Summary
Dit werk beschrijft een protocol om ethanolniveaus in een embryo van zebravissen te kwantificeren met behulp van hoofdruimtegaschromatografie van de juiste blootstellingsmethoden voor embryoverwerking en ethanolanalyse.
Abstract
Foetale Alcohol Spectrum Disorders (FASD) beschrijven een zeer variabel continuüm van ethanol-geïnduceerde ontwikkelingsstoornissen, met inbegrip van gezichtsdysmorfologieën en neurologische stoornissen. Met een complexe pathologie treft FASD jaarlijks ongeveer 1 op de 100 kinderen die in de Verenigde Staten worden geboren. Door het zeer variabele karakter van FASD zijn diermodellen kritisch gebleken in ons huidige mechanistische begrip van door ethanol veroorzaakte ontwikkelingsfouten. Steeds meer laboratoria richten zich op het gebruik van zebravissen om door ethanol veroorzaakte ontwikkelingsfouten te onderzoeken. Zebravissen produceren grote aantallen extern bevruchte, genetisch hardnekkige, doorschijnende embryo's. Dit stelt onderzoekers in staat om de timing en dosering van blootstelling aan ethanol in meerdere genetische contexten nauwkeurig te controleren en de impact van blootstelling aan embryonale ethanol te kwantificeren door middel van live imaging technieken. Dit, gecombineerd met de hoge mate van behoud van zowel genetica als ontwikkeling met de mens, heeft bewezen dat zebravis een krachtig model is om de mechanistische basis van ethanolteratogeniteit te bestuderen. Echter, ethanol blootstelling regimes hebben gevarieerd tussen verschillende zebravissen studies, die de interpretatie van zebravissen gegevens over deze studies heeft verward. Hier is een protocol om ethanolconcentraties in zebravissenembryo's te kwantificeren met behulp van hoofdruimtegaschromatografie.
Introduction
Foetale alcoholspectrumstoornissen (FASD) beschrijven een breed scala aan neurologische stoornissen en craniofaciale dysmorfologieën geassocieerd met blootstelling aan embryonale ethanol1. Meerdere factoren, waaronder timing en dosering van blootstelling aan ethanol en genetische achtergrond, dragen bij aan de variatie van FASD2,3. Bij mensen maakt de complexe relatie van deze variabelen het bestuderen en begrijpen van de etiologie van FASD uitdagend. Diermodellen zijn cruciaal gebleken bij het ontwikkelen van ons begrip van de mechanistische basis van ethanolteratogeniteit. Een breed scala van dier model systemen is gebruikt om meerdere aspecten van FASD studie en de resultaten zijn opmerkelijk consistent met wat wordt gevonden in de blootstelling bij de mens4. Knaagdiermodelsystemen worden gebruikt om vele aspecten van de FASD te onderzoeken, waarbij muizen de meest voorkomende5,6,7zijn. Het merendeel van dit werk is gericht op ontwikkelingsfouten aan vroege blootstelling aan ethanol8, hoewel later blootstelling aan ethanol is aangetoond dat ontwikkelingsafwijkingen veroorzaken en9. Bovendien hebben de genetische vermogens van muizen sterk geholpen in ons vermogen om de genetische onderbouwing van FASD10,11te onderzoeken. Deze studies bij muizen suggereren sterk dat er gen-ethanol interacties met de sonische egel route, retinoïne zuur signalering, Superoxide dismutase, stikstofmonoxide synthase I, Aldh2 en Fancd28,10,11,12,13,14,15,16,17,18, 19,20,21. Deze studies tonen aan dat diermodellen van cruciaal belang zijn voor het bevorderen van ons begrip van De FASD en de onderliggende mechanismen ervan.
De zebravis is ontstaan als een krachtig modelsysteem om vele aspecten van ethanol teratogenese te onderzoeken22,23. Vanwege hun externe bevruchting, hoge vruchtbaarheid, genetische traktaaten en levende beeldvormingsmogelijkheden, zijn zebravis bij uitstek geschikt om factoren zoals timing, dosering en genetica van ethanolteratogenese te bestuderen. Ethanol kan worden toegediend aan precies geënsceneerde embryo's en de embryo's kunnen vervolgens worden afgebeeld om de directe impact van ethanol tijdens ontwikkelingsprocessen te onderzoeken. Dit werk kan rechtstreeks aan mensen worden verwant, omdat de genetische programma's van ontwikkeling hoogst behouden tussen zebravissen en mensen zijn en daarom kunnen helpen fasd menselijke studies24begeleiden. Terwijl zebravis zijn gebruikt om ethanol te onderzoeken, een gebrek aan consensus in de rapportage van embryonale ethanol concentraties maakt vergelijking met de mens moeilijk25. In zoogdiersystemen correleren de bloedalcoholniveaus rechtstreeks met weefselethanolniveaus26. Veel van de zebravisstudies behandelen embryo's vóór volledige vorming van hun bloedsomloop. Zonder moedermonster om te onderzoeken, is een proces om ethanolconcentraties te beoordelen nodig om ethanolniveaus in het embryo te kwantificeren. Hier beschrijven we een proces om ethanolconcentraties te kwantificeren in een zich ontwikkelend zebravisembryo met behulp van hoofdruimtegaschromatografie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle zebravisembryo's die in deze procedure werden gebruikt, werden gefokt en gefokt volgens de vastgestelde IACUC-protocollen27. Deze protocollen werden goedgekeurd door de Universiteit van Texas in Austin en de Universiteit van Louisville.
OPMERKING: De zebravislijn Tg(fli1:EGFP)y1 werd gebruikt in deze studie28. Al het water dat in deze procedure wordt gebruikt, is steriel omgekeerd osmosewater. Alle statistische analyses werden uitgevoerd met Behulp van Graphpad Prism v8.2.1.
1. Embryomedia maken
- Los 17,5 g NaCl, 0,75 g KCl, 2,9 g CaCl2, 0,41 g van K2HPO4, 0,142 g NA2HPO4en 4,9 g MgSO4·7H2O in 1 L water op. Negeer het witte neerslag dat zich vormt; dit zal geen invloed hebben op de media. Filter steriliseert de voorraadoplossing en bewaar bij 4 °C.
