Summary
Detta arbete beskriver ett protokoll för att kvantifiera etanolnivåer i ett zebrafiskembryo med hjälp av gaskromatografi för huvudutrymmen från lämpliga exponeringsmetoder för embryobearbetning och etanolanalys.
Abstract
Fetala alkoholspektrumstörningar (FASD) beskriver ett mycket varierande kontinuum av etanolinducerade utvecklingsdefekter, inklusive ansiktsdysmorfoser och neurologiska funktionsnedsättningar. Med en komplex patologi drabbar FASD cirka 1 av 100 barn födda i USA varje år. På grund av fasds mycket varierande karaktär har djurmodeller visat sig vara avgörande i vår nuvarande mekanistiska förståelse av etanolinducerade utvecklingsdefekter. Allt fler laboratorier har fokuserat på att använda zebrafisk för att undersöka etanolinducerade utvecklingsdefekter. Zebrafisk producerar ett stort antal externt befruktade, genetiskt ursåtbara, genomskinliga embryon. Detta gör det möjligt för forskare att exakt kontrollera timing och dosering av etanol exponering i flera genetiska sammanhang och kvantifiera effekterna av embryonal etanol exponering genom levande bildframställning tekniker. Detta, i kombination med den höga graden av bevarande av både genetik och utveckling med människor, har visat zebrafisk vara en kraftfull modell för att studera den mekanistiska grunden för etanol teratogenicitet. Etanolexponeringsregimer har dock varierat mellan olika zebrafiskstudier, som har förvirrat tolkningen av zebrafiskdata i dessa studier. Här är ett protokoll för att kvantifiera etanol koncentrationer i zebrafisk embryon med hjälp av huvudet utrymme gaskromatografi.
Introduction
Fetala alkoholspektrumstörningar (FASD) beskriver ett brett spektrum av neurologiska funktionsnedsättningar och kraniofacial dysmorphologies i samband med embryonal etanol exponering1. Flera faktorer, inklusive timing och dosering av etanolexponering och genetisk bakgrund, bidrar till variationen av FASD2,3. Hos människor gör det komplexa förhållandet mellan dessa variabler att studera och förstå etiologin för FASD utmanande. Djurmodeller har visat sig vara avgörande för att utveckla vår förståelse av den mekanistiska grunden för etanolteratogenicitet. Ett brett utbud av djurmodellsystem har använts för att studera flera aspekter av FASD och resultaten har varit anmärkningsvärt förenliga med vad som finns i exponering hos människor4. Gnagare modellsystem används för att undersöka många aspekter av FASD, med möss är den vanligaste5,6,7. Majoriteten av detta arbete har fokuserat på utvecklingsdefekter till tidig etanolexponering8, men senare exponering för etanol har visat sig orsaka utvecklingsavvikelser samt9. Dessutom har mössens genetiska förmåga i hög grad hjälpt till i vår förmåga att undersöka den genetiska grunden för FASD10,11. Dessa studier på möss tyder starkt på att det finns genetanol interaktioner med sonic igelkott en väg, retinoinsyra signalering, Superoxid dismutase, kväveoxid syntas I, Aldh2 och Fancd28,10,11, 12,13,14,15,16,17,18, 19,20,21. Dessa studier visar att djurmodeller är avgörande för att främja vår förståelse av FASD och dess underliggande mekanismer.
Zebrafisken har vuxit fram som ett kraftfullt modellsystem för att undersöka många aspekter av etanol teratogenes22,23. På grund av deras externa befruktning, hög fruktbarhet, genetiska tarmeffekter och levande bildförmåga, zebrafisk är idealiska för studier faktorer såsom timing, dosering, och genetik etanol teratogenes. Etanol kan administreras till exakt iscensatta embryon och embryona kan sedan avbildas för att undersöka etanolens direkta effekter under utvecklingsprocesser. Detta arbete kan relateras direkt till människor, eftersom de genetiska utvecklingsprogrammen är mycket bevarade mellan zebrafiskar och människor och kan därför hjälpa till att vägleda FASD mänskliga studier24. Medan zebrafisk har använts för att undersöka etanol teratogenes, en brist på samförstånd i rapporteringembryonaletanol koncentrationer gör jämförelse med människor svårt25. I däggdjurssystem korrelerar alkoholhalten i blodet direkt till vävnadsetanolnivåer26. Många av zebrafiskstudierna behandlar embryon innan de slutför bildandet av deras cirkulationssystem. Utan ett mödraprov att undersöka krävs en process för att bedöma etanolkoncentrationer för att kvantifiera etanolnivåerna inom embryot. Här beskriver vi en process för att kvantifiera etanolkoncentrationer i ett växande zebrafiskembryo med hjälp av gaskromatografi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla zebrafiskembryon som användes i detta förfarande höjdes och uppfördes efter etablerade IACUC-protokoll27. Dessa protokoll godkändes av University of Texas i Austin och University of Louisville.
OBS: Zebrafish linjen Tg (fli1:EGFP)y1 användes i denna studie28. Allt vatten som används i detta förfarande är sterilt omvänd osmosvatten. Alla statistiska analyser utfördes med Graphpad Prism v8.2.1.
1. Att göra embryomedier
- För att göra en 20x lager av embryomedia, lös 17,5 g NaCl, 0,75 g KCl, 2,9 g CaCl2, 0,41 g K2HPO4, 0,142 g NA2HPO4, och 4,9 g MgSO4·7H2O i 1 L vatten. Ignorera den vita fällningen som bildas; detta kommer inte att påverka medierna. Filtrera sterilisera lagerlösningen och förvaras vid 4 °C.
