Summary
Abbiamo sviluppato un protocollo per la generazione e la valutazione di un modello murino NOG infettato da virus dell'immunodeficienza umana e umile basato sul trapianto di cellule staminali, sull'esposizione al virus dell'immunodeficienza umana intravaginale e sull'RNA PCR digitale a goccia e droplet Quantificazione.
Abstract
I topi umanizzati forniscono una piattaforma sofisticata per studiare la virologia del virus dell'immunodeficienza umana (HIV) e per testare i farmaci antivirali. Questo protocollo descrive la creazione di un sistema immunitario umano nei topi NOG adulti. Qui, spieghiamo tutti i passaggi pratici dall'isolamento delle cellule CD34 umane derivate dal sangue del cordone ombelicale e il loro successivo trapianto endovenoso nei topi, alla manipolazione del modello attraverso l'infezione da HIV, alla terapia antiretrovirale combinata ( cART), e il campionamento del sangue. Circa 75.000 cellule hCD34 vengono iniettate per via endovenosa nei topi e il livello di chimerismo umano, noto anche come umanizzazione, nel sangue periferico è stimato longitudinalmente per mesi dalla citometria di flusso. Un totale di 75.000 cellule hCD34 produce cellule CD45 per un totale di 75.000 hCD34 nel sangue periferico. I topi sono suscettibili all'infezione intravaginale da HIV e il sangue possono essere campionati una volta alla settimana per l'analisi e due volte al mese per periodi prolungati. Questo protocollo descrive un saggio per la quantificazione del carico virale al plasma utilizzando la PCR digitale delle goccionelline (ddPCR). Mostriamo come i topi possono essere trattati efficacemente con un regime cART standard-of-care nella dieta. La consegna di cART sotto forma di chow topo regolare è un significativo affinamento del modello sperimentale. Questo modello può essere utilizzato per l'analisi preclinica di composti di profilassi pre-esposizione sia sistemici che topici, nonché per testare nuovi trattamenti e strategie di cura dell'HIV.
Introduction
Il virus dell'immunodeficienza umana (HIV) è un'infezione cronica con più di 37 milioni di individui infetti in tutto il mondo1. La terapia antivirale combinata (cART) è una terapia salvavita, ma una cura è ancora giustificata. Pertanto, vi è la necessità di modelli animali che rispecchiano il sistema immunitario umano e le sue risposte al fine di facilitare la ricerca continua sull'HIV. Sono stati sviluppati diversi tipi di topi umanizzati che sono in grado di supportare l'innesto di cellule e tessuti trapiantando cellule umane in topi gravemente immunosensibili2. Tali topi umanizzati sono suscettibili all'infezione da HIV e forniscono un'importante alternativa ai modelli di virus immunodeficienza dei primati non umani, in quanto sono più economici e più semplici da usare rispetto ai primati non umani. I topi umanizzati hanno facilitato la ricerca sulla trasmissione virale dell'HIV, la patogenesi, la prevenzione e il trattamento3,4,5,6,7,8,9,10,11.
Vi presentiamo un sistema modello umanizzato flessibile per la ricerca sull'HIV sviluppato trapiantando cellule staminali umane derivate dal sangue cordonale nei topi del NOD. Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Sug/JicTac (NOG) sfondo. Oltre ad essere di origine non fetale, la bioingegneria pratica di questi topi è meno tecnicamente impegnativa rispetto alle procedure microchirurgiche coinvolte nel trapianto del costrutto sangue-fegato-timo (BLT).
Mostriamo come stabilire l'infezione da HIV attraverso la trasmissione intravaginale e come monitorare il carico virale al plasma con una configurazione sensibile basata su PCR digitale (ddPCR) di goccia. Successivamente, descriviamo l'istituzione di cART standard somministrata come parte della dieta quotidiana del topo. L'obiettivo di questi metodi combinati è quello di ridurre lo stress per gli animali e facilitare esperimenti su larga scala in cui il tempo impiegato per la manipolazione di ogni animale è limitato a12.
Nell'uomo, un genotipo CCR5n. 32/wt o CCR5-32 provoca una ridotta suscettibilità all'infezione da HIV con virus del trasmettitore/fondatore13, e alcune precauzioni devono essere prese quando i topi bioingegnerizzati con cellule staminali ai fini degli studi sull'HIV. Ciò è particolarmente vero nella nostra regione perché le varianti naturali nel gene CCR5, in particolare le delezioni di 32 dollari, sono più diffuse nelle popolazioni indigene scandinave e baltiche rispetto al resto del mondo14,15. Pertanto, il nostro protocollo include un semplice test ad alto throughput per lo screening delle cellule staminali ematopoietiche dei donatori per le varianti CCR5 prima del trapianto.
Per l'esposizione intravaginale abbiamo scelto il virus R5 trasmettitore/fondatore RHPA4259, isolato da una donna in una fase precoce dell'infezione che è stata infettata intravaginalmente16. Abbiamo esposto i topi a una dose virale sufficiente a produrre una trasmissione di successo nella maggior parte dei topi, ma al di sotto di un tasso di trasmissione del 100%. La scelta di una dose di questo tipo consente una portata dinamica sufficiente nel tasso di trasmissione tale che gli effetti antivirali di un farmaco candidato possono provocare animali protetti negli esperimenti di prevenzione dell'HIV e una riduzione del carico virale per gli studi di trattamento.
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Protocol
Tutti i campioni di sangue cordonale sono stati ottenuti in stretta conformità con protocolli approvati localmente, compreso il consenso informato della donazione anonima da parte dei genitori. Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati approvati ed eseguiti in stretta conformità con le normative nazionali danesi ai sensi della licenza 2017-15-0201-01312.
AVVISO: Gestire topi e sangue esposti all'HIV con estrema cautela. Decontaminare tutte le superfici e i liquidi che sono stati a contatto con l'HIV con un disinfettante HIV confermato (Tabella dei materiali).
1. Isolamento delle cellule staminali umane CD34
- Raccogli i campioni di sangue cordonale nei tubi di raccolta del sangue rivestiti in EDTA dopo sezioni cesarei pianificate o nascite vaginali e secondo le approvazioni etiche locali.
