Summary
Эта работа описывает протокол для количественной оценки уровня этанола в эмбрионе зебры с использованием хроматографии головного космического газа от надлежащих методов воздействия на обработку эмбрионов и анализ этанола.
Abstract
Расстройства спектра фетального алкоголя (FASD) описывают весьма переменный континуум этинол-индуцированных дефектов развития, включая лицевой дисморфологии и неврологические нарушения. При сложной патологии, FASD затрагивает примерно 1 из 100 детей, родившихся в Соединенных Штатах каждый год. Из-за весьма изменчивого характера FASD, модели животных оказались критически важными в нашем нынешнем механистическом понимании дефектов развития, вызванных этанолом. Все большее число лабораторий сосредоточилось на использовании зебры для изучения дефектов развития, вызванных этанолом. Зебрафиш производит большое количество внешне оплодотворенных, генетически высохлых, полупрозрачных эмбрионов. Это позволяет исследователям точно контролировать сроки и дозировку воздействия этанола в нескольких генетических контекстах и количественно ехать воздействие воздействия эмбрионального этанола с помощью живых методов визуализации. Это, в сочетании с высокой степенью сохранения генетики и развития с людьми, оказалось, зебрафиш, чтобы быть мощной моделью, в которой для изучения механистической основы этанола тератогенности. Тем не менее, режимы воздействия этанола различаются между различными исследованиями зебры, что смущает интерпретацию данных зебры в этих исследованиях. Вот протокол для количественной оценки концентрации этанола в эмбрионах зебры с помощью хроматографии головного космического газа.
Introduction
Расстройства спектра фетального алкоголя (FASD) описывает широкий спектр неврологических нарушений и черепно-мозговых дисморфологий, связанных с воздействием эмбрионального этанола1. Несколько факторов, в том числе сроки и дозировка воздействия этанола и генетического фона, способствуют изменению FASD2,3. У людей, сложные отношения этих переменных делает изучение и понимание этиологии FASD сложной задачей. Модели животных доказали свою решающее значение в развитии нашего понимания механистической основы этанола тератогенности. Широкий спектр животных модели систем был использован для изучения нескольких аспектов FASD и результаты были удивительно в соответствии с тем, что находится в воздействии на людей4. Системы моделей грызунов используются для изучения многих аспектов FASD, с мышами, наиболее распространенными5,6,7. Большая часть этой работы была сосредоточена на дефектах развития раннего воздействия этанола8, хотя позднее воздействие этанола было показано, что причиной аномалий развития, а9. Кроме того, генетические возможности мышей в значительной степени способствовали нашей способности зондировать генетические основы FASD10,11. Эти исследования на мышах убедительно свидетельствуют о том, что существуют ген-этанол взаимодействия с звуковым пути ежа, ретиноиновая кислота сигнализации, Супероксид дисмутазы, оксида азота синтазы I, Aldh2 и Fancd28,10,11,12,13,14,15,16,17,18, 19,20,21. Эти исследования показывают, что модели животных имеют решающее значение для продвижения нашего понимания FASD и ее основных механизмов.
Зебрафиш стала мощной модельной системой для изучения многих аспектов этанола тератогенеза22,23. Из-за их внешнего оплодотворения, высокой плодовитости, генетической уступчивости и возможностей живой визуализации, зебра-рыбы идеально подходят для изучения таких факторов, как время, дозировка и генетика этанола тератогенеза. Этанол может быть введен точно поставил эмбрионов и эмбрионы могут быть изображены для изучения прямого воздействия этанола во время процессов развития. Эта работа может быть связана непосредственно с людьми, потому что генетические программы развития очень сохраняются между зебрафиш и людей и поэтому может помочь руководство FASD человеческих исследований24. В то время как зебрафиш были использованы для изучения этанола тератогенеза, отсутствие консенсуса в отчетности эмбриональных концентраций этанола делает сравнение с людьми трудно25. В системах млекопитающих уровень алкоголя в крови напрямую коррелирует с уровнем этанола в тканях26. Многие исследования зебры лечат эмбрионы до полного формирования их кровеносной системы. При отсутствии материнской выборки для изучения, процесс оценки концентрации этанола необходим для количественной оценки уровня этанола в эмбрионе. Здесь мы описываем процесс количественной оценки концентраций этанола в развивающемся эмбрионе зебры с помощью хроматографии головного космического газа.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все эмбрионы зебры, используемые в этой процедуре, были подняты и выведены в соответствии с установленными протоколами IACUC27. Эти протоколы были одобрены Техасским университетом в Остине и Университетом Луисвилла.
ПРИМЕЧАНИЕ: линия зебры Tg (fli1:EGFP)y1 была использована в этом исследовании28. Вся вода, используемая в этой процедуре, является стерильной водой обратного осмоса. Все статистические анализы проводились с использованием Graphpad Prism v8.2.1.
1. Создание эмбриональных носителей
- Чтобы сделать 20x запас эмбриона средств массовой информации, растворить 17,5 г NaCl, 0,75 г KCl, 2,9 г CaCl2, 0,41 г K2HPO4, 0,142 г NA2HPO4, и 4,9 г MgSO47H2O в 1 л воды. Игнорировать белый осадок, который формируется; это не повлияет на средства массовой информации. Фильтр стерилизовать фондовый раствор и хранить при 4 градусах Цельсия.
- Для создания рабочего решения для эмбриона, растворить 1,2 г NaHCO3 в 1 l из 20x эмбриона медиа фонда и добавить 19 л воды. Поддерживайте рабочий эмбриональный медиа-раствор при 28 градусах Цельсия.