- Los 1,2 g NaHCO3 op in 1 L van 20x embryomediavoorraad en voeg 19 L water toe om de werkende embryomediaoplossing te creëren. Houd de werkende embryomediaoplossing op 28 °C.
2. Meten van het embryonale volume met behulp van waterverplaatsing
OPMERKING: In dit protocol worden 24 uur postbevruchting (hpf) embryo's(figuur 1)gebruikt. De embryo's die bij de volumemetingen worden gebruikt, worden niet gebruikt in de ethanolanalyse.
- Plaats 10 embryo's en extraembryonale vloeistof in 1,5 mL microcentrifugebuis met een volume van 250 μL (figuur 2A). Voeg water toe aan de vullijn van 250 μL (zie monster met geverfd water in figuur 2B).
- Herhaal stap 2.1 om recipiënten op te zetten voor embryo's die hun chorions hebben laten verwijderen.
- Om de chorion te verwijderen, plaatst u de embryo's in hun chorions in een 100 mm petrischaal met 2 mg/mL proteasecocktail in embryomedia op kamertemperatuur (RT) gedurende 10 min. Om de paar minuten, zachtjes wervelen de embryo's om de chorion te breken.
- Zodra alle embryo's vrij zijn van hun chorion, verwijder de gedechorionated embryo's uit protease cocktail/embryo media en plaats in een nieuwe 100 mm petrischaal met verse embryomedia om de embryo's te wassen. Herhaal deze wasstap 1 meer tijd (voor een totaal van 2 wasbeurten). Breng de embryo's over naar een verse petrischaal van 100 mm.
- Met behulp van de kleinst mogelijke tip en zonder beschadiging van de embryo's, zorgvuldig verwijderen van alle vloeistof uit de buurt van de embryo's met behulp van een p200 micropipettor (Figuur 2C) en weeg het water met een schaal met <0,1 mg precisie. Als u het volume van het monster van 10 embryo's wilt bepalen, trekt u het gewicht/volume van het water (1 mL water = 1 g water.) af van 250 μL. Om het volume van één embryo te bepalen, verdeelt u het verschil tussen 250 μL en het gewicht van het water dat door 10 wordt verwijderd.
3. Behandeling van embryo's met ethanol
- Verzamel embryo's uit paringstanks en plaats in een standaard petrischaal van 100 mm. Tel niet meer dan 100 embryo's per petrischaaltje uit en uitbroed bij 28,5 °C.
OPMERKING: Als de chorion moet worden verwijderd (stap 2.2), moet deze worden verwijderd voordat ethanol wordt toegevoegd. - Bij 6 pkf, voeg tot 100 embryo's toe aan een nieuwe standaard 100 mm Petrischaal met embryomedia of embryomedia + 1% ethanol (v/v). Dek af, maar verzegel de petrischaal niet. Plaats de embryo's in een laagtijdelijke couveuse op 28,5 °C gedurende 18 uur, of totdat de embryo's het ontwikkelingstijdpunt van 24 pk f bereiken.
4. Werkstroom voorbereiden alvorens de embryo's te verwerken op hoofdgaschromatografie
- Maak een oplossing van 5 M NaCl in water (450 μL zal per monsterbuis nodig zijn) om alle eiwitten te denatureren en ethanolmetabolisme te voorkomen. Maak de protease cocktail ( Table ofMaterials) met een concentratie van 2 mg/mL in embryomedia.
- Label een microcentrifugebuis van 1,5 m L en een gaschromatograafflesvan 2 mL voor elk monster. Label extra 2 mL gaschromatograaf flacons voor de hieronder beschreven ethanolnormen, evenals lucht, water en de 5 M NaCl/protease cocktail blanks.
- Stel drie p200-micropipettors twee set-op-50 μL en de derde set op 200 μL; een p1000 micropipettor ingesteld op 450 μL en een p2 micropipettor ingesteld op 2 μL. Voor de glaspipetten die worden gebruikt om embryo's van de petrischaaltjes naar de 1,5 mL microcentrifugebuizen over te brengen, passeert u snel de pipettip door een vlam om de randen glad te strijken om de embryo's niet te beschadigen wanneer ze in de pipet worden getrokken.
5. Verwerking van embryo's voor hoofdruimtegaschromatografie
OPMERKING: Zowel embryo's in hun chorions als embryo's die eerder uit hun chorions zijn verwijderd, worden hetzelfde behandeld voor consistentie bij de berekening van verdunningsfactoren.
- Met behulp van de twee p200 micropipettors ingesteld op 50 μL, trekken 50 μL van de protease cocktail oplossing in een en trekken 50 μL water in de tweede.
- Plaats met behulp van de glazen pipet en micropipett snel 10 embryo's (vanaf stap 3.2) in een microcentrifugebuis van 1,5 mL en sluit de dop (zoals beschreven in figuur 2A). Herhaal dit voor alle monsters die moeten worden getest, controles en met ethanol behandelde embryo's.
- Met behulp van de p200 micropipettor ingesteld op 200 μL, snel open de dop en verwijder alle resterende embryo media (zoals beschreven in figuur 2C). Plaats snel de pipet met 50 μL water in de buis en snel maar voorzichtig (om de embryo's niet te beschadigen) voeg, verwijder dan het water. Voeg snel 50 μL van de protease cocktailoplossing toe aan de wachtende pipett en sluit de buisdop(figuur 2D).
OPMERKING: Voer dit proces één monster tegelijk uit. - Laat het monster 10 min bij RT zitten om de proteasecocktail de chorion te laten degraderen. Voeg vervolgens snel 450 μL van 5 M NaCl toe en sluit de buisdop(figuur 2E). Vortex de monsters voor 10 min. Om het proces te versnellen, stelt u de mixer in om meerdere monsters tegelijk te vortexen.