- Isolare i PMBC dal sangue cordonale mediante la separazione del gradiente di densità in base al protocollo del produttore.
- Isolare le cellule CD34 dalla popolazione PBMC pre-arricchendo con anticorpi contro marcatori comuni per le cellule mature, che induce il collegamento di cellule di lignaggi indesiderati con globuli rossi. Questo è seguito da arricchimento di cellule CD34 utilizzando perline magnetiche, secondo il protocollo del produttore.
- Determinare il numero di cellule vive in base all'esclusione blu trypan standard, resuedando 10 litri di sospensione cellulare in 90 - L di blu trypan. Aggiungere 10 l di questa soluzione a un emacytometro e contare le celle non blu, secondo il protocollo del produttore.
- Crioconservare le cellule CD34 in 1 mL del 10% di DMSO nel siero bovino fetale (FBS) fino al giorno del trapianto di topi.
- Crioconservare in modo vitale una piccola frazione delle cellule isolate (CD34) e delle cellule di flusso (CD34-) separatamente per la valutazione della purezza delle cellule staminali CD34 (30.000 cellule di ciascun campione). In alternativa, testare la purezza sulle cellule appena arricchite (vedere il punto 2 riportato di seguito).
- Congelare una frazione di flusso-attraverso non pelleta (CD34-) per la determinazione dello stato CCR5- 32. Le cellule possono essere congelate direttamente senza soluzione di congelamento condizionata, ma la presenza di globuli rossi nel pellet può inibire la successiva PCR se il flusso attraverso viene pelleta.
2. Valutazione della purezza delle cellule staminali CD34 tramite citometria di flusso
- Scongelare le cellule isolate (CD34) e le cellule di flusso (CD34-). Lavare le cellule ridisponendo le cellule da ciascuna fiala in 9 mL di temperatura ambiente (RT) TAC tampone, costituito da 2% siero bovino fetale (FBS) in salina tampone fosfato (PBS).
- Centrifuga per 5 min a 300 x g a celle a pellet.
- Versare il supernatante, risospendere le cellule nel liquido rimanente e trasferire ai tubi FACS. Ripetere il passaggio di lavaggio con 3 mL di buffer FACS. Dopo la seconda centrifugazione, versare il supernatante e risospendere le cellule nel liquido rimanente.
- Aggiungere 5 -L di Fc Receptor soluzione di blocco (Tabella dei materiali) e lasciare per 10 min a RT. Non lavare via la soluzione di blocco Fc Receptor.
- Aggiungere il mix contenente volumi predeterminati di anticorpi contro l'uomo CD3 (clone SK7) BUV395, CD34 (clone AC136), FITC e CD45 (clone 2D1) APC (Tabella 1). Lasciare le celle per 30 min a RT al buio. I fluorofori devono essere scelti in base a parametri che possono essere valutati con citometri di flusso disponibili senza richiedere una matrice di compensazione.
- Lavare le celle con 3 mL di buffer FACS.
- Centrifuga per 5 min a 300 x g a RT per pellet le cellule.
- Versare il supernatante e risospendere le cellule nel liquido rimanente.
- Ripetere questo passaggio di lavaggio 2x per assicurarsi che tutti gli anticorpi non legati siano stati rimossi.
- Registrare i campioni sul citometro di flusso (Tabella dei materiali) ed eseguire l'analisi dei dati con un software appropriato. La strategia di gating è presentata nella Figura 1A–F.
3. Screening genetico per CCR5- 32 varianti nel sangue cordonale
- Incubare 1,25 l di flusso non pelleta con 11,25 L di miscela PCR contenente 200 M di mix dNTP, 0,01 U/L polimerasi di DNA ad alta fedeltà, e i primi piani di primo e indietro descritti nella tabella 2.
- Regolare il volume con acqua priva di nuclenonsi a circa 12,5 gradi per ogni reazione PCR.
- Amplifica i frammenti genomici con il programma ciclistico PCR descritto nella tabella 3.
- Separare i prodotti PCR su un 2% gel agarose13.
- I prodotti PCR degli alleli di tipo selvaggio e gli alleli 32 di 32 dollari producono frammenti di PCR rispettivamente di 196 coppie di basi e di 164 coppie di basi, rendendoli facilmente distinguibili dall'elettroforesi gel13 (Figura 1G).
4. Trapianto di cellule staminali per via endovenosa
NOTA: Avere una persona che prepara le cellule in laboratorio e un'altra persona preparare i topi e lo spazio di lavoro per i trapianti è un approccio efficiente.
- In un impianto animale, 4-6 h prima del trapianto pianificato delle cellule staminali, irradiano NOD femminile di 6-7 settimane. Cg-Prkdcha scritto il Il2rgtm1Sug/JicTac (NOG) topi ( Tabella deimateriali) con 0,75 Gy con una sorgente Cs137. La migliore dose di precondizionamento può variare in base all'età del topo, alla fonte di radiazioni e ad altri fattori. Questo processo condiziona gli animali per un successo dell'innesto con cellule staminali umane.
- In un impianto per animali, preparare lo spazio di lavoro del banco di flusso e tutti i reagenti prima di portare i mouse o le cellule nell'area di lavoro.
- Posizionare un cuscinetto blu sterile per coprire la superficie di lavoro del banco di flusso. Preparare una garza sterile e un contenitore taglienti.
- Posizionare una lampada riscaldante disinfettata con il 70% di etanolo nel banco di flusso con una gabbia di topo sterile vuota sotto il calore.
- In laboratorio, scongelare le cellule CD34 isolate e diluirle in 9 mL di 37 c-C rpMI.
- Centrifugare le cellule a 350 x g per 5 min a RT, scartare il supernatante per aspirazione, e respendere il pellet in 1 mL di RPMI semplice a 37 gradi centigradi.
- Determinare il numero di celle mediante l'esclusione blu trypan e regolare il volume a 200 l per mouse. Fare un extra per prendere in considerazione eventuali perdite dovute alle successive fasi di gestione.