2. Измерение эмбрионального объема с помощью водоизмещения
ПРИМЕЧАНИЕ: В этом протоколе используются 24 h постфертильизации (hpf) эмбрионов(рисунок 1). Эмбрионы, используемые в измерениях объема, не используются при анализе этанола.
- Поместите 10 эмбрионов и экстраэмбриона в микроцентрифугную трубку объемом 1,5 мл, отмеченную объемом 250 л(рисунок 2А). Добавьте воду к линии заполнения 250 л (см. образец с окрашенной водой на рисунке 2B).
- Повторите шаг 2.1, чтобы создать сосуды для эмбрионов, которые имели свои хоры удалены.
- Чтобы удалить хорион, поместите эмбрионы в их хории в 100 мм Петри блюдо с 2 мг /мл протеазы коктейль в эмбриона сми при комнатной температуре (RT) в течение 10 минут. Каждые несколько минут, осторожно закружить эмбрионы, чтобы сломать хорион.
- После того, как все эмбрионы свободны от их хорий, удалить дехорионированных эмбрионов из протеаза коктейль / эмбрион сми и место в новом 100 мм Петри блюдо со свежими эмбриона средств для мытья эмбрионов. Повторите этот шаг мытья 1 больше времени (в общей сложности 2 моет). Перенесите эмбрионы в свежее 100-мм чашку Петри.
- Используя самый маленький кончик возможно и не повреждая эмбрионы, тщательно удалить всю жидкость из вокруг эмбрионов с помощью p200 micropipettor(Рисунок 2C) и взвесить воду с шкалой с точностью 0,1 мг. Чтобы определить объем пробы из 10 эмбрионов, вычесть вес/объем воды (1 мл воды и 1 г воды.) удалены из 250 qL. Чтобы определить объем одного эмбриона, разделите разницу между 250 зЛ и весом воды, удаленной на 10.
3. Лечение эмбрионов этанолом
- Соберите эмбрионы из спаривающихся резервуаров и поместите в стандартную 100-мм чашку Петри. Отсчитайте не более 100 эмбрионов на одно блюдо Петри и инкубировать при 28,5 градусах Цельсия.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если хор должен быть удален (шаг 2.2), он должен быть удален перед добавлением этанола. - На 6 л.с., добавить до 100 эмбрионов к новому стандарту 100 мм Петри блюдо либо с эмбрионом сми или эмбриона сми no 1% этанола (v/v). Обложка, но НЕ печать чашку Петри. Поместите эмбрионы в инкубатор низкой температуры, установленный на уровне 28,5 градусов по Цельсию на 18 ч, или до тех пор, пока эмбрионы не достигнут точки времени развития в 24 л.с.
4. Подготовка рабочего процесса перед обработкой эмбрионов для хроматографии головного космического газа
- Сделать раствор 5 M NaCl в воде (450 л будет необходимо на образец трубки) для денатурации всех белков и предотвращения метаболизма этанола. Сделать протеазный коктейль(Таблица материалов) в концентрации 2 мг/мл в эмбрионе сми.
- Этикетка 1,5 мл микроцентрифуг трубки и 2 мл газа хроматограф флакон для каждого образца. Этикетка дополнительных 2 мл газа хроматограф флаконы для этанола стандартов, описанных ниже, а также воздух, вода, и 5 M NaCl / протеазы коктейль заготовки.
- Навлажь три микропипептатора p200, два набора до 50 зл, а третий - до 200 л; p1000 micropipettor установлен на 450 qL и p2 микропипеттер установлен на 2 Зл. Для стеклянных пипетки, используемые для передачи эмбрионов из посуды Петри в 1,5 мл микроцентрифуговых труб, быстро передать кончик пипетки через пламя, чтобы сгладить края, чтобы не повредить эмбрионы при втягивании их в пипетку.
5. Обработка эмбрионов для хроматографии головного космического газа
ПРИМЕЧАНИЕ: Оба эмбриона в их хорионах и тех, ранее удалены из их хорионки рассматриваются одинаково для последовательности в расчете факторов разбавления.
- Используя два микропипетиров p200, установленных до 50 зл,нарисуйте 50 злитровый раствор коктейля протеазы в один и нарисуйте 50 л воды во второй.
- Используя стеклянный пипетка и микропипеттор, быстро поместите 10 эмбрионов (от шага 3.2) в микроцентрифуге мощностью 1,5 мл и закройте крышку (как описано на рисунке 2А). Повторите для всех образцов, которые будут проверены, контроля, и этанол лечение эмбрионов.
- Используя p200 micropipettor установлен на 200 Зл, быстро открыть крышку и удалить все остаточные эмбриона средств (как описано на рисунке 2C). Быстро поместите пипетку, содержащую 50 кл. воды в трубку и быстро, но осторожно (чтобы не повредить эмбрионы) добавить, а затем удалить воду. Быстро добавьте 50 зл и стекают из ожидающего пипетки и закройте крышку трубки(рисунок 2D).
ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните этот процесс по одному образцу за раз. - Пусть образец сидеть на RT в течение 10 минут, чтобы протеазы коктейль ухудшить хорион. Затем быстро добавьте 450 л 5 M NaCl и закройте крышку трубки(рисунок 2E). Вортекс образцы в течение 10 мин. Чтобы ускорить процесс, навяжните микшер для вихря несколько образцов в то же время.
ПРИМЕЧАНИЕ: Добавьте небольшое количество (100 евро) смеси из биса кремнезема (2 размера, 0,5 мм и 1 мм бис) в любую трубку с эмбрионами старше 24 л.с. В старых эмбрионах, notochord останется нетронутым независимо от того, как долго они однородны. - После гомогенизации в течение 10 мин, быстро удалить 2 Зл гомогенизированных эмбрионов супернатант и добавить в газ хроматограф флакон. Быстро запечатать флакон с крышкой политетрафторотилена.