- För att skapa den fungerande embryomedielösningen löser du upp 1,2 g NaHCO3 i 1 L av 20x embryomedialager och lägger till 19 L vatten. Behåll lösningen för fungerande embryomedier vid 28 °C.
2. Mätning av embryonal volym med hjälp av vattenförskjutning
OBS: I detta protokoll används 24 h postfertilning (hpf) embryon(figur 1). De embryon som används i volymmätningarna används inte i etanolanalysen.
- Placera 10 embryon och extraembryonal vätska i 1,5 ml mikrocentrifugrör märkt med en volym av 250 μL(figur 2A). Tillsätt vatten till fylllinjen på 250 μL (se prov med färgat vatten i figur 2B).
- Upprepa steg 2.1 för att sätta upp kärl för embryon som har fått sina chorions borttagna.
- För att ta bort chorion, placera embryona i sina chorions i en 100 mm Petri maträtt med 2 mg/ml proteas cocktail i embryomedia vid rumstemperatur (RT) i 10 min. Med några minuters mellanrum, snurra försiktigt embryona för att bryta chorion.
- När alla embryon är fria från sin chorion, ta bort de dechorionerade embryonfrån proteas cocktail / embryo media och placera i en ny 100 mm Petri maträtt med färska embryomedier för att tvätta embryon. Upprepa denna tvätt steg 1 mer tid (för totalt 2 tvättar). Överför embryona till en ny petriskål på 100 mm.
- Använd den minsta spetsen som möjligt och utan att skada embryona, ta försiktigt bort all vätska från runt embryona med hjälp av en p200 mikropipettor (figur 2C) och väg vattnet med en skala med <0,1 mg precision. För att bestämma provets volym på 10 embryon, subtrahera vattenvikten/volymen (1 ml vatten = 1 g vatten.) som avlägsnats från 250 μL. För att bestämma volymen på ett enda embryo, dela skillnaden mellan 250 μL och vikten av det vatten som avlägsnats med 10.
3. Behandling av embryon med etanol
- Samla embryon från parningstankar och placera i en standard 100 mm Petri skålen. Räkna ut högst 100 embryon per enskild Petriskål och inkubera vid 28,5 °C.
OBS: Om chorion en ska tas bort (steg 2.2) måste den tas bort innan den tillförs etanol. - Vid 6 hpf, tillsätt upp till 100 embryon till en ny standard 100 mm Petri skålen antingen med embryomedia eller embryomedia + 1% etanol (v /v). Täck, men försegla INTE Petriskålen. Placera embryona i en låg tempinkubator inställd på 28,5 °C för 18 h, eller tills embryona når utvecklingstiden på 24 hkf.
4. Förbereda arbetsflödet innan embryona bearbetas för gaskromatografi för huvudutrymmen
- Gör en lösning på 5 M NaCl i vatten (450 μL kommer att behövas per provrör) för att denaturera alla proteiner och förhindra etanolmetabolism. Gör proteascocktailen(Table of Materials)vid en koncentration av 2 mg/ml i embryomedier.
- Märk ett mikrocentrifugrör på 1,5 ml och en 2 ml gaskromatografinjektionsflaskan för varje prov. Märk ytterligare 2 ml gaskromatografflaskor för etanolstandarder som beskrivs nedan samt luft, vatten och 5 M NaCl/proteas cocktailämnen.
- Ställ in tre p200 mikropipettorer två inställda på 50 μL och den tredje uppsättningen till 200 μL; en p1000 micropipettor inställd på 450 μL och en p2 micropipettor inställd på 2 μL. För glasrör som används för att överföra embryon från Petri-rätterna till 1,5 ml mikrocentrifugrör, snabbt passera pipettspetsen genom en låga för att jämna ut kanterna för att inte skada embryona när de dras in i pipetten.
5. Bearbetning av embryon för gaskromatografi för huvudutrymmen
OBS: Båda embryona i sina chorions och de som tidigare tagits bort från sina chorions behandlas på samma sätt för konsekvens i beräkningen av utspädningsfaktorer.
- Dra 50 μL av proteascocktaillösningen till ett och dra in 50 μl vatten i den andra.
- Använd glaspipetten och mikropipettor, placera snabbt 10 embryon (från steg 3.2) i ett 1,5 ml mikrocentrifugrör och stäng locket (enligt beskrivningen i figur 2A). Upprepa för att alla prover ska testas, kontroller och etanolbehandlade embryon.
- Använd p200 micropipettor inställd på 200 μL, öppna snabbt locket och ta bort alla kvarvarande embryomedier (enligt beskrivningen i figur 2C). Placera snabbt pipetten som innehåller 50 μl vatten i röret och snabbt men försiktigt (för att inte skada embryona) tillsätt och ta sedan bort vattnet. Tillsätt snabbt 50 μl av proteascocktaillösningen från den väntande pipettorn och stäng rörlocket(figur 2D).
Obs: Utför den här processen ett exempel i taget. - Låt provet sitta på RT i 10 min för att tillåta proteascocktail en försämrachorionen. Tillsätt sedan snabbt 450 μl 5 M NaCl och stäng rörlocket(figur 2E). Vortex proverna i 10 min. För att påskynda processen, ställa in mixern för att virvla flera prover samtidigt.