- Preparatevi a trapiantare più di 75.000 cellule CD34 per 200 -L in ogni topo.
- Le cellule possono essere tenute a 4 gradi centigradi durante il trasporto nell'impianto animale prima del trapianto. Evitare di mantenere le cellule sul ghiaccio per ridurre l'aggregazione o l'aggregazione.
- Nella struttura animale, portare la gabbia con i topi nel banco di flusso e trasferire i topi alla gabbia sotto la lampada di riscaldamento per dilatare i vasi sanguigni. Lasciare un'estremità della gabbia lontano dalla fonte di calore in modo che i topi possano allontanarsi dal fuoco dopo essersi riscaldati. I topi che si sono spostati alla fine della gabbia, lontano dalla fonte di calore, sono sufficientemente caldi per un'iniezione di vena della coda di successo.
- Caricare una siringa lubrificante da 1 mL al di sopra del marchio 800 ll con celle CD34 sospese. L'utilizzo di una siringa lubrificata da 1 mL faciliterà notevolmente l'iniezione endovenosa e aumenterà la precisione di questa tecnica.
- Fissare un ago da 30 G 13 mm e preparare l'ago e la siringa per l'iniezione. Questo ordine di funzionamento consente di caricare la siringa più velocemente proteggendo l'integrità delle cellule da trapiantare dato il possibile danno che può verificarsi durante la rapida aspirazione delle cellule attraverso un ago così piccolo calibro. Riempire il mozzo dell'ago con il liquido premendo lo stantuffo e rimuovere il liquido fino al segno di 200 -L dell'ago.
- Posizionare un topo riscaldato (passaggio 4.6) in un restrainer utilizzato per fare iniezioni IV. Iniettare con cura 200 l della sospensione cellulare nella vena posteriore del mouse. Spendere 2 s eseguendo il tuffo e mantenere l'ago inserito per circa 2 s dopo il completamento dell'iniezione. Questo assicura che le cellule siano migrate adeguatamente lontano dal sito di iniezione prima della rimozione dell'ago.
- Se necessario, pulire la coda del topo con garza sterile per rimuovere qualsiasi sangue visibile. Rimetti il mouse nella sua gabbia domestica non riscaldata. Ripetere la procedura di iniezione con i topi rimanenti.
5. Raccolta e trattamento del sangue per l'analisi
NOTA: L'innesto di cellule umane nel sangue periferico può essere valutato tramite citometria di flusso 3-5 mesi dopo il trapianto di cellule staminali umane.
- Estrarre campioni di sangue dai topi utilizzando tecniche locali approvate da IACUC.
- Raccogliere un massimo di 70-100 litri di sangue totale in sterili tubi di microcentrifuga PCR contenenti 10 : L di 0,5 M EDTA (pH - 8,0) per evitare la coagulazione del sangue.
6. Valutazione dell'innesto umano tramite citometria di flusso
- Trasferire 40-50 l di sangue nei tubi FACS.
- Aggiungere 5 - L di sistemare il Recettore Fc per prevenire il legame non specifico degli anticorpi e lasciare per 10 min a RT.
- Aggiungere il mix di anticorpi anti-umani per il topo contenente CD4 (clone SK3) BUV 496, CD8 (clone RPA-T8) BV421, CD3 (clone OKT3) FITC, CD19 (clone sj25c1) PE-Cy7, CD45 (clone 2D1) APC (tabella 4) e lasciare in rovina al buio per 30 min. Fluorophores deve essere scelto in base a parametri che possono essere valutati con la matrice di flusso disponibile senza alcun aumento.
- Aggiungere 2 mL di un buffer di lisciviazione dei globuli rossi appropriato per ogni tubo per lizzare i globuli rossi. Utilizzare un buffer di lisi appositamente formulato per la colorazione degli anticorpi prima della lisi dei globuli rossi (un esempio adatto è dato nella Tabella dei materiali). Vortice brevemente per garantire la distribuzione equa delle cellule nella soluzione di lising e lasciare per 10 min a RT. Distribuzione uguale delle cellule è importante.
- Aggiungere 2 mL di buffer FACS per arrestare la reazione di lisi.
- Centrifuga per 5 min a 300 x g a RT per pellet le cellule.
- Versare delicatamente il supernatante e il vortice fino a quando le cellule non vengono risospese.
- Aggiungere 3 mL di tampone e centrifuga FACS per 5 min a 300 x g a RT.
- Versare il super-natante e risospendere le cellule.
- Registrare i campioni su un citometro di flusso appropriato e analizzarli utilizzando un software appropriato (Tabella dei materiali). Analisi rappresentativa e risultati sono illustrati in Figura 2 e Figura 3.
7. Esposizione all'HIV intravaginale
NOTA: Il virus utilizzato per l'esposizione intravaginale dei topi può essere prodotto utilizzando protocolli pubblicati in precedenza17. Il virus viene mantenuto a -80 gradi centigradi e trasportato da un locale mentre viene conservato su ghiaccio secco seguendo protocolli approvati localmente. Il virus viene conservato sul ghiaccio secco fino a poco prima dell'esposizione dei topi. Il virus può essere diluito in RPMI semplice (evitare RPMI che ha antibiotici o additivi siero) per ottenere la concentrazione appropriata immediatamente prima dell'esposizione (21.400 IU sono stati utilizzati per questa esposizione IVAG). Una volta generato, tenere lo stock diluito sul ghiaccio bagnato per tutta la procedura per evitare cicli di congelamento-disgelo che si verificherebbero se il virus diluito fosse stato rimesso sul ghiaccio secco una volta scongelato.
- Preparare tutte le attrezzature e lo spazio di lavoro del banco di flusso come illustrato nella Figura 4 prima di portare i mouse o il virus nel banco di flusso (simile al passaggio 4.2).
- Posizionare la messa a fuoco della lampada di riscaldamento al centro dello spazio di lavoro in cui verrà posizionato il mouse durante la procedura di esposizione all'HIV. La lampada di riscaldamento non garantirà alcuna diminuzione della temperatura corporea dei topi. Possono essere utilizzate anche altre apparecchiature che controllano la temperatura (ad esempio un tampone di gel riscaldato o una coperta di acqua calda circolante, secondo le normative locali IACUC18).
