Denne arbeidsflyten beskriver ytelsen til tids- og kostnadseffektiv berikelse av flere proteinpost-translational modifikasjoner (PTMs) samtidig for kvantitativ global proteomisk analyse. Protokollen benytter ptm berikelse på peptidnivå med flere konjugerte antistoffer, etterfulgt av datauavhengig oppkjøpsmassespektrometrianalyse for å få biologisk innsikt i PTM crosstalk.
Å studere flere post-translational modifikasjoner (PTMs) av proteiner er et avgjørende skritt for å forstå PTM crosstalk og få mer helhetlig innsikt i proteinfunksjon. Til tross for viktigheten av multi-PTM berikelse studier, få studier undersøke mer enn én PTM om gangen, delvis på grunn av utgifter, tid, og store proteinmengder som kreves for å utføre flere globale proteomiske analyse av PTMs. Den “one-pot” affinitet berikelse beskrevet i denne protokollen overvinner disse barrierene ved å tillate samtidig identifisering og kvantifisering av peptider med lysin rester som inneholder acetylering og kortfattet PTMs med lave mengder prøve Input. Protokollen innebærer utarbeidelse av proteinlysate fra muselever av SIRT5 knockout mus, ytelse av trypsin fordøyelse, berikelse for PTMs, og ytelse av masse spektrometrisk analyse ved hjelp av en data-uavhengig oppkjøp (DIA) arbeidsflyt. Fordi denne arbeidsflyten gjør det mulig å berike to PTMer fra samme prøve samtidig, gir den et praktisk verktøy for å studere PTM crosstalk uten å kreve store mengder prøver, og det reduserer i stor grad tiden som kreves for prøveforberedelse, data oppkjøp, og analyse. DIA-komponenten i arbeidsflyten inneholder omfattende PTM-spesifikk informasjon. Dette er spesielt viktig når du studerer PTM-lokalisering, da DIA gir omfattende sett med fragmentioner som kan deputeres for å skille mellom ulike PTM lokalisering isoformer.
En myriade av post-translational modifikasjoner dynamisk regulere proteiner og veier gjennom effekter på aktiviteten1, signaliserer2,og omsetning3,4. For eksempel aktiveres proteinkinaser eller deaktiveres ved tilsetning av fosfatgrupper5,og histoneacetylasjon og andre modifikasjoner gir en mekanisme for å endre kromatinstrukturen og tjene som transkripsjonelle regulatoriske mekanismer6,7. I de senere årene har bevis montert at flere PTMs fungerer i konsert eller konkurrere om å regulere proteinfunksjon eller aktivitet8,9,10,11. Derfor er forståelse av PTM crosstalk et voksende behov i PTM forskning. De fleste tilgjengelige proteomiske arbeidsflyter for å identifisere og kvantifisere PTM-områder fokuserer imidlertid på enkeltendringer, i stedet for samspillet mellom flere endringer. Den beskrevne arbeidsflyten korrelerer spesifikk proteinmodifisering “hot-spots” og lysin rester som er endret av flere forskjellige PTMs.
Det er et økende behov i det vitenskapelige samfunnet for mulige metoder for å studere flere PTMer samtidig12. De fleste metoder for å globalt identifisere og kvantifisere nettstedene til flere typer PTMer er utfordrende på grunn av de høye kostnadene og mengden vev som kreves12,13. Ikke bare er multi-PTM berikelse eksperimenter tidkrevende i form av prøveforberedelse, datainnsamling, og dataanalyse, men disse studiene krever vanligvis store og ofte uoverkommelige mengder protein11. Beskrevet her er en protokoll for samtidig berikelse og analyse av flere PTMer, som også adresserer flere av disse barrierene og muliggjør storskala PTM profilering og vurdering av kryssbehandling mellom ulike PTMs14. Denne en-pot arbeidsflyten skisserer en praktisk måte for biomedisinske forskere å globalt profilere flere PTMer, identifisere komodifiserte peptider, og studere PTM crosstalk på en effektiv måte14,15.
Her vises denne metoden ved å undersøke mitokondrieproteinacylasjon, som først ble studert for over 50 år siden16. Det konsentrerer seg spesifikt om lysin acetylation17 og succinylation18, inkludert samtidig forekomst av disse modifikasjoner på proteiner og til og med samtidig modifisering på peptidnivå. Siden studien bruker en sirtuin 5 (SIRT5) knockout musemodell, ble det valgt å fokusere på berikelse av acetylering og kortfattede nettsteder. Denne beslutningen ble gjort fordi kortfattede nettsteder er mål for SIRT5 desuccinylase og forventes dermed å vise betydelig upregulation i KO mus, noe som gjør dem til de mest relevante PTMs i dette tilfellet. Begge PTM er biologisk relevante som nylig oppsummert av Carrico et al.19. Generelt viser acetylering viktige effekter på genuttrykk og metabolisme, og kortfattet er rapportert å regulere hjertemetabolismen og funksjon20.