6. Подготовка стандартов на средства массовой информации и этанола
- Чтобы подготовить медиастандарты, разбавьте средства массовой информации в 10 раз с 5 M NaCl / протеазы коктейль решение. Добавьте 2 злитролога каждого образца в газовый хроматограф флакон и запечатайте с помощью крышки политетрафтометилена.
- Для подготовки стандартов этанола создайте серийное разбавление 100% этанола в 5 M NaCl/протеазном коктейльном растворе до следующих концентраций: 0.3125, 0.625, 1.25, 2.5, 5, 10, 20 и 40 mM. Добавьте 2 злитролога каждого стандарта в газовый хроматограф флакон и уплотнение с крышкой политетрафтометилена.
7. Подготовка головного космического газа хроматографа
ПРИМЕЧАНИЕ: Эта установка и протокол, возможно, должны быть изменены в зависимости от используемого газового хроматографа. Хроматография головного космического газа используется для количественной оценки уровня этанола, а не для разделения.
- Установите обогреватель для автосэмпера до 58 градусов по Цельсию и включите. Разрешить нагреватель достичь 58 градусов по Цельсию, и включить воздуха и водорода газовых линий питания газового хроматографа (для ионизации пламени используется для количественной оценки этанола).
ПРИМЕЧАНИЕ: Пси должны быть установлены должным образом работать хроматограф в соответствии со спецификациями производителя. Убедитесь, что линия гелия на и установить на надлежащее пси. - Для перегородки, убедитесь, что количество вводимых образцов не является 100. Для инъекционного волокна, убедитесь, что количество вводимых образцов не является йgt;500.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если либо более количество инъекций, они должны быть изменены перед запуском тестовых образцов. - Включите программное обеспечение для анализа и убедитесь, что рабочая станция настроена должным образом. Храните все данные в соответствии со стандартами лаборатории/департамента. Создайте новый список образцов для выполнения образцов.
- Инициировать метод запуска и ждать детектор ионизации пламени, чтобы стабилизироваться перед запуском образцов. После стабильной, запустить метод запуска программного обеспечения для очистки волокна.
8. Выборочные измерения с использованием хроматографии головного космического газа
- После завершения метода запуска создайте 1 новую строку на образец в списке выборок. Из меню методов в программном обеспечении анализа, нагрузка 436 Текущий spme этанол 2013 3min поглощают 2_5min RG перспективе. METH для каждого образца в списке выборки.
- Заполните список образцов, начиная с воздуха, воды, 5 M NaCl / протеазы коктейль заготовки. Затем введите стандарты в порядке, от 0,3125 до 40 мМ. Следуйте стандартам со вторым раундом воздуха, воды и 5 M NaCl / протеазы коктейль заготовки.
- Введите все гомогенизированные образцы супернатанта эмбриона для тестирования, от самой низкой до самой высокой прогнозируемой концентрации этанола. Завершите, введя третий и заключительный раунд воздуха, воды, и 5 M NaCl / протеазы коктейль заготовки.
- Добавьте газовые флаконы хроматографа к автопроберу в том порядке, в котором были введены образцы. Разрешить образцы для нагрева в течение 10-15 мин. Начало образца работает в программном обеспечении.
- После того, как все образцы и окончательные заготовки заработают, активируйте метод выключения в программном обеспечении, добавив окончательный образец в список образцов и запустив в режиме ожидания. METH. Резервное копирование всех данных, полученных во время пробных запусков. Выключите оборудование в следующем порядке: автосизер нагреватель, водородный бак и, только после того, как температура хроматографа достигнет 30 градусов по Цельсию, воздушный бак. Оставьте гелиевый бак, чтобы сохранить восковую колонку.
9. Выборочная пиковая интеграция этанола и анализ концентрации выборки
ПРИМЕЧАНИЕ: Все значения от 9.3 на были рассчитаны в файле Excel, что все уравнения предварительно заполнены.
- Как только метод завершения работы будет завершен, нажмите на Open chromatogram. Откройте папку, содержащую результаты. Образцы автоматически интегрируются в эту программу.
- В результатах убедитесь, что правильные пики были интегрированы (этанол пики между 2 и 2,5). После того, как все образцы были подтверждены, распечатать или экспортировать результаты.
- Участок пиковой высоты этанола стандартов на графике. Рассчитайте наклон, Y перехвата и R2 значения для стандартов этанола (R2 должно быть 0,99).
ПРИМЕЧАНИЕ: Эти значения будут использоваться для определения концентрации этанола с пиковой высоты образца. - Для каждого образца вычесть пиковую высоту образца из перехвата Y стандартов этанола. Разделите это значение по склону стандартов этанола для получения значения этанола для каждого образца во флаконах GC.
- Чтобы вычислить концентрацию этанола в эмбрионах, сначала вычислите коэффициент разбавления для каждого образца. Возьмите показатель объема, рассчитанный в шаге 2.3 этого протокола, и разделите его на показатель объема плюс 500 кл. Это представляет собой 5 M NaCl / протеазы коктейль решение добавил к каждому образцу во время обработки эмбриона (шаги 5,3 и 5,4).