- Portare sterili punte di pipetta da 20 l e una pipetta appropriata nel banco. Collocare un contenitore con disinfettante liquido (Tabella dei materiali) nel banco per l'inattivazione immediata di materiali e liquidi che sono stati a contatto con il virus.
- Mettere un mouse in una camera con il 3% di gas isoflurane e asciugamani di carta. Questa percentuale di gas anestesizzerà gli animali entro 2-4 min. Come per tutti gli altri materiali utilizzati con topi immunocari, l'apparato di anestesia deve essere correttamente disinfettato prima dell'uso.
- Una volta anetizzato, trasferire il mouse in un pad blu sterile sotto la lampada di riscaldamento. Inserire il muso del mouse in una maschera che fornisce gas isoflurane continuo del 3% per mantenere l'anestesia. Tenere il mouse alla base della coda, stomaco rivolto verso l'alto, con la mano che sostiene il mouse indietro come raffigurato in Figura 4.
- Con una punta sterile pipetta, stimolare l'area genitale accarezzando delicatamente verso l'alto verso l'ano per indurre lo svuotamento del retto, alleviando la pressione sulla vagina.
- Nuda con cura l'apertura vaginale avvolgendo la coda del topo sulle dita in modo che la vulva si apra naturalmente, forse con una leggera spinta utilizzando una punta sterile pipetta.
- Cambiare la punta della pipetta e la pipetta 20 - L di virus atraumaticamente nella vagina del topo senza creare bolle. Non inserire la punta in profondità nella vagina. Piuttosto, con la vulva aperta, posizionare la punta della pipetta a livello dell'apertura vaginale, evitare di andare più in profondità per eliminare il potenziale di abrasioni durante il processo di inoculazione, rilasciare il virus e consentire alla gravità di tirare il virus nella vagina. In alternativa, utilizzare un ago dritto da 22 G 1,25 mm consuntire, come descritto in Veselinovic et al.6.
- Conservare il topo in questa posizione con la vagina rivolta verso l'alto per 5 min dopo l'esposizione per evitare perdite di sospensione del virus indotta dalla gravità.
- Posizionare con attenzione il mouse nella gabbia di casa, avendo cura di posizionare il mouse sulla schiena.
8. Elaborazione di campioni di sangue prima dell'analisi del carico virale
- Raccogliere il sangue come descritto nella sezione 5 sopra.
- Centrifugare i campioni di sangue per 5 min a 500 x g a RT per separare il plasma e le cellule.
- Raccogliere 40 l di plasma per la misurazione del carico virale in un nuovo tubo sterile di microcentrifuga approvato dalla PCR e conservare a -80 gradi centigradi per almeno 1 h fino a un'ulteriore elaborazione. È importante congelare tutti i campioni prima dell'estrazione dell'RNA per evitare il rischio di bias di confrontare i livelli di RNA in campioni che non sono stati congelati prima dell'isolamento dell'RNA ai campioni congelati prima dell'isolamento dell'RNA.
- Regolare il volume del sangue al volume originale aggiungendo 40 -L di supporti di sospensione (PBS con 2,5% di albumin del siero bovino, 50 U/mL penicillin G e streptomycin, e 10 U/mL DNase, sterile-filtrato a 0,22 m).
- Trasferire 15 lll del volume sanguigno regolato su un nuovo tubo di microcentrifuga approvato dalla PCR.
- Aggiungere 1 mL di 1x soluzione di lisi RBC (Tabella dei materiali), vortice e incubare per 10 min a RT.
- Centrifuga per 1 min a 9.600 x g a celle a pellet.
- Aspirare supernatante e lasciare solo il piccolo pellet bianco globulino, perché la contaminazione dei globuli rossi può inibire la PCR.
- Conservare il pellet a -80 gradi centigradi per almeno 1 h fino a un'ulteriore lavorazione.
NOTA: Facoltativamente, il sangue rimanente del passaggio 8.4 può essere utilizzato per l'analisi della citometria di flusso, come descritto in precedenza nel passaggio 6.
9. Estrazione del DNA con un metodo di estrazione proteinasi K
- Estrarre il DNA dai pellet delle cellule periferiche (generati al punto 8.8) utilizzando un metodo di estrazione della proteinasi K come descritto di seguito. Questo metodo è stato dimostrato per estrarre il più alto rendimento di DNA da un piccolo volume di sangue come quello richiesto per le collezioni di sangue seriale utilizzate in questo studio19.
- Aggiungete 25 l di proteine assi K (20 g/mL) a 1 mL di buffer Tris da 0,1 M.
- Vortice brevemente la soluzione proteinasi K.
- Aggiungere 50 l della soluzione proteinase K a ogni pellet cellulare da digerire.
- Mescolare pipetting su e giù e confermare la sospensione del pellet cellulare.
- Agitare su un termoshaker (Tabella dei materiali) a 400 rpm (a seconda dello strumento) a 56 gradi centigradi per 1 h. Tubi a nastro verso il basso per tenerli in posizione, se necessario.
- Immediatamente e nello stesso termoshaker, inattivare la proteinasi K con uno spostamento di temperatura a 95 s mentre lo scuotimento continua per altri 20 minuti.
- Vorticare ogni campione.
- Mettete ogni campione a -80 gradi centigradi per un minimo di 30 min.
- Scongelare, quindi centrificare i campioni a 17.000 x g per 1 min a RT per pellet frammenti cellulari indesiderati.
- Collocare il supernatante contenente DNA in un nuovo tubo di microcentrifuga.
- Il modello DNA è pronto per la PCR. I modelli di DNA possono essere conservati a -80 gradi centigradi.
10. Estrazione dell'RNA, sintesi di cDNA e quantificazione ddPCR dell'RNA virale
- Isolare l'RNA dal plasma murino scongelato con un kit di isolamento dell'RNA virus seguendo il protocollo del produttore (Tabella dei materiali).