OPMERKING: Voeg een kleine hoeveelheid (~ 100 μL) van een silicakraalmengsel (2 maten, 0,5 mm en 1 mm kraal) toe aan elke buis met embryo's ouder dan 24 pkf. In oudere embryo's blijft het notochord intact, ongeacht hoe lang ze gehomogeniseerd zijn. - Na het homogeniseren gedurende 10 min, snel verwijderen 2 μL van gehomogeniseerde embryo supernatant en toe te voegen aan een gaschromatograaf flacon. Sluit de flacon snel af met de polytetrafluorethyleendop.
6. Voorbereiding van media- en ethanolnormen
- Om de medianormen voor te bereiden, verdunt u de media met een factor 10 met een 5 M NaCl/protease cocktailoplossing. Voeg 2 μL van elk monster toe aan een gaschromatograafflacon en afdichting met een polytetrafluorethyleendop.
- Om de ethanolnormen voor te bereiden, creëert u een seriële verdunning van 100% ethanol in 5 M NaCl/protease cocktailoplossing voor de volgende concentraties: 0,3125, 0,625, 1,25, 2,5, 5, 10, 20 en 40 mM. Voeg 2 μL van elke standaard toe aan een gaschromatograafflacon en afdichting met een polytetrafluorethyleendop.
7. Voorbereiden van de hoofdruimte gaschromatograaf
OPMERKING: Deze instelling en het protocol moeten mogelijk worden gewijzigd, afhankelijk van de gebruikte gaschromatograaf. Hoofd ruimte gas chromatografie wordt gebruikt om ethanol niveaus te kwantificeren, niet voor scheiding.
- Stel de verwarming voor de autosampler in op 58 °C en schakel in. Laat de kachel 58 °C bereiken en zet de lucht- en waterstofgasleidingen aan die de gaschromatograaf voeden (voor vlamionisatie die wordt gebruikt om de ethanol te kwantificeren).
OPMERKING: De psi moet worden ingesteld om de chromatograaf goed te bedienen volgens de specificaties van de fabrikant. Zorg ervoor dat de heliumlijn aan staat en ingesteld op de juiste psi. - Voor het septum, zorg ervoor dat het aantal monsters geïnjecteerd is niet >100. Voor de injectievezel moet u ervoor zorgen dat het aantal geïnjecteerde monsters niet >500 is.
OPMERKING: Als een van beide is over de hoeveelheid injecties, zullen ze moeten worden gewijzigd voordat het uitvoeren van de test monsters. - Schakel de analysesoftware in en zorg ervoor dat het werkstation goed is ingesteld. Bewaar alle gegevens volgens lab/afdelingsstandaarden. Maak een nieuwe voorbeeldlijst voor de uit te voeren monsters.
- Start de opstartmethode en wacht tot de vlamionisatiedetector stabiliseert voordat de monsters worden uitgevoerd. Eenmaal stabiel, voer de software opstarten methode om de vezel schoon te maken.
8. Monstermetingen met behulp van hoofdruimtegaschromatografie
- Zodra de opstartmethode is voltooid, maakt u 1 nieuwe regel per voorbeeld in de voorbeeldlijst. Uit het methodemenu in de analysesoftware, laad 436 Huidige spme ethanol 2013 3min absorberen 2_5min rg run. METH voor elk monster in de steekproeflijst.
- Vul de voorbeeldlijst in, te beginnen met de lucht, water, 5 M NaCl/protease cocktail blanks. Voer vervolgens in de normen in volgorde, van 0,3125 tot 40 mM. Volg de normen met een tweede ronde van de lucht, water en 5 M NaCl/protease cocktail blanks.
- Voer alle gehomogeniseerde embryo supernatant monsters worden getest, van de laagste tot hoogste voorspelde ethanol concentratie. Einde door het invoeren van een derde en laatste ronde van de lucht, water, en 5 M NaCl / protease cocktail blanks.
- Voeg de gaschromatograafflesjes toe aan de autosampler in de volgorde waarin de monsters zijn ingevoerd. Laat monsters 10-15 min opwarmen.
- Nadat alle monsters en de uiteindelijke spaties zijn uitgevoerd, activeert u de uitschakelmethode in de software door een definitief monster toe te voegen in de voorbeeldlijst en stand-by te werken. METH. Een back-up maken van alle gegevens die tijdens de steekproefworden verkregen. Schakel de apparatuur in de volgende volgorde uit: autosamplerkachel, waterstoftank en pas na de chromatograaftemperatuur 30 °C, de luchttank. Laat de heliumtank aan om de waskolom te behouden.
9. Steekproef ethanol piek integratie en monster concentratie analyse
OPMERKING: Alle waarden vanaf 9,3 zijn berekend in een excelbestand dat alle vooraf ingevulde vergelijkingen hebben ingevuld.
- Zodra de afsluitmethode is voltooid, klikt u op Chromatogram openen. Open de map met de resultaten. Monsters worden automatisch geïntegreerd in dit programma.
- Zorg er in de resultaten voor dat de juiste pieken zijn geïntegreerd (ethanolpieken tussen 2 en 2,5). Zodra alle monsters zijn bevestigd, print of exporteer t.a.v. de resultaten.
- Zet de piekhoogte van de ethanolnormen in een grafiek in. Bereken de helling, Y-onderschepping en R2-waarden voor de ethanolnormen (R2 moet >0,99) zijn.
OPMERKING: Deze waarden worden gebruikt om de ethanolconcentratie van de monsterpiekhoogte te bepalen. - Trek voor elk monster de piekhoogte van het monster af van de Y-onderschepping van de ethanolnormen. Verdeel deze waarde door de helling van de ethanolnormen om de ethanolwaarde voor elk monster in de GC-flesjes te verkrijgen.
- Om de ethanolconcentratie in de embryo's te berekenen, berekent u eerst de verdunningsfactor voor elk monster. Neem de volumemeting berekend in stap 2.3 van dit protocol en verdeel deze door de volumemeting plus 500 μL. Dit vertegenwoordigt de 5 M NaCl/protease cocktailoplossing die tijdens de embryoverwerking aan elk monster is toegevoegd (stappen 5.3 en 5.4).