- Используя этот фактор разбавления образца, умножьте на значение этанола образца для каждого образца. Результаты будут в концентрации ММ. Рассчитайте образцы ссылок на средства массовой информации, умновая значение этанола на коэффициент разбавления в 10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Уровень этанола в крови не может быть определен в ранних эмбриональных зебры, потому что они не имеют полностью сформированной кровеносной системы. Для определения уровня концентрации этанола в эмбрионах зебры, уровни этанола измеряются непосредственно из гомогенизированной эмбриональной ткани. Для правильного измерения концентрации эмбрионального этанола необходимо учитывать эмбриональный объем. Эмбрион (желток прилагается) сидит внутри хориона (яичная скорлупа) в окружении экстраэмбриональной жидкости(рисунок 1). Любой объем эмбриона должен быть сделан на эмбрионах во время воздействия, потому что эмбриональный объем будет меняться в течение времени развития, как эмбрион увеличивается в размерах. Кроме того, необходимо учитывать то, как обрабатывается эмбрион, а также эмбриональный объем, поскольку оба этих элемента создают факторы разбавления, используемые для расчета уровня эмбрионального этанола.
Поскольку эмбрион не является идеальной сферой, особенно после 10 л.с., водоизмещение было использовано для оценки эмбрионального объема. В этом исследовании использовались эмбрионы на уровне 24 л.с. Измерялся объем эмбрионов как в хорионе, так и в тех, которые были удалены из хориона. Эти объемы составляли 1,97 (0,4 SD) qL для эмбриона с экстраэмбриональной жидкостью, и 1,1 (0,22 SD) qL только для эмбриона(таблица 1). Эта разница между эмбрионом с экстраэмбриональной жидкостью и эмбрионом только объем экстраэмбриональной жидкости, которая окружает эмбрион внутри хориона(рисунок 1). Эта разница имеет решающее значение в определении концентрации этанола эмбриона только в образцах. Из анализа, эмбрион составил 56% от общего объема эмбриона с экстраэмбриональной жидкости внутри хориона(таблица 1). По мере роста эмбриона эмбриональный объем увеличивался с течением времени, что приводило к уменьшению объема экстраэмбриональной жидкости25. При измерении концентрации этанола из эмбрионов, все еще наивных, необходимо принимать во внимание содержание воды как в эмбрионе, так и в экстраэмбриональной жидкости.
Ранее опубликованная работа показала, что фракция воды только в эмбрионе составляет 73,6%29. Этот результат был получен с помощью комбинации показателей объема, электронной спин-резонансной спектроскопии и магнитно-резонансной микроскопии. Чтобы подтвердить этот результат, эмбрионы были взвешены в одиночку до и после выпечки при 70 градусах Цельсия, как ранее описано25. Этот процесс удаляет всю воду из эмбриона. Изменение веса представляет собой количество воды в эмбрионе. Из этого анализа, 24 л.с. эмбриона, содержащий 72% воды в то время как 48 л.с. эмбриона, содержащиеся 76%. Оба эти значения чрезвычайно похожи на 73,6% эмбрионального объема воды, ранее рассчитанные29. Это говорит о том, что объем воды эмбриона мало изменяется на протяжении всего раннего развития.
На основе опубликованной работы с использованием нескольких подходов для расчета объема воды в эмбрионе, 73,6% было использовано в качестве эмбрионального содержания воды для всех представленных анализов. Это привело к тому, что вода составила 0,82 л от 1,1 л эмбрионального объема(таблица 1). Из этого, объем экстраэмбриональной жидкости был рассчитан как 0,86 л. Из общего объема воды эмбриона с экстраэмбриональной жидкостью, 49% содержится в эмбрионе и 51% в экстраэмбриональной жидкости(таблица 1).
Для анализа газовой хроматографии было использовано только 24 зародыша, которые все еще находятся в хорионе(рисунок 1). В этом режиме этанола, эмбрионы были обработаны с 1% (171 мм) концентрации этанола средств массовой информации от 6-24 л.с., хотя различные концентрации этанола и время экспозиции окна могут быть использованы в зависимости от экспериментального дизайна. Были проанализированы две группы по 15 образцов (10 эмбрионов на образец) и средства массовой информации, с помощью которых они лечились в течение 2 различных экспериментальных дней(таблица 2). Уровни мультимедиа могут варьироваться от эксперимента к эксперименту. Для учета этого уровни этанола в средствах массовой информации были измерены в 5 раз на экспериментальную группу. В этом анализе уровни носителей составляли 143,6 мМ (2,3 SD) мМ для группы 1 и 133,6 мМ для группы 2. Эти значения значительно отличаются с помощью непарного теста t (p 0.0002). Эмбрионы с экстраэмбриональной жидкостью в среднем 63,5 мМ (17,1 SD) мМ и 53,1 мМ (12,6 SD) мМ для групп 1 и 2, соответственно. Тем не менее, концентрация не сильно отличалась между 2 группами эмбрионов с экстраэмбриональной жидкостью (непарный t тест, р 0,07). Необработанные контрольные эмбрионы измерялись на уровне 0 мМ. Из-за изменения уровней носителей было рассчитано соотношение концентрации эмбрионального этанола/медиа-уровней этанола для каждой выборки. Группа 1 была 44% от уровня медиа этанола, в то время как группа 2 было 40% от уровня медиа этанола(рисунок 3 и таблица 2).