- Dopo l'aggiunta del campione alla colonna, aggiungere un passaggio di trattamento DNase su colonna per garantire la rimozione di tutto il DNA nel campione di plasma.
- Per ogni campione, aggiungere alla colonna 95 l di soluzione DNase senza RNase (miscelare 2 DNase senza RNAse e 98 buffer di reazione) alla colonna e incubare per 15 min a RT.
- Conservare i campioni di RNA a -80 gradi centigradi per almeno 1 h prima di un'ulteriore elaborazione. È importante congelare tutti i campioni dopo l'estrazione dell'RNA evitare il rischio di distorsione quando si confrontano campioni che non sono stati congelati con campioni che sono stati congelati.
- Sintetizzare cDNA utilizzando un passaggio di trascrizione inversa utilizzando reagenti come descritto in precedenza20. Assicurarsi di aggiungere 0,5 l di un inibitore di RNase alla reazione cDNA per evitare la degradazione dell'RNA.
- Eseguire la sintesi cDNA con il programma descritto nella tabella 5.
- Conservare i campioni di cDNA a -80 gradi centigradi per almeno 1 h. È importante congelare tutti i campioni dopo la sintesi del cDNA evitare il rischio di distorsione quando si confrontano campioni che non sono stati congelati con campioni che sono stati congelati.
- Preparare i campioni per il ddPCR come segue20:
- Mescolare 3 l di cDNA con 11 l l della miscela di sonda ddPCR (senza dUTP)20, 250 nM sonda di legame scanalatura minore e 900 nM di ciascuno dei primer in avanti e indietro, come descritto nella tabella 6.
- Regolare il volume totale di PCR a 22 gradi con acqua priva di nuclenon.
- Emulsionare le miscele PCR con olio di generazione Droplet per sonde su un generatore di goccioline secondo il protocollo del produttore e le descrizioni precedenti20.
- Eseguire il programma PCR come descritto nella tabella 7.
NOTA: Le sequenze primer/probe e i programmi PCR qui visualizzati sono stati appositamente progettati e ottimizzati per il rilevamento sensibile del ceppo HIV RHPA4259. Le sequenze di Primer e sonda possono essere facilmente regolate per rilevare qualsiasi altro ceppo HIV di scelta. - Rilevare la fluorescenza delle goccioline dai campioni su un lettore di goccioline e analizzare i risultati con il software appropriato in base al protocollo del produttore.
11. Trattamento con cART-contenente chow
- Topi da alimentazione con pellet contenenti un regime cART standard contenente 4.800 mg/kg raltegravir (RAL), 720 mg/kg tenofovir disoproxilate (TDF) e 520 mg/kg emtricitabine (FTC)21 (tabella 8). Queste dosi sono state determinate supponendo che un topo pesa 25 g e mangia 4 g di chow al giorno. Ciò corrisponde a una dose giornaliera di 768 mg/kg RAL, 2.88 mg/kg TDF, e 83 mg/kg FTC21.
- Utilizzare una dieta cART che è stato preparato da un fornitore esterno (Vedi Tabella dei materiali) di farmaci da prescrizione. Altre società potrebbero potenzialmente produrre anche questo regime. Utilizzare una dieta cART colorato di rosso per distinguerlo facilmente dal chow del mouse ordinario.
- Produrre una dieta di controllo chow senza cART in un colore marrone standard per una facile distinzione.
- Per l'avvio del cART, preparare gabbie di topo sterili con l'aggiunta di una dieta di chow contenente cART, quindi trasferire i topi dalla vecchia gabbia alla nuova gabbia.
- Monitorare i pesi dei topi e il consumo di cART-contenente chow da ispezione visiva per garantire che i mouse si stanno adattando al cambiamento.
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Representative Results
La strategia di gating per l'analisi della purezza delle cellule staminali è illustrata nella Figura 1. Figura 1A-C mostra la popolazione PURificata CD34 e Figura 1D– F il CD34- flow-through utilizzato per illustrare che la quantità minima della popolazione CD34 è perso nel processo di isolamento. La purezza delle cellule staminali isolate CD34 è stata tra l'85%-95% con meno dell'1% di contaminazione delle cellule T. Figura 1G raffigura bande di CCR5 da un donatore adulto di controllo umano con il genotipo CCR5-32/wt, seguito da bande di due CCR5wt/wt e un CCR5 donatori di cellulestaminali CCR5. La frequenza del genotipo CCR532/wt in un gruppo di 19 donatori era del 15,8% (Figura 1H). Questo è in accordo con studi epidemiologici più ampi14,15 che riportano il genotipo fino al 23,6% delle persone indagate in Danimarca.
I livelli di CD45 umani nel sangue periferico dei topi sono stati valutati attraverso la citometria di flusso 3-5 mesi dopo il trapianto di cellule staminali umane CD34. La strategia di gating è presentata in Figura 2A–E. Le figure 3A e la figura 3B illustrano la variabilità tra 10 e 16 topi singoli che ricevono cellule staminali da due donatori diversi. Il trapianto di 75.000 cellule hCD34 ha prodotto il 20%-50% di CD45 umano nel sangue periferico. Tutti i topi hanno sviluppato cellule B e T umane, comprese le cellule T CD4 e CD8.
Per le esposizioni intravaginali atraumatiche, è stata utilizzata l'impostazione illustrata nella Figura 4. I topi sono stati anestesizzati in una camera chiusa e tenuti sotto anestesia durante l'esposizione. I topi sono stati tenuti con la vagina rivolta verso l'alto per 5 min dopo l'esposizione per garantire l'impegno della soluzione antivirus con superfici mucose.
Figura 5A mostra il 64% tasso di successo trasmissione HIV osservato utilizzando questo modello. I topi sono stati sfidati con 21.400 unità infettive (IU) di RHPA4259 intravaginally. Questa dose ha portato 64% dei topi diventando HIV infetto a seguito di esposizione vaginale. Per fare un confronto, sono inclusi i dati di due diverse coorti di topi esposti attraverso un percorso endovenoso. Come previsto, il 100% dei topi è diventato l'HIV con dosi simili di RHPA e un ceppo aggiuntivo (YU2) utilizzando questo percorso.