- Vermenigvuldig met behulp van deze verdunningsfactor met de steekproef ethanolwaarde voor elk monster. De resultaten zullen in mM concentratie zijn. Bereken mediareferentiemonsters door de waarde van de media-ethanol te vermenigvuldigen met de verdunningsfactor van 10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bloedethanol niveaus kunnen niet worden bepaald in de vroege embryonale zebravissen, omdat ze niet over een volledig gevormde bloedsomloop. Om het ethanolgehalte in de zebravisembryo's te bepalen, worden de ethanolniveaus rechtstreeks gemeten aan de andere dag van gehomogeniseerd embryonaal weefsel. Om de embryonale ethanolconcentraties goed te meten, moet rekening worden gehouden met het embryonale volume. Het embryo (dooier bevestigd) zit in de chorion (eierschaal) omgeven door extraembryonaal vocht (figuur 1). Elke volumemeting van het embryo moet worden uitgevoerd op embryo's op het moment van blootstelling, omdat het embryonale volume gedurende de ontwikkelingstijd zal veranderen naarmate het embryo in omvang toeneemt. Bovendien moet rekening worden gehouden met de verwerking van het embryo en met het embryonale volume, omdat beide elementen verdunningsfactoren creëren die worden gebruikt om het gehalte aan embryonale ethanol te berekenen.
Omdat het embryo geen perfecte bol is, vooral na 10 pkf, werd waterverplaatsing gebruikt om het embryonale volume te beoordelen. Deze studie gebruikte embryo's bij 24 pkf. Het volume van de embryo's zowel in hun chorion als de embryo's die uit hun chorion werden verwijderd, werden gemeten. Deze volumes bedroegen 1,97 μL (± 0,4 SD) μL voor het embryo met extraembryonaal vocht en 1,1 (± 0,22 SD) μL voor het embryo alleen(tabel 1). Dit verschil tussen het embryo met extraembryonaal vocht en het embryo alleen is het volume van de extraembryonale vloeistof, die het embryo in het chorion omringt (figuur 1). Dit verschil is van cruciaal belang bij het bepalen van de ethanolconcentratie van het embryo alleen in de monsters. Uit de analyse bestond het embryo uit 56% van het totale volume van het embryo met extraembryonaal vocht in het chorion (tabel 1). Naarmate het embryo groeide, nam het embryonale volume in de loop van de tijd toe, wat resulteerde in een afname van het volume van de extraembryonale vloeistof25. Bij het meten van ethanolconcentraties uit embryo's die nog in hun chorion zitten, moet rekening worden gehouden met het watergehalte in zowel het embryo als het extraembryonaalvocht.
Eerder gepubliceerd werk heeft aangetoond dat de waterfractie in het embryo alleen al 73,6%29is . Dit resultaat werd verkregen met behulp van een combinatie van volumemetingen, elektronenspinresonantiespectroscopie en magnetische resonantiemicroscopie. Om dit resultaat te bevestigen, werden embryo's alleen gewogen voor en na het bakken bij 70 °C, zoals eerder beschreven25. Dit proces verwijdert al het water uit het embryo. De verandering in gewicht vertegenwoordigt de hoeveelheid water in het embryo. Uit deze analyse, een 24 hpf embryo bevatte ~ 72% water, terwijl een 48 hpf embryo bevatte ~ 76%. Beide waarden zijn zeer vergelijkbaar met het eerderberekendeembryonale watervolume van 73,6%. Dit suggereert dat het watervolume van het embryo weinig verandert tijdens de vroege ontwikkeling.
Op basis van het gepubliceerde werk waarbij meerdere benaderingen werden gebruikt om het watervolume in het embryo te berekenen, werd 73,6% gebruikt als embryonaal watergehalte voor alle gepresenteerde analyses. Dit resulteerde in water van 0,82 μL van het 1,1 μL embryonaal volume (tabel 1). Hieruit werd het volume van de extraembryonale vloeistof berekend als 0,86 μL. Van het totale watervolume van het embryo met extraembryonaal vocht bevindt zich 49% in het embryo en zit 51% in de extraembryonale vloeistof(tabel 1).
Voor de gaschromatografieanalyse werden slechts 24 pkf embryo's gebruikt die nog in hun chorion zaten (figuur 1). In dit ethanolregime werden embryo's behandeld met 1% (171 mM) ethanolmediaconcentratie van 6-24 pk, hoewel verschillende ethanolconcentraties en blootstellingstijdvensters kunnen worden gebruikt, afhankelijk van het experimentele ontwerp. Twee groepen van 15 monsters (10 embryo's per monster) en de media waarmee ze werden behandeld gedurende 2 verschillende experimentele dagen(tabel 2)werden geanalyseerd. Medianiveaus kunnen variëren van experiment tot experiment. Om rekening te houden met deze, media-ethanol niveaus werden gemeten 5x per experimentele groep. In deze analyse bedroegen de medianiveaus 143,6 (± 2,3 SD) mM voor groep 1 en 133,6 (± 2,7 SD) mM voor groep 2. Deze waarden zijn aanzienlijk verschillend met behulp van een ongepaarde t-test (p = 0,0002). De embryo's met extraembryonale vloeistof gemiddeld 63,5 (± 17,1 SD) mM en 53,1 (± 12,6 SD) mM voor respectievelijk de groepen 1 en 2. De concentratie was echter niet significant verschillend tussen de 2 groepen embryo's met extraembryonaal vocht (ongepaarde t-test, p = 0,07). Onbehandelde controleembryo's werden gemeten op 0 mM. Vanwege de variatie in medianiveaus werd een verhouding van de concentratie/media van embryonale ethanol voor elk monster berekend. Groep 1 had 44% van de media-ethanolniveaus, terwijl groep 2 40% van het niveau van media-ethanol had(figuur 3 en tabel 2).