OBS: Tillsätt en liten mängd (~100 μL) av en kiseldioxidbeadblandning (2 storlekar, 0,5 mm och 1 mm pärlstav) till alla rör med embryon äldre än 24 hkf. I äldre embryon kommer notochor förblir intakt oavsett hur länge de homogeniseras. - Efter homogenisering i 10 min, ta snabbt bort 2 μL homogeniserad embryo supernatant och tillsätt en gaskromatografinjektionsflaskan. Försegla snabbt injektionsflaskan med polytetrafluoretenlocket.
6. Utarbetande av medie- och etanolstandarder
- För att förbereda mediestandarder, späd media med en faktor 10 med en 5 M NaCl / proteas cocktail lösning. Tillsätt 2 μl av varje prov i en gaskromatografinjektionsflaskor och försegla med ett polytetrafluoretenlock.
- För att förbereda etanolstandarder, skapa en seriell utspädning av 100% etanol i 5 M NaCl / proteas cocktail lösning till följande koncentrationer: 0,3125, 0,625, 1,25, 2,5, 5, 10, 20 och 40 mM. Tillsätt 2 μL av varje standard till en gaskromatografinjektionsflaskor och tätning med ett polytetrafluoretenlock.
7. Förbereda huvudutrymmet gas kromatograf
OBS: Den här inställningen och protokollet kan behöva ändras beroende på vilken gaskromatograf som används. Huvudutrymme gaskromatografi används för att kvantifiera etanolnivåer, inte för separation.
- Ställ värmaren för autosampler till 58 °C och slå på. Låt värmaren nå 58 °C och slå på luft- och vätgasledningarna som matar gaskromatografen (för flamjonisering som används för att kvantifiera etanolen).
OBS: PSI bör ställas in för att korrekt använda kromatografen enligt tillverkarens specifikationer. Se till att heliumlinjen är på och ställ in på rätt psi. - För septum, se till att antalet ininjicerade prover inte är >100. För injektionsfibern, se till att antalet injicerade prover inte är >500.
OBS: Om någon av dem är över mängden injektioner måste de ändras innan testproverna körs. - Slå på analysprogramvaran och se till att arbetsstationen är korrekt konfigurerad. Lagra alla data enligt labb-/avdelningsstandarder. Skapa en ny exempellista för att exemplen ska köras.
- Initiera startmetoden och vänta tills flamjoniseringsdetektorn stabiliseras innan proverna körs. När stabil, kör metoden för att starta programvaran för att rengöra fibern.
8. Provmätningar med hjälp av gaskromatografi för huvudutrymmen
- När startmetoden är klar skapar du 1 ny rad per exempel i exempellistan. Från metodmenyn i analysprogrammet, ladda 436 Aktuell spme etanol 2013 3min absorbera 2_5min rg springa. meth för varje prov i exempellistan.
- Fyll i provlistan, som börjar med luft, vatten, 5 M NaCl / proteas cocktail ämnen. Ange sedan i standarderna i ordning, från 0,3125 till 40 mM. Följ standarderna med en andra omgång av luft, vatten och 5 M NaCl / proteas cocktail ämnen.
- Ange alla homogeniserade embryosupernatantprover som ska testas, från lägsta till högsta förväntade etanolkoncentration. Avsluta med att gå in i en tredje och sista omgången av luft, vatten och 5 M NaCl / proteas cocktail ämnen.
- Tillsätt gaskromatografflaskorna i autosampler i den ordning där proverna angavs. Låt proverna värmas upp i 10–15 min. Starta provet körs i programvaran.
- När alla prover och de sista ämnena har körts aktiverar du avstängningsmetoden i programvaran genom att lägga till ett sista prov i exempellistan och köra vänteformulär. METH. Säkerhetskopiera alla data som förvärvats under exempelkörningarna. Stäng av utrustningen i följande ordning: autosampler värmare, vätetank och, först efter kromatograftemperaturen når 30 °C, lufttanken. Låt heliumtanken bevara vaxkolonnen.
9. Provintegrering av etanoltopp och analys av provkoncentration
Alla värden från 9.3 på beräknades i en Excel-fil som alla ekvationer förifyllda.
- När avstängningsmetoden är klar klickar du på Öppna chromatogram. Öppna mappen som innehåller resultaten. Prover integreras automatiskt i det här programmet.
- I resultaten, se till att rätt toppar har integrerats (etanol toppar mellan 2 och 2,5). När alla prover har bekräftats skriver du ut eller exporterar resultaten.
- Rita topphöjden för etanolstandarderna på ett diagram. Beräkna lutnings-, Y-skärnings- och R2-värdena för etanolstandarderna (R2 bör vara >0,99).
DESSA värden kommer att användas för att bestämma etanolkoncentrationen från provets topphöjd. - För varje prov subtraherar provets topphöjd från Y-avlyssnandet av etanolstandarderna. Dela upp detta värde vid lutningen på etanolstandarderna för att erhålla etanolvärdet för varje prov i GC-injektionsflaskorna.
- För att beräkna etanolkoncentrationen i embryona, beräkna först utspädningsfaktorn för varje prov. Ta volymmåttet som beräknas i steg 2.3 i detta protokoll och dela upp det med volymmåttet plus 500 μL. Detta representerar den 5 M NaCl / proteas cocktail lösning läggas till varje prov under embryobearbetning (steg 5.3 och 5.4).