Figura 5B illustra i risultati rappresentativi di tre topi che sono stati infettati con l'HIV e passati a una dieta contenente cART standard. I topi sono stati riportati alla normale chow del topo dopo 40 giorni di cART. In questa configurazione di saggio, il limite per il rilevamento del carico virale era di 725 copie/mL. I carichi virali erano tutti al di sotto del limite di rilevazione dopo 4 settimane di cART. Dopo la cessazione del cART, il virus ha rimbalzato, rispecchiando i dati clinici22. I topi su cART tollerato il cambiamento nella dieta così come indicato nella Figura 5C.
Figura 1: Strategia rappresentativa di citometria di flusso per la convalida della purezza delle cellule staminali e dello stato della variante del donatore CCR5. (A–C) La strategia di gating utilizzata per la popolazione isolata di cellule CD34. I doppietto e i detriti sono esclusi rispettivamente nei pannelli A e B (FSC-A contro FSC-H e FSC-A e SSC-A). (C) La frequenza delle cellule staminali CD34 e della contaminazione delle cellule T CD3. (D–F) La strategia di gating CD34. Le percentuali nei gate sono calcolate come frazione della popolazione padre. (G) I risultati di un'analisi CCR532/wt PCR. Corsia 1: DNA da un donatore umano CCR532/wt, corsie 2 e 3: due donatori di cellule staminali umane CCR5wt/wt, corsia 4: un donatore di cellule staminali umane CCR5. (H) La frequenza del genotipo CCR5- 32 /wt nel nostro gruppo di 19 campioni di cellule staminali è del 15,8%. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Strategia di gating della citometria di flusso per la convalida dell'innesto e della differenziazione delle cellule umane. La popolazione totale di cellule mononucleari provenienti da topi umanizzati è stata analizzata attraverso la citometria di flusso. (A) La percentuale di cellule umane CD45 è stata determinata come una frazione del totale degli eventi registrati. (B) Le doppiette sono state successivamente escluse in base alla base dell'atto FSC-A/FSC-H. (C) La vera popolazione di linfociti è stata definita in base alle dimensioni e alla granularità. (D) I linfociti sono stati poi caratterizzati come CD3 (cellule T) o CD19 (cellule B). (E) Le cellule T CD3 erano cellule T CD4 o cellule T CD8. Le percentuali nei cancelli sono state calcolate come frazione della popolazione madre. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Livelli di umanizzazione rappresentativi 4-5 mesi dopo il trapianto di cellule staminali con frazioni di sottotipo di cellule per 10 e 16 topi generati da due diversi donatori umani. (A) La popolazione di cellule mononucleari (MNC) da 10 e (B) 16 topi umanizzati sono stati analizzati tramite citometria di flusso e recintati come illustrato nella figura 2. La frazione delle cellule umane CD45 è presentata come %hCD45 (del totale MNC) e %B e %T cellule come frazione di hCD45. Le celle T sono state successivamente suddivise in %CD4 e %CD8. Ogni punto dati rappresenta un mouse. I dati sono presentati come media : SD. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Configurazione del banco di laboratorio sperimentale per l'esposizione intravaginale dei topi. Configurazione sperimentale per l'esposizione all'HIV di topi umanizzati attraverso il percorso intravaginale. La procedura viene eseguita in un banco di flusso in cui tutti i reagenti e le superfici sono stati sterilizzati prima dell'uso. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: Tasso di trasmissione dello sforzo hiv attraverso diverse vie di esposizione e efficacia e sicurezza del cART-contenente cART chow in soppressione virale. (A) I topi NOG umanizzati sono stati infettati con successo con due diversi ceppi di HIV attraverso il percorso intravaginale o il percorso endovenoso. I topi sono stati esposti con 21.400 IU di RHPA4259 intravaginally, 5.157 IUs IV con RHPA4259, o 3.000 IUs IV con YU2. I dettagli relativi all'esposizione IV di topi umanizzati non sono inclusi in questo protocollo. Le infezioni da HIV sono state trattate con successo con un regime cART somministrato attraverso il chow del topo. (B) Il carico virale è sceso al di sotto del rilevamento per tutti e tre i topi su cART e è rimbalzato dopo la cessazione del cART. La linea tratteggiata indica il limite di quantificazione a 725 copie/mL. I topi alimentati con cART chow hanno avuto uno sviluppo di peso simile a quello dei topi alloggiati su chow non-cART durante lo stesso periodo di tempo, indicando nessuna preferenza di gusto o effetti collaterali della dieta cART. (C) I pesi sono presentati come cambio di piega rispetto all'inizio del cART. Ogni punto dati rappresenta la media di tre animali - SD. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| Bersaglio anticorpale | Clone | Fluoroforo |
| CD3 (in questo caso) | clone SK7 | BUV395 |
| CD34 (informazioni in due) | clone AC136 | Fitc |
| CD45 (informazioni in stato indue) | clone 2D1 | Apc |
Tabella 1: Anticorpi utilizzati per la determinazione della purezza delle cellule staminali. Pannello di citometria a flusso multicolore suggerito per la valutazione della purezza delle cellule staminali. Sono elencati il bersaglio dell'anticorpo, il clone e il fluoroforo.
| Rilevamento CCR5-32 | Primer |
| Primer in avanti | 5'CTTCATTACACCTGCAGCT'3 |
| Primer inverso | 5'TGAAGATAAGCCTCACAGCC'3 |
Tabella 2: Primer PCR di rilevamento varianti CCR5 -32. Primer in avanti e inretro utilizzati per il rilevamento della delezione di 32 bp nel gene CCR5.
| No. di cicli | 1 | 45 | 1 | ∞ |
| Temperatura (C) | 98 | 98/63/72 | 72 | 10 |
| Tempo | 30 s | 10 s/30 s/15 s | 5 min | ∞ |
Tabella 3: Programma PCR di rilevamento varianti CCR5-32. Programma di ciclismo PCR utilizzato per amplificare il gene CCR5.
