Summary

Mitrai NOG umanizzati per l'esposizione all'HIV intravaginale e il trattamento dell'infezione da HIV

Published: January 31, 2020
doi:

Summary

Abbiamo sviluppato un protocollo per la generazione e la valutazione di un modello murino NOG infettato da virus dell’immunodeficienza umana e umile basato sul trapianto di cellule staminali, sull’esposizione al virus dell’immunodeficienza umana intravaginale e sull’RNA PCR digitale a goccia e droplet Quantificazione.

Abstract

I topi umanizzati forniscono una piattaforma sofisticata per studiare la virologia del virus dell’immunodeficienza umana (HIV) e per testare i farmaci antivirali. Questo protocollo descrive la creazione di un sistema immunitario umano nei topi NOG adulti. Qui, spieghiamo tutti i passaggi pratici dall’isolamento delle cellule CD34 umane derivate dal sangue del cordone ombelicale e il loro successivo trapianto endovenoso nei topi, alla manipolazione del modello attraverso l’infezione da HIV, alla terapia antiretrovirale combinata ( cART), e il campionamento del sangue. Circa 75.000 cellule hCD34 vengono iniettate per via endovenosa nei topi e il livello di chimerismo umano, noto anche come umanizzazione, nel sangue periferico è stimato longitudinalmente per mesi dalla citometria di flusso. Un totale di 75.000 cellule hCD34 produce cellule CD45 per un totale di 75.000 hCD34 nel sangue periferico. I topi sono suscettibili all’infezione intravaginale da HIV e il sangue possono essere campionati una volta alla settimana per l’analisi e due volte al mese per periodi prolungati. Questo protocollo descrive un saggio per la quantificazione del carico virale al plasma utilizzando la PCR digitale delle goccionelline (ddPCR). Mostriamo come i topi possono essere trattati efficacemente con un regime cART standard-of-care nella dieta. La consegna di cART sotto forma di chow topo regolare è un significativo affinamento del modello sperimentale. Questo modello può essere utilizzato per l’analisi preclinica di composti di profilassi pre-esposizione sia sistemici che topici, nonché per testare nuovi trattamenti e strategie di cura dell’HIV.

Introduction

Il virus dell’immunodeficienza umana (HIV) è un’infezione cronica con più di 37 milioni di individui infetti in tutto il mondo1. La terapia antivirale combinata (cART) è una terapia salvavita, ma una cura è ancora giustificata. Pertanto, vi è la necessità di modelli animali che rispecchiano il sistema immunitario umano e le sue risposte al fine di facilitare la ricerca continua sull’HIV. Sono stati sviluppati diversi tipi di topi umanizzati che sono in grado di supportare l’innesto di cellule e tessuti trapiantando cellule umane in topi gravemente immunosensibili2. Tali topi umanizzati sono suscettibili all’infezione da HIV e forniscono un’importante alternativa ai modelli di virus immunodeficienza dei primati non umani, in quanto sono più economici e più semplici da usare rispetto ai primati non umani. I topi umanizzati hanno facilitato la ricerca sulla trasmissione virale dell’HIV, la patogenesi, la prevenzione e il trattamento3,4,5,6,7,8,9,10,11.

Vi presentiamo un sistema modello umanizzato flessibile per la ricerca sull’HIV sviluppato trapiantando cellule staminali umane derivate dal sangue cordonale nei topi del NOD. Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Sug/JicTac (NOG) sfondo. Oltre ad essere di origine non fetale, la bioingegneria pratica di questi topi è meno tecnicamente impegnativa rispetto alle procedure microchirurgiche coinvolte nel trapianto del costrutto sangue-fegato-timo (BLT).

Mostriamo come stabilire l’infezione da HIV attraverso la trasmissione intravaginale e come monitorare il carico virale al plasma con una configurazione sensibile basata su PCR digitale (ddPCR) di goccia. Successivamente, descriviamo l’istituzione di cART standard somministrata come parte della dieta quotidiana del topo. L’obiettivo di questi metodi combinati è quello di ridurre lo stress per gli animali e facilitare esperimenti su larga scala in cui il tempo impiegato per la manipolazione di ogni animale è limitato a12.

Nell’uomo, un genotipo CCR5n. 32/wt o CCR5-32 provoca una ridotta suscettibilità all’infezione da HIV con virus del trasmettitore/fondatore13, e alcune precauzioni devono essere prese quando i topi bioingegnerizzati con cellule staminali ai fini degli studi sull’HIV. Ciò è particolarmente vero nella nostra regione perché le varianti naturali nel gene CCR5, in particolare le delezioni di 32 dollari, sono più diffuse nelle popolazioni indigene scandinave e baltiche rispetto al resto del mondo14,15. Pertanto, il nostro protocollo include un semplice test ad alto throughput per lo screening delle cellule staminali ematopoietiche dei donatori per le varianti CCR5 prima del trapianto.

Per l’esposizione intravaginale abbiamo scelto il virus R5 trasmettitore/fondatore RHPA4259, isolato da una donna in una fase precoce dell’infezione che è stata infettata intravaginalmente16. Abbiamo esposto i topi a una dose virale sufficiente a produrre una trasmissione di successo nella maggior parte dei topi, ma al di sotto di un tasso di trasmissione del 100%. La scelta di una dose di questo tipo consente una portata dinamica sufficiente nel tasso di trasmissione tale che gli effetti antivirali di un farmaco candidato possono provocare animali protetti negli esperimenti di prevenzione dell’HIV e una riduzione del carico virale per gli studi di trattamento.