Figuur 1: Een afbeelding van een embryo op 24 uur postferatie (hpf) in de chorion. Het embryo en de dooier zijn omgeven door de extraembryonale vloeistof, allemaal gelegen in de chorion. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: Protocol om het embryonale volume te meten en de embryo's te verwerken voor analyse. (A) Tien 24 pk fenembryo's overgebracht naar een microcentrifugebuis van 1,5 mL met een volume van 250 μL. (B) De microcentrifugebuis met embryo's gevuld met water (water wordt geverfd zodat het gemakkelijker te zien is op de 250 μL-markering). (C) Al het water wordt verwijderd uit de buis en gewogen. (D) Tien embryo's overgebracht naar een microcentrifugebuis van 1,5 mL. Het water werd verwijderd zoals in (C) en vervangen door 50 μL protease cocktail. (E) Na 10 min werd 450 μL van 5 M NaCl aan de buis toegevoegd van (D). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: Box and whisker plot van de verhouding van ethanol concentratie van monsters naar media. De ethanolconcentratie voor elke groep werd gedeeld door het gemiddelde van de mediamonsters van die groep. Groep 1 bevatte 44% van het medianiveau, terwijl groep 2 40% bevatte. In beide groepen, n = 15; 10 embryo's per monster. Groepen werden vergeleken met behulp van een enkele ANOVA met een Tukey's post hoc analyse (****p < 0,0001). De snorharen vertegenwoordigen minimum tot maximaal. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
| Embryo en embryo + extraembryowatervolumes (μL) | ||||||
| Watera | ||||||
| Totaal volumeb | % van het totale volume (V) | Embryonaal volume (W) | Extraembryonaal Volume (X) | % water in embryo (Y) | % Water in Extraembryonaal (Z) | |
| Embryo + Extraembryonaal (EE)c | 1,97 ± 0,4 | |||||
| Embryo 24 pkf (E)c | 1,11 ± 0,22 | 56% | 0.82 | 0.86 | 49% | 51% |
| Berekeningen | ||||||
| V Embryo % van het totale volume = Totaal Volume E ∙ Totaal eE | ||||||
| W Embryonaal watervolume = V × 73,6% | ||||||
| X Extraembryonaal watervolume = W – Totaal volume EE | ||||||
| Y% Water in Embryo = (W + X)/W × 100 | ||||||
| Z% Water in Extraembryonaal = 100 – Y | ||||||
| a Het embryonale watervolume werd berekend op basis van Hagedorn et al.29. | ||||||
| b. Waarden worden gerapporteerd als ± standaarddeviatie (SD). | ||||||
| cn = 13; 10 embryo's per monster | ||||||
Tabel 1: Berekening van het watervolume voor de embryo's met extraembryonale vloeistof. Het volume werd berekend op basis van 13 monsters (10 embryo's per monster) van 24 pk f embryo's met extraembryonaal vocht nog in het chorion en embryo's verwijderd uit hun chorion. Waarden worden gerapporteerd als het gemiddelde ± SD.
| Ethanol Concentratie van embryo's en media (mM)a | |||
| Groep 1 | Groep 2 | Gecombineerd | |
| Media (M)b | 143,6 ± 2,3 | 133,6 ± 2,7 | 138,6 ± 5,8 |
| Embryo + Extraembryonaal (EE)c | 63,5 ± 17,1 | 53,1 ± 12,6 | 58,3 ± 15,7 |
| Verhouding van ethanol - embryo tot media (1) | 0,44 ± 0,12 | 0,40 ± 0,09 | 0,42 ± 0,11 |
| Berekeningen | |||
| 1. Verhouding ethanol = EE ∙ M | |||
| a Waarden worden gerapporteerd als ± SD. | |||
| bn = 5 | |||
| cn = 15; 10 embryo's per monster | |||
| d Waarden zijn het gemiddelde van de groepen 1 en 2. | |||
Tabel 2: Berekeningen van de ethanolconcentratie in embryo's met extraembryonale vloeistof en media (mM). Mediamonsters waren directe maatregelen van de media (n = 5 per groep). De embryonale ethanolconcentratie werd berekend op basis van 15 monsters (10 embryo's per monster) uit 24 hpf embryo's met extraembryonaal vocht. De verhouding tussen de ethanolconcentraties van de embryo's met extraembryonaal vocht en de media werd berekend. Waarden worden gerapporteerd als het gemiddelde ± SD.
| Berekening van ethanol in het embryoa,b | |
| Embryo (Y) | Verhouding tot media (Z) |
| 32,7 ± 8,8 mM | 0,24 ± 0,06 |
| Berekeningen | |
| Y Embryonale ethanol = 58,3 mM (tabel 2) × 56% (tabel 1) | |
| Z Verhouding ethanol = Y ∙ 138,6 mM (tabel 2) | |
| a Waarden zijn het gemiddelde van de groepen 1 en 2. | |
| b. Waarden worden gerapporteerd als ± SD. | |
Tabel 3: Berekening van ethanol in het embryo. De embryonale ethanolconcentratie werd berekend als 56% van de totale ethanolconcentratie van het embryo met extraembryonaal vocht. Dit werd toen gemeld als een verhouding van embryo tot media. Waarden worden gerapporteerd als het gemiddelde ± SD.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Als ontwikkelingsmodelsysteem zijn zebravissen bij uitstek geschikt om de impact van omgevingsfactoren op de ontwikkeling te bestuderen. Ze produceren grote aantallen extern bevruchte embryo's, die het mogelijk maakt voor nauwkeurige timing en dosering paradigma's in ethanol studies. Dit, gecombineerd met de live imaging mogelijkheden en de genetische en ontwikkelingsbescherming met de mens, maken zebravissen een krachtig modelsysteem voor teratologie studies. Beschreven is een protocol voor het meten van embryonale ethanol concentraties in de ontwikkeling van zebravissen embryo's met behulp van hoofd ruimte gas chromatografie.