| Bersaglio anticorpale | Clone | Fluoroforo |
| CD4 (in questo caso) | SK3 | BUV 496 |
| CD8 (in questo caso) | NUMERO di giochi di posta elettronica | BV421 (in questo |
| CD3 (in questo caso) | OKT3 | Fitc |
| CD19 (informazioni in stato INstato CD1 | sj25c1 | PE-Cy7 |
| CD45 (informazioni in stato indue) | 2D1 (in questo modo) | Apc |
Tabella 4: Anticorpi utilizzati per la determinazione dell'umanizzazione dei topi. Pannello di citometria di flusso multicolore consigliato per l'umanizzazione. Sono elencati il bersaglio dell'anticorpo, il clone e il fluoroforo.
| No. di cicli | 1 | 1 | ∞ |
| Temperatura (C) | 51 | 80 | 4 |
| Tempo | 45 min | 15 min | ∞ |
Tabella 5: programma di amplificazione cDNA. Programma utilizzato per amplificazione del DNA del filato complementare all'RNA virale.
| Quantificazione dell'HIV | Primer |
| Primer in avanti | 5'AGGGCAGCATAGAGCAAAAAA'3 |
| Primer inverso | 5'CAAAGGAATGGGGTCTT'3 |
| Sonda FAM | 5'ATCCCCACTTCACAGATGC'3 |
Tabella 6: Primer HIV ddPCR. Primer e sonde utilizzati per l'amplificazione ddPCR del cDNA virale.
| No. di cicli | 1 | 39 | 1 | ∞ |
| Temperatura (C) | 95 | 95/54.5 | 98 | 4 |
| Tempo | 10 min | 30 s/1 min | 10 min | ∞ |
Tabella 7: programma HIV ddPCR. Programma di ciclismo PCR utilizzato per amplificazione dell'RNA virale.
| Raltegravir (RAL) | 4800 mg/kg |
| Tenofovir disoproxilate (TDF) | 720 mg/kg |
| Emtricitabina (FTC) | 520 mg/kg |
Tabella 8: Dieta per il chow del topecART. La dieta del chow del topo è stata formulata come pubblicato in precedenza21. La dieta chow è stata fatta su una base di chow topo standard, e dopo la produzione, il cibo è stato irradiato con 25 kGy e doppio-insaccato. Il chow è stato conservato a -20 gradi centigradi fino all'uso.
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Discussion
Lo sforzo murino gravemente immunocompromesso NOD. Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Sug/JicTac (NOG) è estremamente adatto per il trapianto di cellule e tessuti umani. Entrambe le vie immunitarie innate e adattativi in questi topi sono compromesse. I topi NOG e NSG ospitano una mutazionedi scied di Prkdc che si traduce nella funzione difettosa delle cellule T e B. Inoltre, questi topi non hanno un recettore funzionale dell'interleuchina-2 (catena gamma comune, IL2rg) indispensabile nei complessi di legame di molte citochine chiave come IL-2, IL-4, IL-7, IL-9, IL-15 e IL-21. I topi immunodeficienti, come il NOG, trapiantati con un sistema immunitario umano sono un potente strumento per lo studio della trasmissione dell'HIV e dell'immunologia. I contributi in questi campi realizzati utilizzando topi umanizzati sono stati ampiamente rivisti2,23,24,25,26. L'uso di questi topi per studiare le risposte immunitarie innate umane sta anche guadagnando maggiore attenzione27,28.
L'obiettivo di questo manoscritto è quello di fornire un protocollo completo delle procedure di mouse e ddPCR per passare da un mouse ingenuo ai dati di trasmissione e trattamento dell'HIV. Il nostro sistema ha utilizzato ddPCR per la quantificazione dell'RNA virale e del DNA. In una reazione ddPCR, i reattori sono partizionati in un massimo di 20.000 goccioline, ognuna contenente una singola reazione micro PCR separata. L'amplificazione di un bersaglio all'interno di una goccia porta ad un segnale fluorescente positivo per quella goccia. Pertanto, la lettura è binaria e applicando le analisi statistiche di Poisson, il numero di reazioni positive può essere tradotto direttamente in un certo numero di copie del modello nel campione originale. Il vantaggio di ddPCR risiede nella sua capacità di quantificare direttamente un obiettivo indipendentemente da una curva standard. Questo è particolarmente interessante quando si analizzano campioni di RNA che sono difficili da utilizzare come curve standard PCR a causa della loro natura labile29. Inoltre, analizzando più repliche dello stesso campione e unendo i singoli punti dati per la quantificazione del campione finale, la natura binaria di ddPCR consente di ridurre il limite di rilevamento delle copie del modello per mL del campione29. Ciò è particolarmente importante in un ambiente di mouse umanizzato, dove è disponibile solo materiale campione limitato ed è richiesta un'elevata sensibilità.
La somministrazione di cART ai topi umanizzati può essere fatta mediante gavage orale o iniezioni intraperitoneali con soluzioni di cART30,31,32, e come dimostrato di recente, dalla formulazione nella dieta21. Uno dei nostri principali obiettivi era l'implementazione di un regime di cART nella dieta dei topi per ridurre il potenziale stress sugli animali a causa delle fasi di gestione supplementari inerenti ad altri metodi di somministrazione di farmaci. La dose di medicinale che un topo mancherà può essere stimata con precisione in base all'assunzione media giornaliera di cibo dei topi33. La consegna orale attraverso la dieta serve come il percorso di consegna più semplice con uno stress minimo per l'animale e il carico di lavoro minimo per il gestore. Abbiamo basato la nostra combinazione di farmaci antivirali su precedenti studi pubblicati su topi umanizzati21,30. Inoltre, la nostra strategia cART è clinicamente rilevante dato che la combinazione di farmaci utilizzata clinicamente è somministrata oralmente da pazienti in tutto il mondo.
