacytometer (Bürker-Türk) | VWR | DOWC1597418 | |
| Isoflurane gas | Orion Pharma | 9658 | |
| LSR Fortessa X20 flow cytometer | BD | ||
| Microcentrifuge tubes, PCR-PT approved | Sarstedt | 72692405 | |
| Mouse cART food | ssniff Spezialdiäten GmbH | Custom made product | |
| Mouse restrainer | Custom made product | ||
| Needle, Microlance 3, 30G ½" | BD | 304000 | |
| NOG mice NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Sug/JicTac | Taconic | NOG-F | |
| Nuclease-free water | VWR chemicals | 436912C | |
| Nucleospin 96 Virus DNA and RNA isolation kit | Macherey-Nagel | 740691 | |
| PCR-approved microcentrifuge tubes | Sarstedt | 72.692.405 | |
| Penicillin-Streptomycin solution 100X | Biowest | L0022-100 | |
| Phusion Hot Start II DNA polymerase | Life Technologies | F549S | |
| Pipette tips, sterile, ART 20P Barrier | ThermoScientific | 2149P | |
| Proteinase K | NEB | 100005398 | |
| QuantaSoft software | Bio-Rad | ||
| QX100 Droplet Generator | Bio-Rad | 1886-3008 | |
| QX100 Droplet Reader | Bio-Rad | 186-3003 | |
| RBC lysis solution | Biolegend | 420301 | |
| RNase-free DNAse size F + reaction buffer | Macherey-Nagel | 740963 | |
| RNAseOUT Recombinant Ribonuclease inhibitor | ThermoScientific | 10777-019 | |
| RPMI | Biowest | L0501-500 | Dissolve in H20 |
| Softject 1 mL syringe | Henke Sass Wolf | 5010-200V0 | |
| Superscript III Reverse Transcriptase | ThermoFisher Scientific | 18080044 | |
| Thermoshaker | VWR | 89370-910 | |
| Trypane blue | Sigma | T8154 | |
| Ultrapure 0.5 EDTA, pH 8.0 | ThermoFisher Scientific | 15575-020 | |
| Virkon S (virus disinfectant) | Dupont | 7511 |
References
- Skelton, J. K., Ortega-Prieto, A. M., Dorner, M. A Hitchhiker’s guide to humanized mice: new pathways to studying viral infections. Immunology. 154 (1), 50-61 (2018).
- Denton, P. W., Krisko, J. F., Powell, D. A., Mathias, M., Kwak, Y. T. Systemic Administration of Antiretrovirals Prior to Exposure Prevents Rectal and Intravenous HIV-1 Transmission in Humanized BLT Mice. PLoS ONE. 5 (1), 8829 (2010).
- Zou, W., et al. Nef functions in BLT mice to enhance HIV-1 replication and deplete CD4 + CD8 + thymocytes. Retrovirology. 9 (1), 44 (2012).
- Berges, B. K., Akkina, S. R., Folkvord, J. M., Connick, E., Akkina, R. Mucosal transmission of R5 and X4 tropic HIV-1 via vaginal and rectal routes in humanized Rag2 -/- γc -/- (RAG-hu) mice. Virology. 373 (2), 342-351 (2008).
- Veselinovic, M., Charlins, P., Akkina, R. Modeling HIV-1 Mucosal Transmission and Prevention in Humanized Mice. Methods Mol Biol. , 203-220 (2016).
- Neff, C. P., Kurisu, T., Ndolo, T., Fox, K., Akkina, R. A topical microbicide gel formulation of CCR5 antagonist maraviroc prevents HIV-1 vaginal transmission in humanized RAG-hu mice. PLoS ONE. 6 (6), 20209 (2011).
- Neff, P. C., Ndolo, T., Tandon, A., Habu, Y., Akkina, R. Oral pre-exposure prophylaxis by anti-retrovirals raltegravir and maraviroc protects against HIV-1 vaginal transmission in a humanized mouse model. PLoS ONE. 5 (12), 15257 (2010).
- Veselinovic, M., et al. HIV pre-exposure prophylaxis: Mucosal tissue drug distribution of RT inhibitor Tenofovir and entry inhibitor Maraviroc in a humanized mouse model. Virology. 464-465, 253-263 (2014).
- Akkina, R., et al. Humanized Rag1-/-γc-/- mice support multilineage hematopoiesis and are susceptible to HIV-1 infection via systemic and vaginal routes. PLoS ONE. 6 (6), 20169 (2011).
- Zhou, J., et al. Systemic administration of combinatorial dsiRNAs via nanoparticles efficiently suppresses HIV-1 infection in humanized mice. Molecular Therapy. 19 (12), 2228-2238 (2011).
- Balcombe, J. P., Barnard, N. D., Sandusky, C. Laboratory routines cause animal stress. Contemporary Topics in Laboratory Animal Science. 43 (6), 42-51 (2004).
- Trecarichi, E. M., et al. Partial protective effect of CCR5-Delta 32 heterozygosity in a cohort of heterosexual Italian HIV-1 exposed uninfected individuals. AIDS Research and Therapy. 3 (1), (2006).