Het bepalen van de embryonale ethanolconcentratie is van cruciaal belang om de impact van ethanol op het zich ontwikkelende embryo te begrijpen. In knaagdiermodellen correleren de concentraties bloedethanol met weefselconcentraties26. Het is echter niet mogelijk om het gehalte aan bloedethanol te beoordelen in de vroege embryonale ontwikkeling bij een zebravis. Hoofd ruimtegaschromatografie is gebruikt om ethanolniveaus te meten in verschillende experimentele paradigma's, waaronder zebravissen25,30,31,32,33,34,35. Dit protocol kan echter worden gebruikt om veel verschillende omgevingsfactoren te meten, ook al moet de volatiliteit van deze verschillende factoren hoog genoeg zijn om kwantitatief te meten en moet een gaschromatograafkolom worden gekozen op basis van de polariteit van de betrokken verbindingen. Bovendien zijn zebravis het meest geschikt om de impact van in water oplosbare factoren te bestuderen, omdat blootstelling aan hydrofobe factoren uiterst moeilijk te analyseren is bij vissen.
Dit protocol stelt onderzoekers in staat om de ethanolconcentraties in zebravissenembryo's direct te beoordelen. Er moeten echter verschillende factoren worden aangepakt om nauwkeurige metingen van de concentraties van embryonale ethanol te garanderen. Omdat ethanolniveaus in totale embryonale weefsels werden gemeten, moest rekening worden gehouden met het embryonale volume. Na 10 pkf begint het embryo somitogenese (somitevorming) en is het niet langer een bol (figuur 1). Om het embryonale volume te beoordelen, werd waterverplaatsing gebruikt op 10 gepoolde embryo's per monster. Elk monster bestond uit 10 embryo's om twee redenen: ten eerste om fouten van het beaaiden van kleine volumes te verminderen, en ten tweede, om kleine schommelingen in embryovolumes te compenseren. Bij het meten van het embryonale volume is het belangrijk om rekening te houden met de precisie van pipetteren en wegen. Zelfs het gebruik van 10 embryo's per monster bevindt zich op de ondergrens van precisie voor zowel de pipetten als de schaal die wordt gebruikt om de embryo's te wegen. Met de beschikbare apparatuur zou het gebruik van minder dan 10 embryo's invloed hebben gehad op de analyses. Dit beperkt onderzoekers niet om minder embryo's per monster te gebruiken zolang de precisie van de apparatuur wordt overwogen.
Embryonaal volume is een factor die van invloed is op de steekproefanalyse. Een tweede belangrijke factor is de snelheid van de embryonale verwerking, omdat ethanol vluchtig is. Bovendien, ethanol snel equilibrates in meerdere dierstudies25,36,37. Ons wasprotocol is ontworpen om snel ethanol te verwijderen die zich aan het buitenoppervlak van de chorion vasthoudt. In deze studie had dit wasprotocol geen invloed op de embryonale ethanolniveaus, hoewel langere of meervoudige wasbeurten de concentraties embryonale ethanol25,38konden beïnvloeden . Een derde factor waarmee rekening moet worden gehouden, is echter de verdunning van het embryonale volume tijdens de verwerking. Dit protocol maakt gebruik van een protease cocktail om de chorion en 5 M NaCl te degraderen om alle eiwitten te denatureren, inclusief alcoholverwerkingsenzymen.
Ten slotte zijn in een breed scala aan zebravisstudies een reeks analyses en rapportagemethoden beschreven. Als gevolg van variatie in verschillende monsters van een studie of het vergelijken van verschillende studies, is een goede rapportage van ethanolconcentratie van cruciaal belang25,38. Methoden met indirecte (meestal enzymatische maatregelen) zijn afhankelijk van de analyse van een secundaire metaboliet. In dat geval kan de snelheid van enzymatische activiteit variëren en een nauwkeurige analyse van de ethanolconcentratie belemmeren. Deze methode meet direct ethanolniveaus en ethanolconcentraties worden gerapporteerd als een verhouding tussen embryo-concentraties en mediaconcentraties. Onze resultaten zijn in lijn met een groeiende consensus van een 24 pkf embryo met ~30% van de mediaconcentraties (Tabel 3)25,38,39,40. Verrassend genoeg is deze concentratie van 30% embryonale ethanol onafhankelijk van de mediaconcentratie, en het is niet goed begrepen wat dit evenwicht25,38creëert. Embryo's ouder dan 24 pkf vertonen een afname van de ethanolconcentraties, met 48 hpf embryo's die bijna de helft van het ethanolgehalte van een 24 pk f embryo25bevatten . Onze resultaten bepalen echter niet het ethanol-water evenwicht. Gezien de snelheid waarmee ethanol equilibrates, evenals de volatiliteit van ethanol, is het ongelooflijk moeilijk om watervolume veranderingen in het embryo zelf als gevolg van blootstelling aan ethanol te beoordelen. Het meten van het volume van een met ethanol behandeld embryomonster met behulp van waterverplaatsing zal tijdens de meting resulteren in verlies van ethanol uit het embryo. Met behulp van nauwkeurigere microscopie- en spectroscopiemethoden dan hierboven beschreven, kan het mogelijk zijn om het ethanol-waterevenwicht in een embryo te bepalen door beide tegelijkertijd rechtstreeks te meten.