Рисунок 1: Изображение эмбриона на 24 h послефертализации (hpf) внутри хориона. Эмбрион и желток окружены экстраэмбриональной жидкостью, все расположены внутри хориона. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2: Протокол для измерения эмбрионального объема и обработки эмбрионов для анализа. (A) Десять 24 л.с. эмбрионов переданы в 1,5 мл микроцентрифуговой трубки, отмеченные на 250 л. (B) Микроцентрифуговая трубка с эмбрионами, наполненными водой (вода окрашена, так что его легче увидеть на отметке 250 л). (C) Вся вода удаляется из трубки и взвешивается. (D) Десять эмбрионов, перенесенных в микроцентрифугную трубку 1,5 мл. Вода была удалена, как в (C) и заменены на 50 зл и коктейль протеазы. (E) После 10 мин, 450 qL 5 M NaCl был добавлен в трубку из (D). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3: Участок коробки и усов соотношения концентрации этанола образцов к носителям. Концентрация этанола для каждой группы была разделена на среднее значение образцов средств массовой информации этой группы. Группа 1 содержала 44% медиа-уровней, в то время как группа 2 содержала 40%. В обеих группах, n No 15; 10 эмбрионов на образец. Группы сравнивались с использованием односторонней ANOVA с пост-масштабным анализом Tukey («P»lt; 0.0001). Усы представляют от минимума до максимума. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
| Эмбрионы и эмбрионы - Объемы экстраэмбрионной воды (Зл) | ||||||
| Водаa | ||||||
| Общий объемb | % от общего объема (V) | Эмбриональный том (W) | Экстраэмбриональный том (X) | % Вода в эмбрионе (Y) | % Вода в экстраэмбриональной (кв) | |
| Эмбрион - экстраэмбриональный (EE)c | 1,97 и 0,4 | |||||
| Эмбрион 24 л.с. (E)c | 1,11 и 0,22 | 56% | 0.82 | 0.86 | 49% | 51% |
| Расчеты | ||||||
| V Эмбрион % от общего объема - Общий объем E - Общий объем EE | ||||||
| W Эмбриональный объем воды - 73,6% | ||||||
| X Экстраэмбриональный объем воды - W - Общий объем EE | ||||||
| Y% Вода в эмбрионе (W q X)/W и 100 | ||||||
| -% Вода в экстраэмбриональных - 100 - Y | ||||||
| a Объем эмбриональной воды был рассчитан по данный у Hagedorn et al.29. | ||||||
| b Значения, как сообщается, как стандартное отклонение (SD). | ||||||
| cn No 13; 10 эмбрионов на образец | ||||||
Таблица 1: Расчет объема воды для эмбрионов с экстраэмбриональной жидкостью. Объем был рассчитан из 13 образцов (10 эмбрионов на образец) из 24 л.с. эмбрионов с экстраэмбриональной жидкостью, все еще в хорионе и эмбрионах, удаленных из их хориона. Значения, как сообщается, в качестве среднего SD.
| Концентрация этанола эмбрионов и носителей (mM) | |||
| Группа 1 | Группа 2 | Комбинированный | |
| Медиа (M)b | 143,6 и 2,3 | 133,6 и 2,7 | 138,6 х 5,8 |
| Эмбрион - экстраэмбриональный (EE)c | 63,5 и 17,1 | 53.1 и 12.6 | 58,3 и 15,7 |
| Соотношение этанола - эмбриона к сми (1) | 0,44 и 0,12 | 0,40 и 0,09 | 0,42 и 0,11 |
| Расчеты | |||
| 1 Коэффициент этанола и ЭЭ | |||
| a Значения, как сообщается, как SD. | |||
| бн no 5 | |||
| cn No 15; 10 эмбрионов на образец | |||
| г Значения являются средними группами 1 и 2. | |||
Таблица 2: Расчеты концентрации этанола в эмбрионах с экстраэмбриональной жидкостью и носителями (мМ). Образцы средств массовой информации были прямыми мерами со стороны средств массовой информации (n No 5 в группе). Концентрация эмбриона танола была рассчитана из 15 образцов (10 эмбрионов на образец) из 24 л.с. эмбрионов с экстраэмбриональной жидкостью. Было рассчитано соотношение концентраций этанола эмбрионов с экстраэмбриональной жидкостью к носителям. Значения, как сообщается, в качестве среднего SD.
| Расчет этанола в эмбрионеa,b | |
| Эмбрион (Y) | Соотношение к медиа() |
| 32,7 и 8,8 мМ | 0,24 и 0,06 |
| Расчеты | |
| Y Эмбриональный этанол 58,3 мМ (таблица 2) 56% (таблица 1) | |
| Вопросы Соотношение этанола - Y 138,6 мМ (таблица 2) | |
| a Значения являются средними группами 1 и 2. | |
| b Значения, как сообщается, как SD. | |
Таблица 3: Расчет этанола в эмбрионе. Концентрация эмбриона танола была рассчитана как 56% от общей концентрации этанола эмбриона с экстраэмбриональной жидкостью. Затем сообщалось, что это соотношение эмбриона к средствам массовой информации. Значения, как сообщается, в качестве среднего SD.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Как модельная система развития, зебрабы идеально подходят для изучения влияния экологических факторов на развитие. Они производят большое количество внешне оплодотворенных эмбрионов, что позволяет точное время и дозировка парадигмы в исследованиях этанола. Это, в сочетании с живой визуализации возможностей и генетической и развития сохранения с людьми, сделать зебры мощной модельной системы для тератологических исследований. Описан протокол для измерения концентрации эмбрионального этанола в развивающихся эмбрионах зебры с использованием хроматографии головного космического газа.
Определение концентрации эмбрионального этанола имеет решающее значение для понимания влияния этанола на развивающийся эмбрион. В моделях грызунов концентрации этанола в крови коррелируют с концентрацией тканей26. Однако оценить уровень этанола в крови в раннем эмбриональном развитии у зебры невозможно. Хроматография головного космического газа используется для измерения уровня этанола в различных экспериментальных парадигмах, включая зебрафиш25,30,31,32,33,34,35. Однако этот протокол может использоваться для измерения многих различных факторов окружающей среды, даже несмотря на то, что волатильность этих различных факторов должна быть достаточно высокой для количественного измерения, и на основе полярности соответствующих соединений должна быть выбрана колонка хроматографа газа. Кроме того, зебры лучше всего подходят для изучения влияния водорастворимых факторов, поскольку воздействие гидрофобных факторов крайне трудно анализировать в рыбе.