Alcune limitazioni sono notate per quanto riguarda l'uso di topi NOG. È importante sottolineare che le cellule T umane in questi topi sono coltivate in un ambiente timico del topo, al contrario di un ambiente umano. Il recente focus è sulla generazione di ceppi xenodestinatari che hanno un ambiente favorevole per lo sviluppo di robuste risposte immunitarie umane. Questi nuovi ceppi includono topi immunodeficienti transgenici per molecole di MHC umane, come A2. Questi modelli consentono risposte alle cellule T dell'antigene limitato da HLA che si traducono in una migliore maturazione e nelle funzioni degli effettori del sistema immunitario adattivo34. Un altro approccio consiste nel sostituire i geni del topo con citochine umane chiave per IL-3/GM-CSF35, IL-636, IL-1537, TPO, M-CSF38e IL-7/TSLP31. Tali modelli hanno guadagnato una maggiore attenzione per la loro capacità di generare una migliore differenziazione dei tipi di cellule innate. Il nostro protocollo è facilmente adattabile per l'umanizzazione e l'infezione da HIV dei topi che utilizzano tale ceppo immunodeficiente di fondo genetico migliorato.
In sintesi, la facilità e l'utilità dell'approccio descritto facilitano la ricerca nei campi correlati all'HIV in vivo. I topi umanizzati possono essere uno strumento molto potente per guidare la ricerca verso la generazione di ipotesi di ricerca migliori. Insieme alla generazione di topi umani più "umani" umanizzati con transgeni umani, crediamo che il nostro protocollo standardizzato contribuirà alla semplificazione delle procedure sperimentali in diversi ambienti di ricerca.
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Disclosures
Gli autori non dichiarano conflitti di interessi.
Acknowledgments
Gli autori desiderano ringraziare il personale di Biomedicine Animal Facility dell'Università di Aarhus, in particolare la sig.ra Jani Kàr per la manutenzione delle cozioni e per il monitoraggio del peso dei topi. Gli autori desiderano ringraziare il professor Florian Klein per lo sviluppo di cART standard-of-care e per la guida. Il seguente reagente è stato ottenuto attraverso il NIH AIDS Reagent Program, Division of AIDS, NIAID, NIH: pRHPA.c/2635 (cat-11744) dal Dr. John Kappes e dalla dott.ssa Christina Ochsenbauer.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Blue pad | VWR | 56616-031 | Should be sterilized prior to use |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A8022 | |
| CD19 (clone sj25c1) PE-Cy7 | BD Bioscience | 557835 | |
| CD3 (clone OKT3) FITC | Biolegend | 317306 | |
| CD3 (clone SK7) BUV395 | BD Bioscience | 564001 | |
| CD34 (clone AC136) FITC | Miltenyi | 130-113-740 | |
| CD4 (clone SK3) BUV 496 | BD Bioscience | 564652/51 | |
| CD45 (clone 2D1) APC | Biolegend | 368511/12 | |
| CD8 (clone RPA-T8) BV421 | BD Bioscience | 562428 | |
| ddPCR Supermix for probes (no dUTP) | Bio-Rad | 1863025 | |
| DMSO | Merck | 10,02,95,21,000 | |
| DNAse | Sigma | D4263 | For suspension buffer |
| dNTP mix | Life Technologies | R0192 | |
| Dulbeccos phosphate-buffered saline (PBS) | Biowest | L0615-500 | |
| EasySep Human Cord Blood CD34 Positive Selection Kit II | Stemcell | 17896 | |
| EDTA | Invitrogen | 15575-038 | |
| FACS Lysing solution 10X | BD | 349202 | Dilute 1:10 in dH20 immediately before use |
| FACS tubes (Falcon 5 mL round-botton) | Falcon | 352052 | |
| Fc Receptor blocking solution (Human Trustain FcX) | Biolegend | 422302 | |
| Fetal bovine serum | Sigma | F8192-500 | |
| Ficoll-Paque PLUS | GE Healthcare | 17144002 | |
| Flowjo v.10 | |||
| Gauze | Mesoft | 157300 | Should be sterilized prior to use |
| Heating lamp | Custom made | ||
| Hemacytometer (Bürker-Türk) | VWR | DOWC1597418 | |
| Isoflurane gas | Orion Pharma | 9658 | |
| LSR Fortessa X20 flow cytometer | BD | ||
| Microcentrifuge tubes, PCR-PT approved | Sarstedt | 72692405 | |
| Mouse cART food | ssniff Spezialdiäten GmbH | Custom made product | |
| Mouse restrainer | Custom made product | ||
| Needle, Microlance 3, 30G ½" | BD | 304000 | |
| NOG mice NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Sug/JicTac | Taconic | NOG-F | |
| Nuclease-free water | VWR chemicals | 436912C | |
| Nucleospin 96 Virus DNA and RNA isolation kit | Macherey-Nagel | 740691 | |
| PCR-approved microcentrifuge tubes | Sarstedt | 72.692.405 | |
| Penicillin-Streptomycin solution 100X | Biowest | L0022-100 | |
| Phusion Hot Start II DNA polymerase | Life Technologies | F549S | |
| Pipette tips, sterile, ART 20P Barrier | ThermoScientific | 2149P | |
| Proteinase K | NEB | 100005398 | |
| QuantaSoft software | Bio-Rad | ||
| QX100 Droplet Generator | Bio-Rad | 1886-3008 | |
| QX100 Droplet Reader | Bio-Rad | 186-3003 | |
| RBC lysis solution | Biolegend | 420301 | |
| RNase-free DNAse size F + reaction buffer | Macherey-Nagel | 740963 | |
| RNAseOUT Recombinant Ribonuclease inhibitor | ThermoScientific | 10777-019 | |
| RPMI | Biowest | L0501-500 | Dissolve in H20 |
| Softject 1 mL syringe | Henke Sass Wolf | 5010-200V0 | |
| Superscript III Reverse Transcriptase | ThermoFisher Scientific | 18080044 | |
| Thermoshaker | VWR | 89370-910 | |
| Trypane blue | Sigma | T8154 | |
| Ultrapure 0.5 EDTA, pH 8.0 | ThermoFisher Scientific | 15575-020 | |
| Virkon S (virus disinfectant) | Dupont | 7511 |
References
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