Protocol

Tutti i campioni di sangue cordonale sono stati ottenuti in stretta conformità con protocolli approvati localmente, compreso il consenso informato della donazione anonima da parte dei genitori. Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati approvati ed eseguiti in stretta conformità con le normative nazionali danesi ai sensi della licenza 2017-15-0201-01312. AVVISO: Gestire topi e sangue esposti all’HIV con estrema cautela. Decontaminare tutte le superfici e i liquidi che sono stati a conta…

Representative Results

La strategia di gating per l’analisi della purezza delle cellule staminali è illustrata nella Figura 1. Figura 1A-C mostra la popolazione PURificata CD34 e Figura 1D– F il CD34- flow-through utilizzato per illustrare che la quantità minima della popolazione CD34 è perso nel processo di isolamento. La purezza delle cellule staminali isolate CD34 è stata tra l’85%-95% con meno dell’1% di contami…

Discussion

Lo sforzo murino gravemente immunocompromesso NOD. Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Sug/JicTac (NOG) è estremamente adatto per il trapianto di cellule e tessuti umani. Entrambe le vie immunitarie innate e adattativi in questi topi sono compromesse. I topi NOG e NSG ospitano una mutazionedi scied di Prkdc che si traduce nella funzione difettosa delle cellule T e B. Inoltre, questi topi non hanno un recettore funzionale dell’interleuchina-2 (catena gamma comune, IL2r…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Gli autori desiderano ringraziare il personale di Biomedicine Animal Facility dell’Università di Aarhus, in particolare la sig.ra Jani Kàr per la manutenzione delle cozioni e per il monitoraggio del peso dei topi. Gli autori desiderano ringraziare il professor Florian Klein per lo sviluppo di cART standard-of-care e per la guida. Il seguente reagente è stato ottenuto attraverso il NIH AIDS Reagent Program, Division of AIDS, NIAID, NIH: pRHPA.c/2635 (cat-11744) dal Dr. John Kappes e dalla dott.ssa Christina Ochsenbauer.

Materials

Blue pad VWR 56616-031 Should be sterilized prior to use
Bovine serum albumin (BSA) Sigma A8022
CD19 (clone sj25c1) PE-Cy7 BD Bioscience 557835
CD3 (clone OKT3) FITC Biolegend 317306
CD3 (clone SK7) BUV395 BD Bioscience 564001
CD34 (clone AC136) FITC Miltenyi 130-113-740
CD4 (clone SK3) BUV 496 BD Bioscience 564652/51
CD45 (clone 2D1) APC Biolegend 368511/12
CD8 (clone RPA-T8) BV421 BD Bioscience 562428
ddPCR Supermix for probes (no dUTP) Bio-Rad 1863025
DMSO Merck 10,02,95,21,000
DNAse Sigma D4263 For suspension buffer
dNTP mix Life Technologies R0192
Dulbeccos phosphate-buffered saline (PBS) Biowest L0615-500
EasySep Human Cord Blood CD34 Positive Selection Kit II Stemcell 17896
EDTA Invitrogen 15575-038
FACS Lysing solution 10X BD 349202 Dilute 1:10 in dH20 immediately before use
FACS tubes (Falcon 5 mL round-botton) Falcon 352052
Fc Receptor blocking solution (Human Trustain FcX) Biolegend 422302
Fetal bovine serum Sigma F8192-500
Ficoll-Paque PLUS GE Healthcare 17144002
Flowjo v.10
Gauze Mesoft 157300 Should be sterilized prior to use
Heating lamp Custom made
Hemacytometer (Bürker-Türk) VWR DOWC1597418
Isoflurane gas Orion Pharma 9658
LSR Fortessa X20 flow cytometer BD
Microcentrifuge tubes, PCR-PT approved Sarstedt 72692405
Mouse cART food ssniff Spezialdiäten GmbH Custom made product
Mouse restrainer Custom made product
Needle, Microlance 3, 30G ½" BD 304000
NOG mice NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Sug/JicTac Taconic NOG-F
Nuclease-free water VWR chemicals 436912C
Nucleospin 96 Virus DNA and RNA isolation kit Macherey-Nagel 740691
PCR-approved microcentrifuge tubes Sarstedt 72.692.405
Penicillin-Streptomycin solution 100X Biowest L0022-100
Phusion Hot Start II DNA polymerase Life Technologies F549S
Pipette tips, sterile, ART 20P Barrier ThermoScientific 2149P
Proteinase K NEB 100005398
QuantaSoft software Bio-Rad
QX100 Droplet Generator Bio-Rad 1886-3008
QX100 Droplet Reader Bio-Rad 186-3003
RBC lysis solution Biolegend 420301
RNase-free DNAse size F + reaction buffer Macherey-Nagel 740963
RNAseOUT Recombinant Ribonuclease inhibitor ThermoScientific 10777-019
RPMI Biowest L0501-500 Dissolve in H20
Softject 1 mL syringe Henke Sass Wolf 5010-200V0
Superscript III Reverse Transcriptase ThermoFisher Scientific 18080044
Thermoshaker VWR 89370-910
Trypane blue Sigma T8154
Ultrapure 0.5 EDTA, pH 8.0 ThermoFisher Scientific 15575-020
Virkon S (virus disinfectant) Dupont 7511

References

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Andersen, A. H. F., Nielsen, S. S. F., Olesen, R., Mack, K., Dagnæs-Hansen, F., Uldbjerg, N., Østergaard, L., Søgaard, O. S., Denton, P. W., Tolstrup, M. Humanized NOG Mice for Intravaginal HIV Exposure and Treatment of HIV Infection. J. Vis. Exp. (155), e60723, doi:10.3791/60723 (2020).

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