Этот протокол позволит исследователям непосредственно оценивать концентрации этанола в эмбрионах зебры. Однако для обеспечения точных измерений концентрации эмбрионального этанола необходимо учитывать несколько факторов. Поскольку измерялись уровни этанола в общих эмбриональных тканях, необходимо было учитывать эмбриональный объем. После 10 л.с. эмбрион начинает сяртогенез (сомитобразование) и больше не является сферой(рисунок 1). Для оценки эмбрионального объема водоизмещение использовалось на 10 объединенных эмбрионах в одном образце. Каждый образец состоял из 10 эмбрионов по двум причинам: во-первых, чтобы уменьшить погрешность от трубача небольших объемов, а во-вторых, усреднеть небольшие колебания объемов эмбриона. При измерении эмбрионального объема важно учитывать точность трубача и взвешивания. Даже использование 10 эмбрионов на образец находится на более низком пределе точности как для пипетков, так и для шкалы, используемой для взвешивания эмбрионов. При наличии оборудования использование менее 10 эмбрионов повлияло бы на анализы. Это не ограничивает исследователей от использования меньшеэмбрионов на образец до тех пор, как точность оборудования считается.
Эмбриональный объем является одним из факторов, влияющих на анализ выборки. Вторым ключевым фактором является скорость эмбриональной обработки, потому что этанол является летучим. Кроме того, этанол быстро уравновешляет в нескольких исследованиях на животных25,36,37. Наш протокол мытья предназначен для быстрого удаления любых этанола, примыкающих к внешней поверхности хориона. В этом исследовании этот протокол мытья не влияет на уровни эмбрионального этанола, хотя больше или несколько моет может повлиять на эмбриональные концентрации этанола25,38. Однако третьим фактором, который следует принимать во внимание, является разбавление эмбрионального объема при обработке. Этот протокол использует коктейль протеазы для деградации хории, а также 5 M NaCl для денатурации всех белков, включая ферменты обработки алкоголя.
Наконец, в самых различных исследованиях по зебры был описан ряд анализов и методов отчетности. Из-за вариации в различных образцах исследования или сравнения различных исследований, надлежащее сообщение о концентрации этанола имеет решающее значение25,38. Методы использования косвенных (обычно ферментативных мер) опираются на анализ вторичного метаболита. В этом случае скорость ферментативной активности может варьироваться и препятствовать точному анализу концентрации этанола. Этот метод непосредственно измеряет уровни этанола, и о концентрациях этанола сообщается как отношение эмбриона к концентрации в средствах массовой информации. Наши результаты соответствуют растущему консенсусу 24 л.с. эмбриона, содержащего 30% концентраций носителей(таблица 3)25,38,39,40. Удивительно, но эта 30% концентрация эмбрионального этанола не зависит от концентрации средств массовой информации, и не очень понятно, что создает это равновесие25,38. Эмбрионы старше 24 л.с. показывают снижение концентрации этанола, при этом 48 л.с. эмбрионов, содержащих почти половину содержания этанола в 24 л.с. эмбриона25. Однако наши результаты не определяют равновесие этанола-воды. Учитывая скорость, с которой этанол уравновешляет, а также волатильность этанола, это невероятно трудно оценить изменения объема воды в самом эмбрионе из-за воздействия этанола. Попытка измерить объем образца эмбриона, обработанного этанолом с помощью водоизмещения, приведет к потере этанола из эмбриона во время измерения. Используя более точные методы микроскопии и спектроскопии, чем описанные выше, можно определить равновесие этанола в эмбрионе, непосредственно измеряя оба в то же время.