- Novembre, J., Galvani, A. P., Slatkin, M. The geographic spread of the CCR5 Δ32 HIV-resistance allele. PLoS Biology. 3 (11), 1954-1962 (2005).
- Solloch, U. V., et al. Frequencies of gene variant CCR5-Δ32 in 87 countries based on next-generation sequencing of 1.3 million individuals sampled from 3 national DKMS donor centers. Human Immunology. 78 (11-12), 710-717 (2017).
- Ochsenbauer, C., et al. Generation of Transmitted/Founder HIV-1 Infectious Molecular Clones and Characterization of Their Replication Capacity in CD4 T Lymphocytes and Monocyte-Derived Macrophages. Journal of Virology. 86 (5), 2715-2728 (2012).
- Andersen, A. H. F., et al. Long-Acting, Potent Delivery of Combination Antiretroviral Therapy. ACS Macro Letters. 7 (5), 587-591 (2018).
- Caro, A. C., Hankenson, F. C., Marx, J. O. Comparison of thermoregulatory devices used during anesthesia of C57BL/6 mice and correlations between body temperature and physiologic parameters. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science JAALAS. 52 (5), 577-583 (2013).
- Gatlin, J., Padgett, A., Melkus, M. W., Kelly, P. F., Garcia, J. V. Long-term engraftment of nonobese diabetic/severe combined immunodeficient mice with human CD34+ cells transduced by a self-inactivating human immunodeficiency virus type 1 vector. Human Gene Therapy. 12 (9), 1079-1089 (2001).
- Leth, S., et al. HIV-1 transcriptional activity during frequent longitudinal sampling in aviremic patients on antiretroviral therapy. AIDS. 30 (5), 713-721 (2016).
- Halper-Stromberg, A., et al. Broadly neutralizing antibodies and viral inducers decrease rebound from HIV-1 latent reservoirs in humanized mice. Cell. 158 (5), 989-999 (2014).
- Rothenberger, M. K., et al. Large number of rebounding/founder HIV variants emerge from multifocal infection in lymphatic tissues after treatment interruption. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (10), 1126-1134 (2015).
- Rongvaux, A., et al. Human Hemato-Lymphoid System Mice: Current Use and Future Potential for Medicine. Annual Review of Immunology. 31 (1), 635-674 (2013).
- Walsh, N. C., et al. Humanized Mouse Models of Clinical Disease. Annual Review of Pathology: Mechanisms of Disease. 12 (1), 187-215 (2017).
- Denton, P. W., García, J. V. Humanized mouse models of HIV infection. AIDS Reviews. 13 (3), 135-148 (2011).
- Denton, P. W., Søgaard, O. S., Tolstrup, M. Using animal models to overcome temporal, spatial and combinatorial challenges in HIV persistence research. Journal of Translational Medicine. 14 (1), (2016).
- Andersen, A. H. F., et al. cAIMP administration in humanized mice induces a chimerization-level-dependent STING response. Immunology. 157 (2), 163-172 (2019).
- Tanaka, S., et al. Development of Mature and Functional Human Myeloid Subsets in Hematopoietic Stem Cell-Engrafted NOD/SCID/IL2r KO Mice. The Journal of Immunology. 188 (12), 6145-6155 (2012).
- Quan, P. L., Sauzade, M., Brouzes, E. DPCR: A technology review. Sensors (Switzerland). 18 (4), (2018).
- Denton, P. W., et al. Generation of HIV Latency in Humanized BLT Mice. Journal of Virology. 86 (1), 630-634 (2012).
- Li, Y., et al. A human immune system mouse model with robust lymph node development. Nature Methods. 15 (8), 623-630 (2018).
- Satheesan, S., et al. HIV Replication and Latency in a Humanized NSG Mouse Model during Suppressive Oral Combinational Antiretroviral Therapy. Journal of Virology. 92 (7), 02118 (2018).
- Bachmanov, A. A., Reed, D. R., Beauchamp, G. K., Tordoff, M. G. Food intake, water intake, and drinking spout side preference of 28 mouse strains. Behavior Genetics. 32 (6), 435-443 (2002).
- Shultz, L. D., et al. Generation of functional human T-cell subsets with HLA-restricted immune responses in HLA class I expressing NOD/SCID/IL2r null humanized mice. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (29), 13022-13027 (2010).
- Willinger, T., et al. Human IL-3/GM-CSF knock-in mice support human alveolar macrophage development and human immune responses in the lung. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (6), 2390-2395 (2011).
- Hanazawa, A., et al. Generation of human immunosuppressive myeloid cell populations in human interleukin-6 transgenic NOG mice. Frontiers in Immunology. 9, (2018).
- Huntington, N. D., et al. IL-15 trans-presentation promotes human NK cell development and differentiation in vivo. The Journal of Experimental Medicine. 206 (1), 25-34 (2009).
- Rongvaux, A., et al. Development and function of human innate immune cells in a humanized mouse model. Nature Biotechnology. 32 (4), 364-372 (2014).