Over het geheel genomen is het hier beschreven protocol een krachtig instrument waarmee embryonale ethanolconcentraties in de ontwikkeling van zebravissenembryo's kunnen worden beoordeeld. Deze informatie is van cruciaal belang bij het standaardiseren van FASD-studies met behulp van zebravissen. De mogelijkheid om ethanolbehandelingsparadigma's nauwkeurig te beheersen en embryonale ethanolconcentraties direct te kwantificeren, versterkt de functionaliteit van het zebravismodel voor menselijke FASD-studies. Uiteindelijk zal dit werk ons begrip van FASD sterk verbeteren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Het onderzoek gepresenteerd in dit artikel werd ondersteund door eerdere subsidies van national institutes of health / National Institute of Dental and Craniofacial Research (NIH / NIDCR) R01DE020884 aan J.K.E. en National Institutes of Health/National Institute on Alcohol Abuse and Alcoholism (NIH/NIAAA) F32AA021320 to C.B.L. and by the current grant from National Institutes of Health/National Institute on Alcohol Abuse (NIH/NIAAA) R00AA023560 to C.B.L. Wij danken Rueben Gonzales voor het verstrekken en assisteren met gaschromatograaf analyse. Wij danken Tiahna Ontiveros en Dr Gina Nobles schriftelijke hulp.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Air | Provided by contract to the university | ||
| Analytical Balance | VWR | 10204-962 | |
| AutoSampler, CP-8400 | Varian | Gas Chromatograph Autosampler | |
| Calcium Chloride | VWR | 97062-590 | |
| Ethanol | Decon Labs | 2701 | |
| Gas chromatograph vial with polytetrafluoroethylene/silicone septum and plastic cap 2 mL | Agilent | 8010-0198 | Can reuse the vials after cleaning, but not the caps/septa |
| Gas Chromatograph, CP-3800 | Varian | ||
| Helium | Provided by contract to the university | ||
| HP Innowax capillary column | Agilent | 19095N-123I | 30 m x 0.53 mm x 1.0 μm film thick |
| Hyrdogen | Provided by contract to the university | ||
| Magnesium Sulfate (Heptahydrate) | Fisher Scientific | M63-500 | |
| Microcentrifuge tube 1.5 mL | Fisher Scientific | 2682002 | |
| Micropipette tips 10 μL | Fisher Scientific | 13611106 | |
| Micropipette tips 1000 μL | Fisher Scientific | 13611127 | |
| Micropipette tips 200 μL | Fisher Scientific | 13611112 | |
| Petri dishes 100 mm | Fisher Scientific | FB012924 | |
| Pipetman L p1000L Micropipette | Gilson | FA10006M | |
| Pipetman L p200L Micropipette | Gilson | FA10005M | |
| Pipetman L p2L Micropipette | Gilson | FA10001M | |
| Polytetrafluoroethylene/silicone septum and plastic cap | Agilent | 5190-7021 | Replacement caps/septa for gas chromatograph vials |
| Potassium Chloride | Fisher Scientific | P217-500 | |
| Potassium Phosphate (Dibasic) | VWR | BDH9266-500G | |
| Pronase | VWR | 97062-916 | |
| Silica Beads .5 mm | Biospec Products | 11079105z | |
| Silica Beads 1.0 mm | Biospec Products | 11079110z | |
| Sodium Bicarbonate | VWR | BDH9280-500G | |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | S271-500 | |
| Sodium Phosphate (Dibasic) | Fisher Scientific | S374-500 | |
| Solid-phase microextraction fiber assembly Carboxen/Polydimethylsiloxane | Millipore Sigma | 57343-U | Replacement fibers |
| Star Chromatography Workstation | Varian | Chromatography software | |
| Thermogreen Low Bleed (LB-2) Septa | Millipore Sigma | 23154 | Replacement inlet septa |
References
- Elliott, E. J., Payne, J., Morris, A., Haan, E., Bower, C. Fetal alcohol syndrome: a prospective national surveillance study. Archive of Diseases in Childhood. 93 (9), 732-737 (2008).
- Cudd, T. A. Animal model systems for the study of alcohol teratology. Experimental Biology and Medicine. 230 (6), 389-393 (2005).
- Williams, J. F., Smith, V. C. Committee on Substance Abuse. Fetal Alcohol Spectrum Disorders. Pediatrics. 136 (5), 1395-1406 (2015).
- Patten, A. R., Fontaine, C. J., Christie, B. R. A comparison of the different animal models of fetal alcohol spectrum disorders and their use in studying complex behaviors. Frontiers in Pediatrics. 2, 93 (2014).
- Petrelli, B., Weinberg, J., Hicks, G. G. Effects of prenatal alcohol exposure (PAE): insights into FASD using mouse models of PAE. Biochemistry and Cell Biology. 96 (2), 131-147 (2018).
- Mayfield, J., Arends, M. A., Harris, R. A., Blednov, Y. A. Genes and Alcohol Consumption: Studies with Mutant Mice. International Review Neurobiology. 126, 293-355 (2016).
- Marquardt, K., Brigman, J. L. The impact of prenatal alcohol exposure on social, cognitive and affective behavioral domains: Insights from rodent models. Alcohol. 51, 1-15 (2016).
- Sulik, K. K. Genesis of alcohol-induced craniofacial dysmorphism. Experimental Biology and Medicine. 230 (6), 366-375 (2005).
- Lipinski, R. J., et al. Ethanol-induced face-brain dysmorphology patterns are correlative and exposure-stage dependent. PLoS One. 7 (8), 43067 (2012).
- Eberhart, J. K., Parnell, S. The genetics of fetal alcohol spectrum disorders. Alcoholism: Clinical and Experimental Research. 40 (6), 1154-1165 (2016).
- Becker, H. C., Diaz-Granados, J. L., Randall, C. L. Teratogenic actions of ethanol in the mouse: a minireview. Pharmacology, Biochemistry and Behavior. 55 (4), 501-513 (1996).
- Ahlgren, S. C., Thakur, V., Bronner-Fraser, M. Sonic hedgehog rescues cranial neural crest from cell death induced by ethanol exposure. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (16), 10476-10481 (2002).
- Loucks, E. J., Ahlgren, S. C. Deciphering the role of Shh signaling in axial defects produced by ethanol exposure. Birth Defects Research Part A: Clinical and Molecular Teratology. 85 (6), 556-567 (2009).
- Hong, M., Krauss, R. S. Cdon mutation and fetal ethanol exposure synergize to produce midline signaling defects and holoprosencephaly spectrum disorders in mice. PLoSGenetics. 8 (10), 1002999 (2012).
- Aoto, K., Shikata, Y., Higashiyama, D., Shiota, K., Motoyama, J. Fetal ethanol exposure activates protein kinase A and impairs Shh expression in prechordal mesendoderm cells in the pathogenesis of holoprosencephaly. Birth Defects Research Part A: Clinical and Molecular Teratology. 82 (4), 224-231 (2008).