Den beskrevne protokollen kan utføres med en lav mengde proteininndatamateriale (f.eks. 1 mg proteinlysat) og reduserer den totale varigheten av forsøket ved å redusere tiden som brukes til prøvebehandling, MS-innhenting og dataanalyse. En arbeidsflytskjematisk er angitt i figur 1. Vi har også brukt enda lavere mengder startmateriale (ned til 100 μg proteinlysat, skalering ned mengdene perler som brukes tilsvarende), noe som som forventet reduserer den totale avkastningen av identifiserte asiret peptider; Det gir imidlertid fortsatt svært verdifulle resultater og kvantifiserbare asiret peptider.
Mens såkalte ovenfra og ned-arbeidsflyter vanligvis ikke bruker proteolytiske fordøyelsestilnærminger (og dermed opprettholder tilkoblingen til flere PTMer i ett protein), fokuserer denne protokollen på en peptidbasert affinitetsberikelsestilnærming for å få ekstra dybde og følsomhet for PTM-identifikasjon og kvantifisering(figur 1). I tillegg benytter denne peptid-sentriske arbeidsflyten moderne massespektrometrimetoder, inkludert 1) en kombinasjon av dataavhengig oppkjøp (DDA) for å generere spektrale biblioteker, og 2) datauavhengig oppkjøp (DIA) for nøyaktig PTM-kvantifisering i en etikettfri arbeidsflyt.
DIA arbeidsflyter overvinne prøvetaking stochasticity av typiske DDA scan ordninger ved omfattende fragmentering alle peptid signaler innenfor samplet m / z rekkevidde21. Denne funksjonen er også svært gunstig når det gjelder lokalisering av nettstedet, fordi det er lettere å få informasjon om hvilke spesifikke fragmentioner som endres i peptidet. I tillegg tillater DIA-arbeidsflyter identifikasjon og kvantifisering av mindre PTM-peptidisoformer med identiske forløperioner. DIA-metoder kan også bestemme en bestemt LOKALLOKALISERING av PTM-området i et peptid basert på spesifikke tilsvarende fragmentioner som er grundig målt til enhver tid. DDA tilnærminger bruker imidlertid ofte “dynamisk ekskludering” funksjoner som utelukker flere prøvetaking av MS / MS for samme forløper ion, og dermed mangler mindre PTM isoformer.
Den samtidige berikelsesstrategien som er beskrevet her, er ideelt egnet for studier som vil dra nytte av den globale profileringen og kvantifiseringen av flere PTMer, undersøke PTM-krysssnakk og forstå de dynamiske interaksjonene til post-translasjonelle modifikasjoner. Identifisering av flere berikede PTMer i en kombinert arbeidsflyt er beskrevet av: global, seriell eller parallell berikelse av PTM som inneholder proteolytiske peptider, eller alternativt ved analyse av intakte proteiner. I direkte sammenligning med serieberikelse av acetylering og succinylation, ble effektiviteten av en-pot metodikk etablert som svært lik14. Disse alternative protokollene krever betydelige mengder startmateriale og tid og kan være uoverkommelig dyrt. I motsetning gir en-pot-protokollen en billig og effektiv metode for berikelse av mer enn én PTM med påfølgende analyse og identifikasjon.
Mus levervev er hentet fra SIRT5 knockout mus og brukes her som startmateriale. Denne protokollen kan også utføres for proteinlysates fra forskjellige vev eller cellekultur eksperimenter. Denne protokollen kan brukes på proteinlysates hentet fra vev eller cellekulturpellets.
Denne protokollen beskriver en ny teknikk for samtidig flere PTM berikelse for å mer effektivt forstå PTM crosstalk. Alternative metoder for å nå dette målet har en tendens til å være uoverkommelig tidkrevende og dyrt, og de krever store mengder protein for å være vellykket11,13. Denne protokollen presenterer en arbeidsflyt for multi-PTM berikelse som innebærer inkubasjon i antistoffkonjugerte perler for to PTMer samtidig for å forbedre eksperimentets generelle effektivitet. Denne metoden innebærer også bruk av DDA for spektral bibliotekgenerasjon og DIA MS-oppkjøp for å oppdage og kvantifisere peptidene som er tilstede med redusert interferens fra fragmenter22,23. Programmer, for eksempel MS database søkemotorer brukes til å analysere og kvantifisere data fra DDA oppkjøp, mens Kvantitativ Proteomics Software24 og spesifikke DIA Quantitative Analysis Software25 er nødvendig for å tolke den komplekse spectra produsert av DIA oppkjøp.