- Med hjälp av denna provutspädningsfaktor multipliceras med provets etanolvärde för varje prov. Resultaten kommer att vara i mM koncentration. Beräkna referensprover för media genom att multiplicera medieetanolvärdet med utspädningsfaktorn 10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Blodetanolnivåer kan inte bestämmas i tidiga embryonala zebrafiskar, eftersom de saknar ett fullt bildat cirkulationssystem. För att bestämma nivån av etanolkoncentration i zebrafiskembryona mäts etanolnivåerna direkt från homogeniserad embryonal vävnad. För att på ett korrekt sätt mäta embryonala etanolkoncentrationer måste hänsyn tas till embryonala volymer. Embryot (äggula fäst) sitter inuti chorion (äggskal) omgiven av extraembryonic vätska(figur 1). Varje volymmått av embryot måste göras på embryon vid tidpunkten för exponeringen, eftersom embryonal aska volymen kommer att förändras under utvecklingstid som embryot ökar i storlek. Dessutom måste embryot behandlas beaktas liksom den embryonala volymen, eftersom båda dessa faktorer skapar utspädningsfaktorer som används för att beräkna embryonala etanolnivåer.
Eftersom embryot inte är en perfekt sfär, särskilt efter 10 hkf, användes vattenförskjutning för att bedöma embryonal volym. Denna studie använde embryon vid 24 hpf. Mängden embryon både i deras chorion och de som togs bort från deras chorion mättes. Dessa volymer var 1,97 (± 0,4 SD) μL för embryot med extraembryonic vätska och 1,1 (± 0,22 SD) μL enbart för embryot(tabell 1). Denna skillnad mellan embryot med extraembryonic vätska och embryot ensam är volymen av extraembryonic vätska, som omger embryot inuti chorion(figur 1). Denna skillnad är avgörande för att bestämma embryots etanolkoncentration enbart i proverna. Från analysen utgjorde embryot 56 % av embryots volym med extraembryonic vätska inuti chorionen (tabell 1). I takt med att embryot växte ökade den embryonala volymen med tiden, vilket resulterade i en minskning av volymen av den extraembryonala vätskan25. Vid mätning av etanolkoncentrationer från embryon som fortfarande finns kvar i deras chorion måste vattenhalten i både embryot och den extraembryonala vätskan beaktas.
Tidigare publicerat arbete har visat att vattenfraktionen enbart i embryot är 73,6%29. Detta resultat erhölls med hjälp av en kombination av volymmått, elektronspinnresonansspektroskopi och magnetisk resonansmikroskopi. För att bekräfta detta resultat vägdes embryon ensamma före och efter bakning vid 70 °C, som tidigare beskrivits25. Denna process tar bort allt vatten från embryot. Förändringen i vikt representerar mängden vatten i embryot. Från denna analys innehöll en 24 hpf embryo ~ 72% vatten medan en 48 hpf embryo innehöll ~ 76%. Båda dessa värden är extremt lika den 73,6% embryonala vattenvolym som tidigareberäknats 29. Detta tyder på att embryots vattenvolym förändras lite under den tidiga utvecklingen.
Baserat på det publicerade arbetet med hjälp av flera metoder för att beräkna vattenvolymen i embryot användes 73,6 % som embryonal vattenhalt för alla presenterade analyser. Detta resulterade i vatten som omfattade 0,82 μl av 1,1 μl embryonal volym(tabell 1). Från detta beräknades volymen av extraembryonic vätskan som 0,86 μL. Av embryots totala vattenvolym med extraembryonal vätska finns 49 % i embryot och 51 % är i den extra embryonala vätskan(tabell 1).
För gaskromatografianalysen användes endast 24 hpf embryon som fortfarande finns i deras chorion (figur 1). I denna etanolregim behandlades embryon med 1% (171 mM) etanolmediekoncentration från 6–24 hkf, även om olika etanolkoncentrationer och exponeringstidsfönster kan användas beroende på experimentell design. Två grupper om 15 prover (10 embryon per prov) och de medier med vilka de behandlades under 2 olika experimentella dagar(tabell 2)analyserades. Medienivåerna kan variera från experiment till experiment. För att ta hänsyn till detta mättes etanolnivåerna i media 5x per experimentell grupp. I denna analys var medienivåerna 143,6 (± 2,3 SD) mM för grupp 1 och 133,6 (± 2,7 SD) mM för grupp 2. Dessa värden skiljer sig avsevärt med hjälp av ett oparat t-test (p = 0,0002). Embryona med extraembryonal vätska i genomsnitt 63,5 (± 17,1 SD) mM och 53,1 (± 12,6 SD) mM för grupper 1 respektive 2. Koncentrationen skilde sig dock inte signifikant mellan de 2 grupperna embryon med extraembryonic vätska (oparade t-test, p = 0,07). Obehandlade kontrollembryon mättes vid 0 mM. På grund av variationen i medienivåer beräknades ett förhållande mellan koncentrationen av embryonal etanol/medier för varje prov. Grupp 1 hade 44 % av medianetanolnivåerna, medan grupp 2 hade 40 % av medianetanolnivåerna(figur 3 och tabell 2).