- Deltour, L., Ang, H. L., Duester, G. Ethanol inhibition of retinoic acid synthesis as a potential mechanism for fetal alcohol syndrome. The FASEB Journal. 10 (9), 1050-1057 (1996).
- Wentzel, P., Eriksson, U. J. Ethanol-induced fetal dysmorphogenesis in the mouse is diminished by high antioxidative capacity of the mother. Toxicological Sciences. 92 (2), 416-422 (2006).
- Karacay, B., Mahoney, J., Plume, J., Bonthius, D. J. Genetic absence of nNOS worsens fetal alcohol effects in mice. II: microencephaly and neuronal losses. Alcoholism: Clinical and Experimental Research. 39 (2), 221-231 (2015).
- Bonthius, D. J. Jr, Winters, Z., Karacay, B., Bousquet, S. L., Bonthius, D. J. Importance of genetics in fetal alcohol effects: null mutation of the nNOS gene worsens alcohol-induced cerebellar neuronal losses and behavioral deficits. Neurotoxicology. 46, 60-72 (2015).
- Bonthius, D. J., et al. Deficiency of neuronal nitric oxide synthase (nNOS) worsens alcohol-induced microencephaly and neuronal loss in developing mice. Brain Research. Developmental Brain Research. 138 (1), 45-59 (2002).
- Langevin, F., Crossan, G. P., Rosado, I. V., Arends, M. J., Patel, K. J. Fancd2 counteracts the toxic effects of naturally produced aldehydes in mice. Nature. 475 (7354), 53-58 (2011).
- Lovely, C. B., Fernandes, Y., Eberhart, J. K. Fishing for Fetal Alcohol Spectrum Disorders: Zebrafish as a Model for Ethanol Teratogenesis. Zebrafish. 13 (5), 391-398 (2016).
- Fernandes, Y., Buckley, D. M., Eberhart, J. K. Diving into the world of alcohol teratogenesis: a review of zebrafish models of fetal alcohol spectrum disorder. Biochemistry and Cell Biology. 96 (2), 88-97 (2018).
- McCarthy, N., et al. Pdgfra protects against ethanol-induced craniofacial defects in a zebrafish model of FASD. Development. 140 (15), 3254-3265 (2013).
- Lovely, C. B., Nobles, R. D., Eberhart, J. K. Developmental age strengthens barriers to ethanol accumulation in zebrafish. Alcohol. 48 (6), 595-602 (2014).
- Harris, R. A., Trudell, J. R., Mihic, S. J. Ethanol's molecular targets. Science Signaling. 1 (28), (2008).
- Westerfield, M. The Zebrafish Book: A guide for the laboratory use of zebrafish Danio (Brachydanio) rerio. , University of Oregon Press. Eugene, OR. (1993).
- Lawson, N. D., Weinstein, B. M. In vivo imaging of embryonic vascular development using transgenic zebrafish. Developmental Biology. 248 (2), 307-318 (2002).
- Hagedorn, M., Kleinhans, F. W., Artemov, D., Pilatus, U. Water Distribution and permeability of zebrafish embryos, Brachydanio rerio. Journal of Experimental Zoology. 278 (6), 356-371 (1997).
- Lippi, G., et al. The alcohol used for cleansing the venipuncture site does not jeopardize blood and plasma alcohol measurement with head-space gas chromatography and an enzymatic assay. Biochemia Medica. 27 (2), 398-403 (2017).
- Poklis, J. L., Wolf, C. E., Peace, M. R. Ethanol concentration in 56 refillable electronic cigarettes liquid formulations determined by headspace gas chromatography with flame ionization detector (HS-GC-FID). Drug Testing and Analysis. 9 (10), 1637-1640 (2017).
- Heit, C., et al. Quantification of Neural Ethanol and Acetaldehyde Using Headspace GC-MS. Alcoholism: Clinical and Experimental Research. 40 (9), 1825-1831 (2016).
- Chun, H. J., Poklis, J. L., Poklis, A., Wolf, C. E. Development and Validation of a Method for Alcohol Analysis in Brain Tissue by Headspace Gas Chromatography with Flame Ionization Detector. Journal of Analytical Toxicology. 40 (8), 653-658 (2016).
- Schlatter, J., Chiadmi, F., Gandon, V., Chariot, P. Simultaneous determination of methanol, acetaldehyde, acetone, and ethanol in human blood by gas chromatography with flame ionization detection. Human and Experimental Toxicology. 33 (1), 74-80 (2013).
- Schier, C. J., Mangieri, R. A., Dilly, G. A., Gonzales, R. A. Microdialysis of ethanol during operant ethanol self-administration and ethanol determination by gas chromatography. Journal of Visualized Experiments. (67), e4142 (2012).
- Adalsteinsson, E., Sullivan, E. V., Mayer, D., Pfefferbaum, A. In vivo quantification of ethanol kinetics in rat brain. Neuropsychopharmacology. 31 (12), 2683-2691 (2006).
- Quertemont, E., Green, H. L., Grant, K. A. Brain ethanol concentrations and ethanol discrimination in rats: effects of dose and time. Psychopharmacology. 168 (3), 262-270 (2003).
- Flentke, G. R., Klinger, R. H., Tanguay, R. L., Carvan, M. J., Smith, S. M. An evolutionarily-conserved mechanism of calcium-dependent neurotoxicity. Alcoholism: Clinical and Experimental Research. 38 (5), 1255-1265 (2014).
- Reimers, M. J., Flockton, A. R., Tanguay, R. L. Ethanol- and acetaldehyde-mediated developmental toxicity in zebrafish. Neurotoxicology and Teratology. 26 (6), 769-781 (2004).
- Zhang, C., Ojiaku, P., Cole, G. J. Forebrain and hindbrain development in zebrafish is sensitive to ethanol exposure involving agrin, Fgf, and sonic hedgehog function. Birth Defects Research Part A: Clinical and Molecular Teratology. 97 (1), 8-27 (2013).