Det er flere kritiske trinn i denne protokollen som bør følges nøye. Siden hovedmålet med protokollen er å berike for flere PTMer samtidig, er antibody-affinity berikelsestrinnet (avsnitt 2) avgjørende for eksperimentets suksess. Når du utfører vasker på perlene, er det nødvendig å sikre at ingen av perlene blir aspirert ved et uhell. Å sikre at ureakonsentrasjonen er fortynnet til 1 M før fordøyelsen med trypsin (trinn 1,8) er også nødvendig. Selv om 8 M urea er nødvendig tidligere i protokollen for proteinløselighet, vil ureakonsentrasjoner over 1 M hemme trypsins enzymatiske aktivitet. I tillegg er det viktig å konsekvent sjekke pH av prøven gjennom protokollen. Dette er spesielt viktig før fordøyelsen. Hvis pH av prøven og trypsinløsningen ikke nøytraliseres riktig før inkubasjonen, kan det resultere i en ineffektiv fordøyelse hvor mange spaltingssteder kan gå glipp av, noe som resulterer i færre peptididentifikasjoner.
Noen endringer i protokollen kan være nyttig når du forbereder prøver. For et proteinlysat anskaffet fra 1 mg startmateriale, kan en fjerdedel av antistoffperlene som leveres i hvert PTM-skannerør brukes som et kostnadseffektivt alternativ. En større mengde startmateriale kan brukes til bedre resultater, så lenge mengden antistoffperler som brukes, økes proporsjonalt. En annen endring som kan forbedre arbeidsflyten er å fordøye eksempler med en annen protease i tillegg til trypsin. Denne endringen ville resultere i mer variasjon i peptider spaltet, noe som gir økt dekning av proteinrester. Selv om det ikke er nødvendig, anbefales det at trypsin være et av enzymene som brukes til PTM-analyse på grunn av sin høye spaltingsspesifitet26.
En begrensning av denne protokollen er at PTM blir studert må ha lignende kjemi for å bli beriket samtidig14. Prosedyrene for de forskjellige antistoffkonjugerte perlene må være like, ved hjelp av lignende løsemidler og løsninger, inkludert lignende elutionforhold, og helst fra samme leverandør. Av denne grunn bruker metoden som er skissert her konsekvent acetylering og kortfattet som et eksempel, som begge bruker antistoffkonjugerte perler (Cell Signaling Technology, Inc). Selv om denne metoden teoretisk kan brukes på en rekke PTMs, vil ytterligere studier være nødvendig for å vurdere den nøyaktige begrensningen av protokollen i denne forbindelse. Videre, da dette er en antistoffbasert berikelsesmetode, kan metoden bare gi en relativ kvantifisering av PTM-områder.
Sammenlignet med eksisterende multi-PTM berikelsesmetoder, er denne arbeidsflyten et mer gjennomførbart og kostnadseffektivt alternativ. Fra dette eksperimentet ble det observert at effekten av denne metoden sammenligner ekstremt godt med alternative metoder, for eksempel individuelle eller serieberikelser. Figur 2B viser at median-CV for modifiserte peptid toppområder faktisk ble redusert i en-pot metoden i forhold til single-PTM berikelser og serie-PTM berikelser13. Vi analyserte videre de eksperimentelle resultatene som vurderte talltall på stedsnivå for acetylering eller konsistasjon. I tillegg viste Spearman korrelasjonsanalyse (figur 2C,D) at en-pot PTM-berikelsen utføres på samme måte som arbeidsflytene for enkeltPTM-berikelse. Dette gjaldt også for korrelasjonene på peptid- og fragmentnivå. Den samme observasjonen holdt for alle tre korrelasjoner når du sammenligner en-pot med seriell-PTM berikelse.
Denne protokollen gjør det mulig for forskere å gjøre fascinerende biologisk innsikt i PTM crosstalk på en rask og kostnadseffektiv måte. DIA-komponenten i arbeidsflyten gjør det mulig for forskere å forstå mer om PTMs, da den gir informasjon om lokalisering på stedet og overvinner utfordringer som lavt område belegg av PTMs. Forløperioner har en tendens til å bli utelukket med DDA, noe som er spesielt viktig når du studerer PTMs, da nettstedets belegg ofte er lavt til det punktet hvor disse peptidene ikke blir valgt for MS / MS, men fortsatt inneholder viktig informasjon. Oppfølgingseksperimenter kan utføres for å vurdere den øvre grensen for hvor mange PTMer som kan berikes samtidig ved hjelp av denne metoden. En fremtidig forbedring av denne arbeidsflyten kan omfatte utvikling av mer avanserte programvareplattformer for ytterligere å automatisere analysen av områdelokalisering og PTM-nettstedbelegg.