Figur 1: En bild av ett embryo vid 24 h postfertilisering (hpf) inuti chorion. Embryot och äggulan omges av den extraembryonala vätskan, alla ligger inuti chorion. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Protokoll för att mäta embryonal volym och bearbeta embryonför analys. A) Tio 24 hpf embryon överförs till en 1,5 ml mikrocentrifugrör märkt med en 250 μL volym. (B)Mikrocentrifugröret med embryon fyllda med vatten (vatten färgas så det är lättare att se vid 250 μL-märket). (C)Allt vatten avlägsnas från röret och vägs. (D)Tio embryon som överförts till ett mikrocentrifugrör på 1,5 ml. Vattnet avlägsnades som i(C)och ersattes med 50 μL proteascocktail. (E)Efter 10 min, 450 μl av 5 M NaCl lades till röret från(D). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Box- och morrhårsområde i förhållandet mellan etanolkoncentration av prover till media. Etanolkoncentrationen för varje grupp delades av genomsnittet av gruppens medieprover. Grupp 1 innehöll 44 % av medienivåerna, medan grupp 2 innehöll 40 %. I båda grupperna, n = 15; 10 embryon per prov. Grupper jämfördes med en enkelriktad ANOVA med en Tukeys post hoc-analys (****p < 0,0001). Morrhår representerar minimum till max. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Embryo och embryo + Extraembryo Vattenvolymer (μL) | ||||||
| Vattena | ||||||
| Total volymb | % av den totala volymen (V) | Embryonal volym (W) | Extraembryonic Volym (X) | % vatten i embryot (Y) | % Vatten i Extraembryonic (Z) | |
| Embryo + Extraembryonic (EE)c | 1,97 ± 0,4 | |||||
| Embryo 24 hpf (E)c | 1,11 ± 0,22 | 56% | 0.82 | 0.86 | 49% | 51% |
| Beräkningar | ||||||
| V (på) Embryo % av total volym = Total volym av E ÷ Total volym av EE | ||||||
| W Embryonal vattenvolym = V × 73,6% | ||||||
| X Extraembryonic vattenvolym = W – Total volym av EE | ||||||
| Y% Vatten i embryo = (W + X)/W × 100 | ||||||
| Z% Vatten i Extraembryonic = 100 – Y | ||||||
| en Embryonal vattenvolym beräknades från Hagedorn m.fl.29. | ||||||
| b Värden redovisas som ± standardavvikelse (SD). | ||||||
| cn = 13; 10 embryon per prov | ||||||
Tabell 1: Beräkning av vattenvolym för embryon med extraembryonic vätska. Volymen beräknades från 13 prover (10 embryon per prov) från 24 hpf embryon med extraembryonal vätska fortfarande i chorion och embryon bort från deras chorion. Värden rapporteras som medelvärdet ± SD.
| EtanolKoncentration av embryon och medier (mM)a | |||
| Grupp 1 | Grupp 2 | Kombinerade | |
| Media (M)b | 143,6 ± 2,3 | 133,6 ± 2,7 | 138,6 ± 5,8 |
| Embryo + Extraembryonic (EE)c | 63,5 ± 17,1 | 53,1 ± 12,6 | 58,3 ± 15,7 |
| Förhållandet mellan etanol - embryo till media (1) | 0,44 ± 0,12 | 0,40 ± 0,09 | 0,42 ± 0,11 |
| Beräkningar | |||
| 1 Förhållandet mellan etanol = EE ÷ M | |||
| en Värden rapporteras som ± SD. | |||
| bn = 5 | |||
| cn = 15; 10 embryon per prov | |||
| d Värden är genomsnittet för grupperna 1 och 2. | |||
Tabell 2: Beräkningar av etanolkoncentration i embryon med extraembryonic vätska och media (mM). Medieprover var direkta åtgärder från media (n = 5 per grupp). Koncentrationen av embryonal etanol beräknades från 15 prover (10 embryon per prov) från 24 hpf-embryon med extraembryonal vätska. Förhållandet mellan embryonas etanolkoncentrationer med extraembryonic vätska till media beräknades. Värden rapporteras som medelvärdet ± SD.
| Beräkning av etanol i embryota,b | |
| Embryo (Y) | Förhållande till media (Z) |
| 32,7 ± 8,8 mMM | 0,24 ± 0,06 |
| Beräkningar | |
| Y Embryonal etanol = 58,3 mM (tabell 2) × 56% (tabell 1) | |
| Z (på) Förhållandet mellan etanol = Y ÷ 138,6 mM (tabell 2) | |
| en Värden är genomsnittet för grupperna 1 och 2. | |
| b Värden rapporteras som ± SD. | |
Tabell 3: Beräkning av etanol i embryot. Embryonal etanolkoncentration beräknades som 56 % av embryots totala etanolkoncentration med extraembryonic vätska. Detta rapporterades sedan som ett förhållande mellan embryo till media. Värden rapporteras som medelvärdet ± SD.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Som utvecklingsmodellsystem är zebrafisk idealisk för att studera miljöfaktorers inverkan på utvecklingen. De producerar ett stort antal externt befruktade embryon, vilket möjliggör exakt timing och dosering paradigm i etanol studier. Detta, i kombination med levande bildbehandling kapacitet och den genetiska och utvecklingsmässiga bevarande med människor, gör zebrafisk ett kraftfullt modellsystem för teratologi studier. Beskrivs är ett protokoll för att mäta embryonala etanolkoncentrationer för att utveckla zebrafiskembryon med hjälp av gaskromatografi för huvudutrymmen.
Det är avgörande för att fastställa embryonal etanolkoncentration för att förstå etanolens inverkan på det växande embryot. I gnagare modeller, blod etanol koncentrationer korrelerar till vävnadskoncentrationer26. Det är dock inte möjligt att bedöma blodetanolnivåer i tidig embryonal utveckling i en zebrafisk. Head space gas kromatografi har använts för att mäta etanolnivåer i olika experimentella paradigm, inklusive zebrafisk25,30,31,32,33,34,35. Detta protokoll kan dock användas för att mäta många olika miljöfaktorer, även om volatiliteten i dessa olika faktorer måste vara tillräckligt hög för att mäta kvantitativt och en gaskromatografkolumn måste väljas baserat på polariteten hos föreningarna i fråga. Dessutom är zebrafisk bäst lämpad för att studera effekterna av vattenlösliga faktorer, eftersom exponering för hydrofoba faktorer är extremt svårt att analysera i fisk.