В целом, описанный здесь протокол является мощным инструментом для оценки концентрации эмбрионального этанола в развивающихся эмбрионах зебры. Эта информация имеет решающее значение для стандартизации исследований FASD с использованием зебры. Способность точно контролировать парадигмы лечения этанола и непосредственно количественно эмбриональных концентраций этанола укрепляет функциональность модели зебры для исследований ФАСД человека. В конечном счете, эта работа значительно улучшит наше понимание FASD.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Исследование, представленное в этой статье, было поддержано предыдущими грантами От Национальных институтов здравоохранения /Национального института стоматологических и краниофациальных исследований (NIH/NIDCR) R01DE020884 j.K.E. и Национальные институты здравоохранения/Национальный институт по злоупотреблению алкоголем и алкоголизмом (NIH/NIAAA) F32AA021320 в C.B.L. и по текущему гранту От Национальных институтов здравоохранения/Национального института по злоупотреблению алкоголем (NIH/NIAAA) R00AA023560 в C.B.L. Мы благодарим Рубена Гонсалеса за предоставление и помощь в анализе хроматографа газа. Мы благодарим Tiahna Ontiveros и д-р Джина Ноблс письменной помощи.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Air | Provided by contract to the university | ||
| Analytical Balance | VWR | 10204-962 | |
| AutoSampler, CP-8400 | Varian | Gas Chromatograph Autosampler | |
| Calcium Chloride | VWR | 97062-590 | |
| Ethanol | Decon Labs | 2701 | |
| Gas chromatograph vial with polytetrafluoroethylene/silicone septum and plastic cap 2 mL | Agilent | 8010-0198 | Can reuse the vials after cleaning, but not the caps/septa |
| Gas Chromatograph, CP-3800 | Varian | ||
| Helium | Provided by contract to the university | ||
| HP Innowax capillary column | Agilent | 19095N-123I | 30 m x 0.53 mm x 1.0 μm film thick |
| Hyrdogen | Provided by contract to the university | ||
| Magnesium Sulfate (Heptahydrate) | Fisher Scientific | M63-500 | |
| Microcentrifuge tube 1.5 mL | Fisher Scientific | 2682002 | |
| Micropipette tips 10 μL | Fisher Scientific | 13611106 | |
| Micropipette tips 1000 μL | Fisher Scientific | 13611127 | |
| Micropipette tips 200 μL | Fisher Scientific | 13611112 | |
| Petri dishes 100 mm | Fisher Scientific | FB012924 | |
| Pipetman L p1000L Micropipette | Gilson | FA10006M | |
| Pipetman L p200L Micropipette | Gilson | FA10005M | |
| Pipetman L p2L Micropipette | Gilson | FA10001M | |
| Polytetrafluoroethylene/silicone septum and plastic cap | Agilent | 5190-7021 | Replacement caps/septa for gas chromatograph vials |
| Potassium Chloride | Fisher Scientific | P217-500 | |
| Potassium Phosphate (Dibasic) | VWR | BDH9266-500G | |
| Pronase | VWR | 97062-916 | |
| Silica Beads .5 mm | Biospec Products | 11079105z | |
| Silica Beads 1.0 mm | Biospec Products | 11079110z | |
| Sodium Bicarbonate | VWR | BDH9280-500G | |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | S271-500 | |
| Sodium Phosphate (Dibasic) | Fisher Scientific | S374-500 | |
| Solid-phase microextraction fiber assembly Carboxen/Polydimethylsiloxane | Millipore Sigma | 57343-U | Replacement fibers |
| Star Chromatography Workstation | Varian | Chromatography software | |
| Thermogreen Low Bleed (LB-2) Septa | Millipore Sigma | 23154 | Replacement inlet septa |
References
- Elliott, E. J., Payne, J., Morris, A., Haan, E., Bower, C. Fetal alcohol syndrome: a prospective national surveillance study. Archive of Diseases in Childhood. 93 (9), 732-737 (2008).
- Cudd, T. A. Animal model systems for the study of alcohol teratology. Experimental Biology and Medicine. 230 (6), 389-393 (2005).
- Williams, J. F., Smith, V. C. Committee on Substance Abuse. Fetal Alcohol Spectrum Disorders. Pediatrics. 136 (5), 1395-1406 (2015).
- Patten, A. R., Fontaine, C. J., Christie, B. R. A comparison of the different animal models of fetal alcohol spectrum disorders and their use in studying complex behaviors. Frontiers in Pediatrics. 2, 93 (2014).
- Petrelli, B., Weinberg, J., Hicks, G. G. Effects of prenatal alcohol exposure (PAE): insights into FASD using mouse models of PAE. Biochemistry and Cell Biology. 96 (2), 131-147 (2018).
- Mayfield, J., Arends, M. A., Harris, R. A., Blednov, Y. A. Genes and Alcohol Consumption: Studies with Mutant Mice. International Review Neurobiology. 126, 293-355 (2016).
- Marquardt, K., Brigman, J. L. The impact of prenatal alcohol exposure on social, cognitive and affective behavioral domains: Insights from rodent models. Alcohol. 51, 1-15 (2016).
- Sulik, K. K. Genesis of alcohol-induced craniofacial dysmorphism. Experimental Biology and Medicine. 230 (6), 366-375 (2005).
- Lipinski, R. J., et al. Ethanol-induced face-brain dysmorphology patterns are correlative and exposure-stage dependent. PLoS One. 7 (8), 43067 (2012).
- Eberhart, J. K., Parnell, S. The genetics of fetal alcohol spectrum disorders. Alcoholism: Clinical and Experimental Research. 40 (6), 1154-1165 (2016).
- Becker, H. C., Diaz-Granados, J. L., Randall, C. L. Teratogenic actions of ethanol in the mouse: a minireview. Pharmacology, Biochemistry and Behavior. 55 (4), 501-513 (1996).
- Ahlgren, S. C., Thakur, V., Bronner-Fraser, M. Sonic hedgehog rescues cranial neural crest from cell death induced by ethanol exposure. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (16), 10476-10481 (2002).
- Loucks, E. J., Ahlgren, S. C. Deciphering the role of Shh signaling in axial defects produced by ethanol exposure. Birth Defects Research Part A: Clinical and Molecular Teratology. 85 (6), 556-567 (2009).
- Hong, M., Krauss, R. S. Cdon mutation and fetal ethanol exposure synergize to produce midline signaling defects and holoprosencephaly spectrum disorders in mice. PLoSGenetics. 8 (10), 1002999 (2012).
- Aoto, K., Shikata, Y., Higashiyama, D., Shiota, K., Motoyama, J. Fetal ethanol exposure activates protein kinase A and impairs Shh expression in prechordal mesendoderm cells in the pathogenesis of holoprosencephaly. Birth Defects Research Part A: Clinical and Molecular Teratology. 82 (4), 224-231 (2008).
- Deltour, L., Ang, H. L., Duester, G. Ethanol inhibition of retinoic acid synthesis as a potential mechanism for fetal alcohol syndrome. The FASEB Journal. 10 (9), 1050-1057 (1996).
- Wentzel, P., Eriksson, U. J. Ethanol-induced fetal dysmorphogenesis in the mouse is diminished by high antioxidative capacity of the mother. Toxicological Sciences. 92 (2), 416-422 (2006).