The authors have nothing to disclose.
Vi anerkjenner støtten fra NIH delte instrumenteringsstipend for TripleTOF-systemet ved Buck Institute (1S10 OD016281). Dette arbeidet ble også støttet av National Institute of Allergy and Infectious Disease (R01 AI108255 til BS) og National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases (R24 DK085610 til Eric Verdin; R01 DK090242 til Eric Goetzman). X.X. ble støttet av et stipend fra National Institutes of Health (NIH grant T32GM8806, til Judith Campisi og Lisa Ellerby), N.B. ble støttet av et postdoktorstipend fra Glenn Foundation for Medical Research.
1 M Triethylammonium biocarbonate buffer (TEAB) | Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA | T7408 | |
Acetonitrile, Burdick and Jackson LC-MS grade | Burdick and Jackson, Muskegon, MI, USA | 36XL66 | |
Bioruptor sonicator | Diagenode, Denville, NJ, USA | B01020001 | |
C18 pre-column chip (200 µm x 6 mm ChromXP C18-CL chip, 3 um, 120 A) | SCIEX, Framingham, MA, USA | 5015841 | |
C18-CL chip (75 µm x 15 cm ChromXP, 3 µm, 300 Å) | SCIEX, Framingham, MA, USA | 804-00001 | |
Dithiothreitol (DTT) | Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA | D9779-5G | |
Eppendorf Thermomixer Compact | Eppendorf AG, Hamburg, Germany | T1317-1EA | |
Eppendorf Tube (2.0 mL Safelock) | Eppendorf AG, Hamburg, Germany | 22363352 | |
Formic acid | Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA | F0507-500ML | |
Indexed retention time (iRT) normalization peptide standard | Biognosys AG, Schlieren, Zurich, Switzerland | Ki-3002-2 | |
Iodoacetamide (IAA) | Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA | I1149-25G | |
mapDIA | web link | software for interference removal of DIA datasets | |
Methanol, Burdick and Jackson LC-MS grade | Burdick and Jackson, Muskegon, MI, USA | BJLC230-4 | |
PURELAB flex 1 ultrapure water dispenser | VWR International, Radnor, PA, USA | 89204-088 | |
mProphet in Skyline | incorporated in Skyline | integrated statistical algorithms for FDR assessments | |
Oasis HLB SPE cartridges | Waters Corp., Milford, MA, USA | WAT094225 | cartridges for desalting protein lysates, up to 50 mg material |
Phosphate buffered saline solution | Life Technologies | 10010023 | |
Pierce BCA Assay | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | 23225 | |
ProteinPilot 5.0 – 'MS database search engine' | SCIEX, Framingham, MA, USA | software download SCIEX | MS database search engine |
PTMScan Succinyl-Lysine Motif [Succ-K] Kit #13764 | Cell Signaling Technology | 13764 | antibody beads for affinity enrichment |
PTMScan Acetyl-Lysine Motif [Ac-K] Kit #13416 | Cell Signaling Technology | 13416 | antibody beads for affinity enrichment |
Sequencing-grade lyophilized trypsin | Life Technologies | 23225 | |
Skyline – 'Quantitative Proteomics Software' | MacCoss lab (academic) | open source software | Quantitative Proteomics Software (academic) |
Spectronaut – 'DIA Quantitative Analysis Software' | Biognosys AG, Schlieren, Zurich, Switzerland | Sw-3001 | DIA Quantitative Analysis Software / PTM site localization |
Thermo Scientific Savant SPD131DDA Speedvac Concentrator | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | SPD131DDA-115 | instrument to concentrate liquid volume of samples |
TissueLyser II | Qiagen, Hilden, Germany | 85300 | instrument for efficient lysis of tissue |
Trifluoroacetic acid (TFA) | Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA | T6508-1L | |
TripleTOF 6600: orthoganol quadrupole time-of-flight (QqTOF)mass spectrometer | SCIEX, Framingham, MA, USA | Per quote | high resolution mass spectrometer |
Ultra Plus nano-LC 2D HPLC system | SCIEX, Eksigent Division, Framingham, MA, USA | Model #845 | chromatographic separation system |
Urea | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | PI29700 | |
Water, Burdick and Jackson LC-MS | Burdick and Jackson, Muskegon, MI, USA | 600-30-76 | |
ZipTip C18 Pipette Tips, P10 | Merck Millipore Ltd, Tullagreen, Carrigtwohill, Co. Cork, IRL | ZTC18S096 | C-18 resin loaded tips for desalting of peptide mixtures |