Detta protokoll kommer att göra det möjligt för forskare att direkt bedöma etanolkoncentrationer i zebrafiskembryon. Flera faktorer måste dock hanteras för att säkerställa korrekta mätningar av embryonala etanolkoncentrationer. Eftersom etanolnivåerna i de totala embryonala vävnaderna mättes måste embryonal volym beaktas. Efter 10 hpf börjar embryot somitogenes (somitbildande) och är inte längre en sfär (figur 1). För att bedöma embryonal volym användes vattenförskjutning på 10 sammandragna embryon per prov. Varje prov bestod av 10 embryon av två skäl: för det första att minska fel från rörledningar små volymer, och för det andra, att i genomsnitt ut små fluktuationer i embryovolymerna. Vid mätning av embryonal volym är det viktigt att beakta precisionen hos rörledningar och vägning. Även användningen av 10 embryon per prov är på den lägre gränsen för precision för både kärnor och den skala som används för att väga embryona. Med den utrustning som finns tillgänglig skulle användningen av färre än 10 embryon ha påverkat analyserna. Detta begränsar inte forskare från att använda färre embryon per prov så länge utrustningprecision beaktas.
Embryonal volym är en faktor som påverkar provanalys. En andra viktig faktor är embryonal bearbetningshastighet, eftersom etanol är flyktig. Dessutom, etanol snabbt jämvikti flera djurstudier25,36,37. Vårt tvättprotokoll är utformat för att snabbt ta bort alla etanolsom håller sig till chorions yttre yta. I denna studie påverkar detta tvättprotokoll inte de embryonala etanolnivåerna, även om längre eller flera tvättar kunde påverka embryonala etanolkoncentrationerna 25,38. En tredje faktor att ta hänsyn till är dock utspädning en av embryonala volymen under bearbetningen. Detta protokoll använder en proteas cocktail för att försämra chorion samt 5 M NaCl att denaturealla proteiner, inklusive alkoholbearbetning enzymer.
Slutligen har en rad analyser och rapporteringsmetoder beskrivits i en mängd olika zebrafiskstudier. På grund av variation inom olika prover av en studie eller jämföra olika studier är korrekt rapportering av etanolkoncentration kritisk25,38. Metoder som använder indirekta (vanligtvis enzymatiska åtgärder) bygger på analys av en sekundär metabolit. I så fall kan graden av enzymatisk aktivitet variera och hindra en exakt analys av etanolkoncentrationen. Denna metod mäter direkt etanolnivåer, och etanolkoncentrationer rapporteras som ett förhållande mellan embryo- och mediekoncentrationer. Våra resultat är i linje med en växande konsensus om en 24 hpf embryo som innehåller ~ 30% av mediekoncentrationer (Tabell 3)25,38,39,40. Överraskande nog är denna 30% embryonala etanol koncentration oberoende av mediekoncentration, och det är inte väl förstått vad som skapar denna jämvikt25,38. Embryon äldre än 24 hpf visar minskningar i etanolkoncentrationer, med 48 hpf embryon som innehåller nästan hälften av etanolhalten i en 24 hpf embryo25. Våra resultat avgör dock inte jämvikten etanolvatten. Med tanke på den hastighet med vilken etanoljämktal, liksom volatiliteten i etanol, är det otroligt svårt att bedöma förändringar vattenvolym i själva embryot på grund av etanolexponering. Att försöka mäta volymen av ett etanolbehandlat embryoprov med hjälp av vattenförskjutning kommer att leda till förlust av etanol från embryot under mätningen. Med hjälp av mer exakta mikroskopi- och spektroskopimetoder än de som beskrivs ovan kan det vara möjligt att bestämma etanolvattenjämvikten i ett embryo genom att direkt mäta båda samtidigt.
Sammantaget är det protokoll som beskrivs här ett kraftfullt verktyg för att bedöma embryonala etanolkoncentrationer för att utveckla zebrafiskembryon. Denna information är avgörande för att standardisera FASD-studier med zebrafisk. Förmågan att exakt kontrollera etanolbehandlingsparadigm och direkt kvantifiera embryonala etanolkoncentrationer stärker zebrafiskmodellens funktionalitet för humana FASD-studier. I slutändan kommer detta arbete avsevärt förbättra vår förståelse av FASD.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Den forskning som presenteras i denna artikel stöddes av tidigare bidrag från National Institutes of Health / National Institute of Dental and Craniofacial Research (NIH/NIDCR) R01DE020884 till J.K.E. och National Institutes of Health/National Institute on Alcohol Abuse and Alcoholism (NIH/NIAAA) F32AA021320 to C.B.L. and by the current grant from National Institutes of Health/National Institute on Alcohol Abuse (NIH/NIAAA) R00AA023560 to C.B.L. Vi tackar Rueben Gonzales för att de tillhandahåller och hjälper till med analys av gaskromatograf. Vi tackar Tiahna Ontiveros och Dr Gina Nobles skriva hjälp.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Air | Provided by contract to the university | ||
| Analytical Balance | VWR | 10204-962 | |
| AutoSampler, CP-8400 | Varian | Gas Chromatograph Autosampler | |
| Calcium Chloride | VWR | 97062-590 | |
| Ethanol | Decon Labs | 2701 | |