- Karacay, B., Mahoney, J., Plume, J., Bonthius, D. J. Genetic absence of nNOS worsens fetal alcohol effects in mice. II: microencephaly and neuronal losses. Alcoholism: Clinical and Experimental Research. 39 (2), 221-231 (2015).
- Bonthius, D. J. Jr, Winters, Z., Karacay, B., Bousquet, S. L., Bonthius, D. J. Importance of genetics in fetal alcohol effects: null mutation of the nNOS gene worsens alcohol-induced cerebellar neuronal losses and behavioral deficits. Neurotoxicology. 46, 60-72 (2015).
- Bonthius, D. J., et al. Deficiency of neuronal nitric oxide synthase (nNOS) worsens alcohol-induced microencephaly and neuronal loss in developing mice. Brain Research. Developmental Brain Research. 138 (1), 45-59 (2002).
- Langevin, F., Crossan, G. P., Rosado, I. V., Arends, M. J., Patel, K. J. Fancd2 counteracts the toxic effects of naturally produced aldehydes in mice. Nature. 475 (7354), 53-58 (2011).
- Lovely, C. B., Fernandes, Y., Eberhart, J. K. Fishing for Fetal Alcohol Spectrum Disorders: Zebrafish as a Model for Ethanol Teratogenesis. Zebrafish. 13 (5), 391-398 (2016).
- Fernandes, Y., Buckley, D. M., Eberhart, J. K. Diving into the world of alcohol teratogenesis: a review of zebrafish models of fetal alcohol spectrum disorder. Biochemistry and Cell Biology. 96 (2), 88-97 (2018).
- McCarthy, N., et al. Pdgfra protects against ethanol-induced craniofacial defects in a zebrafish model of FASD. Development. 140 (15), 3254-3265 (2013).
- Lovely, C. B., Nobles, R. D., Eberhart, J. K. Developmental age strengthens barriers to ethanol accumulation in zebrafish. Alcohol. 48 (6), 595-602 (2014).
- Harris, R. A., Trudell, J. R., Mihic, S. J. Ethanol's molecular targets. Science Signaling. 1 (28), (2008).
- Westerfield, M. The Zebrafish Book: A guide for the laboratory use of zebrafish Danio (Brachydanio) rerio. , University of Oregon Press. Eugene, OR. (1993).
- Lawson, N. D., Weinstein, B. M. In vivo imaging of embryonic vascular development using transgenic zebrafish. Developmental Biology. 248 (2), 307-318 (2002).
- Hagedorn, M., Kleinhans, F. W., Artemov, D., Pilatus, U. Water Distribution and permeability of zebrafish embryos, Brachydanio rerio. Journal of Experimental Zoology. 278 (6), 356-371 (1997).
- Lippi, G., et al. The alcohol used for cleansing the venipuncture site does not jeopardize blood and plasma alcohol measurement with head-space gas chromatography and an enzymatic assay. Biochemia Medica. 27 (2), 398-403 (2017).
- Poklis, J. L., Wolf, C. E., Peace, M. R. Ethanol concentration in 56 refillable electronic cigarettes liquid formulations determined by headspace gas chromatography with flame ionization detector (HS-GC-FID). Drug Testing and Analysis. 9 (10), 1637-1640 (2017).
- Heit, C., et al. Quantification of Neural Ethanol and Acetaldehyde Using Headspace GC-MS. Alcoholism: Clinical and Experimental Research. 40 (9), 1825-1831 (2016).
- Chun, H. J., Poklis, J. L., Poklis, A., Wolf, C. E. Development and Validation of a Method for Alcohol Analysis in Brain Tissue by Headspace Gas Chromatography with Flame Ionization Detector. Journal of Analytical Toxicology. 40 (8), 653-658 (2016).
- Schlatter, J., Chiadmi, F., Gandon, V., Chariot, P. Simultaneous determination of methanol, acetaldehyde, acetone, and ethanol in human blood by gas chromatography with flame ionization detection. Human and Experimental Toxicology. 33 (1), 74-80 (2013).
- Schier, C. J., Mangieri, R. A., Dilly, G. A., Gonzales, R. A. Microdialysis of ethanol during operant ethanol self-administration and ethanol determination by gas chromatography. Journal of Visualized Experiments. (67), e4142 (2012).
- Adalsteinsson, E., Sullivan, E. V., Mayer, D., Pfefferbaum, A. In vivo quantification of ethanol kinetics in rat brain. Neuropsychopharmacology. 31 (12), 2683-2691 (2006).
- Quertemont, E., Green, H. L., Grant, K. A. Brain ethanol concentrations and ethanol discrimination in rats: effects of dose and time. Psychopharmacology. 168 (3), 262-270 (2003).
- Flentke, G. R., Klinger, R. H., Tanguay, R. L., Carvan, M. J., Smith, S. M. An evolutionarily-conserved mechanism of calcium-dependent neurotoxicity. Alcoholism: Clinical and Experimental Research. 38 (5), 1255-1265 (2014).
- Reimers, M. J., Flockton, A. R., Tanguay, R. L. Ethanol- and acetaldehyde-mediated developmental toxicity in zebrafish. Neurotoxicology and Teratology. 26 (6), 769-781 (2004).
- Zhang, C., Ojiaku, P., Cole, G. J. Forebrain and hindbrain development in zebrafish is sensitive to ethanol exposure involving agrin, Fgf, and sonic hedgehog function. Birth Defects Research Part A: Clinical and Molecular Teratology. 97 (1), 8-27 (2013).