| Gas chromatograph vial with polytetrafluoroethylene/silicone septum and plastic cap 2 mL | Agilent | 8010-0198 | Can reuse the vials after cleaning, but not the caps/septa |
| Gas Chromatograph, CP-3800 | Varian | ||
| Helium | Provided by contract to the university | ||
| HP Innowax capillary column | Agilent | 19095N-123I | 30 m x 0.53 mm x 1.0 μm film thick |
| Hyrdogen | Provided by contract to the university | ||
| Magnesium Sulfate (Heptahydrate) | Fisher Scientific | M63-500 | |
| Microcentrifuge tube 1.5 mL | Fisher Scientific | 2682002 | |
| Micropipette tips 10 μL | Fisher Scientific | 13611106 | |
| Micropipette tips 1000 μL | Fisher Scientific | 13611127 | |
| Micropipette tips 200 μL | Fisher Scientific | 13611112 | |
| Petri dishes 100 mm | Fisher Scientific | FB012924 | |
| Pipetman L p1000L Micropipette | Gilson | FA10006M | |
| Pipetman L p200L Micropipette | Gilson | FA10005M | |
| Pipetman L p2L Micropipette | Gilson | FA10001M | |
| Polytetrafluoroethylene/silicone septum and plastic cap | Agilent | 5190-7021 | Replacement caps/septa for gas chromatograph vials |
| Potassium Chloride | Fisher Scientific | P217-500 | |
| Potassium Phosphate (Dibasic) | VWR | BDH9266-500G | |
| Pronase | VWR | 97062-916 | |
| Silica Beads .5 mm | Biospec Products | 11079105z | |
| Silica Beads 1.0 mm | Biospec Products | 11079110z | |
| Sodium Bicarbonate | VWR | BDH9280-500G | |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | S271-500 | |
| Sodium Phosphate (Dibasic) | Fisher Scientific | S374-500 | |
| Solid-phase microextraction fiber assembly Carboxen/Polydimethylsiloxane | Millipore Sigma | 57343-U | Replacement fibers |
| Star Chromatography Workstation | Varian | Chromatography software | |
| Thermogreen Low Bleed (LB-2) Septa | Millipore Sigma | 23154 | Replacement inlet septa |
References
- Elliott, E. J., Payne, J., Morris, A., Haan, E., Bower, C. Fetal alcohol syndrome: a prospective national surveillance study. Archive of Diseases in Childhood. 93 (9), 732-737 (2008).
- Cudd, T. A. Animal model systems for the study of alcohol teratology. Experimental Biology and Medicine. 230 (6), 389-393 (2005).
- Williams, J. F., Smith, V. C. Committee on Substance Abuse. Fetal Alcohol Spectrum Disorders. Pediatrics. 136 (5), 1395-1406 (2015).
- Patten, A. R., Fontaine, C. J., Christie, B. R. A comparison of the different animal models of fetal alcohol spectrum disorders and their use in studying complex behaviors. Frontiers in Pediatrics. 2, 93 (2014).
- Petrelli, B., Weinberg, J., Hicks, G. G. Effects of prenatal alcohol exposure (PAE): insights into FASD using mouse models of PAE. Biochemistry and Cell Biology. 96 (2), 131-147 (2018).
- Mayfield, J., Arends, M. A., Harris, R. A., Blednov, Y. A. Genes and Alcohol Consumption: Studies with Mutant Mice. International Review Neurobiology. 126, 293-355 (2016).
- Marquardt, K., Brigman, J. L. The impact of prenatal alcohol exposure on social, cognitive and affective behavioral domains: Insights from rodent models. Alcohol. 51, 1-15 (2016).
- Sulik, K. K. Genesis of alcohol-induced craniofacial dysmorphism. Experimental Biology and Medicine. 230 (6), 366-375 (2005).
- Lipinski, R. J., et al. Ethanol-induced face-brain dysmorphology patterns are correlative and exposure-stage dependent. PLoS One. 7 (8), 43067 (2012).
- Eberhart, J. K., Parnell, S. The genetics of fetal alcohol spectrum disorders. Alcoholism: Clinical and Experimental Research. 40 (6), 1154-1165 (2016).
- Becker, H. C., Diaz-Granados, J. L., Randall, C. L. Teratogenic actions of ethanol in the mouse: a minireview. Pharmacology, Biochemistry and Behavior. 55 (4), 501-513 (1996).
- Ahlgren, S. C., Thakur, V., Bronner-Fraser, M. Sonic hedgehog rescues cranial neural crest from cell death induced by ethanol exposure. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (16), 10476-10481 (2002).
- Loucks, E. J., Ahlgren, S. C. Deciphering the role of Shh signaling in axial defects produced by ethanol exposure. Birth Defects Research Part A: Clinical and Molecular Teratology. 85 (6), 556-567 (2009).
- Hong, M., Krauss, R. S. Cdon mutation and fetal ethanol exposure synergize to produce midline signaling defects and holoprosencephaly spectrum disorders in mice. PLoSGenetics. 8 (10), 1002999 (2012).
- Aoto, K., Shikata, Y., Higashiyama, D., Shiota, K., Motoyama, J. Fetal ethanol exposure activates protein kinase A and impairs Shh expression in prechordal mesendoderm cells in the pathogenesis of holoprosencephaly. Birth Defects Research Part A: Clinical and Molecular Teratology. 82 (4), 224-231 (2008).
- Deltour, L., Ang, H. L., Duester, G. Ethanol inhibition of retinoic acid synthesis as a potential mechanism for fetal alcohol syndrome. The FASEB Journal. 10 (9), 1050-1057 (1996).
- Wentzel, P., Eriksson, U. J. Ethanol-induced fetal dysmorphogenesis in the mouse is diminished by high antioxidative capacity of the mother. Toxicological Sciences. 92 (2), 416-422 (2006).
- Karacay, B., Mahoney, J., Plume, J., Bonthius, D. J. Genetic absence of nNOS worsens fetal alcohol effects in mice. II: microencephaly and neuronal losses. Alcoholism: Clinical and Experimental Research. 39 (2), 221-231 (2015).
- Bonthius, D. J. Jr, Winters, Z., Karacay, B., Bousquet, S. L., Bonthius, D. J. Importance of genetics in fetal alcohol effects: null mutation of the nNOS gene worsens alcohol-induced cerebellar neuronal losses and behavioral deficits. Neurotoxicology. 46, 60-72 (2015).
- Bonthius, D. J., et al. Deficiency of neuronal nitric oxide synthase (nNOS) worsens alcohol-induced microencephaly and neuronal loss in developing mice. Brain Research. Developmental Brain Research. 138 (1), 45-59 (2002).
- Langevin, F., Crossan, G. P., Rosado, I. V., Arends, M. J., Patel, K. J. Fancd2 counteracts the toxic effects of naturally produced aldehydes in mice. Nature. 475 (7354), 53-58 (2011).
- Lovely, C. B., Fernandes, Y., Eberhart, J. K. Fishing for Fetal Alcohol Spectrum Disorders: Zebrafish as a Model for Ethanol Teratogenesis. Zebrafish. 13 (5), 391-398 (2016).
- Fernandes, Y., Buckley, D. M., Eberhart, J. K. Diving into the world of alcohol teratogenesis: a review of zebrafish models of fetal alcohol spectrum disorder. Biochemistry and Cell Biology. 96 (2), 88-97 (2018).
- McCarthy, N., et al. Pdgfra protects against ethanol-induced craniofacial defects in a zebrafish model of FASD. Development. 140 (15), 3254-3265 (2013).
- Lovely, C. B., Nobles, R. D., Eberhart, J. K. Developmental age strengthens barriers to ethanol accumulation in zebrafish. Alcohol. 48 (6), 595-602 (2014).
- Harris, R. A., Trudell, J. R., Mihic, S. J. Ethanol's molecular targets. Science Signaling. 1 (28), (2008).
- Westerfield, M. The Zebrafish Book: A guide for the laboratory use of zebrafish Danio (Brachydanio) rerio. , University of Oregon Press. Eugene, OR. (1993).
- Lawson, N. D., Weinstein, B. M. In vivo imaging of embryonic vascular development using transgenic zebrafish. Developmental Biology. 248 (2), 307-318 (2002).
- Hagedorn, M., Kleinhans, F. W., Artemov, D., Pilatus, U. Water Distribution and permeability of zebrafish embryos, Brachydanio rerio. Journal of Experimental Zoology. 278 (6), 356-371 (1997).
- Lippi, G., et al. The alcohol used for cleansing the venipuncture site does not jeopardize blood and plasma alcohol measurement with head-space gas chromatography and an enzymatic assay. Biochemia Medica. 27 (2), 398-403 (2017).
- Poklis, J. L., Wolf, C. E., Peace, M. R. Ethanol concentration in 56 refillable electronic cigarettes liquid formulations determined by headspace gas chromatography with flame ionization detector (HS-GC-FID). Drug Testing and Analysis. 9 (10), 1637-1640 (2017).
- Heit, C., et al. Quantification of Neural Ethanol and Acetaldehyde Using Headspace GC-MS. Alcoholism: Clinical and Experimental Research. 40 (9), 1825-1831 (2016).
- Chun, H. J., Poklis, J. L., Poklis, A., Wolf, C. E. Development and Validation of a Method for Alcohol Analysis in Brain Tissue by Headspace Gas Chromatography with Flame Ionization Detector. Journal of Analytical Toxicology. 40 (8), 653-658 (2016).
- Schlatter, J., Chiadmi, F., Gandon, V., Chariot, P. Simultaneous determination of methanol, acetaldehyde, acetone, and ethanol in human blood by gas chromatography with flame ionization detection. Human and Experimental Toxicology. 33 (1), 74-80 (2013).
- Schier, C. J., Mangieri, R. A., Dilly, G. A., Gonzales, R. A. Microdialysis of ethanol during operant ethanol self-administration and ethanol determination by gas chromatography. Journal of Visualized Experiments. (67), e4142 (2012).
- Adalsteinsson, E., Sullivan, E. V., Mayer, D., Pfefferbaum, A. In vivo quantification of ethanol kinetics in rat brain. Neuropsychopharmacology. 31 (12), 2683-2691 (2006).
- Quertemont, E., Green, H. L., Grant, K. A. Brain ethanol concentrations and ethanol discrimination in rats: effects of dose and time. Psychopharmacology. 168 (3), 262-270 (2003).
- Flentke, G. R., Klinger, R. H., Tanguay, R. L., Carvan, M. J., Smith, S. M. An evolutionarily-conserved mechanism of calcium-dependent neurotoxicity. Alcoholism: Clinical and Experimental Research. 38 (5), 1255-1265 (2014).
- Reimers, M. J., Flockton, A. R., Tanguay, R. L. Ethanol- and acetaldehyde-mediated developmental toxicity in zebrafish. Neurotoxicology and Teratology. 26 (6), 769-781 (2004).
- Zhang, C., Ojiaku, P., Cole, G. J. Forebrain and hindbrain development in zebrafish is sensitive to ethanol exposure involving agrin, Fgf, and sonic hedgehog function. Birth Defects Research Part A: Clinical and Molecular Teratology. 97 (1), 8-27 (2013).
