Summary
Dieser Workflow beschreibt die Gleichzeitige der zeit- und kosteneffizienten Anreicherung mehrerer Protein-Post-Translational-Modifikationen (PTMs) für die quantitative globale proteomische Analyse. Das Protokoll nutzt ptM-Anreicherung auf Peptidebene mit mehreren konjugierten Antikörpern, gefolgt von einer datenunabhängigen Erfassungsmassenspektrometrieanalyse, um biologische Einblicke in PTM-Übersprechen zu gewinnen.
Abstract
Das Studium mehrerer posttranslationaler Modifikationen (PTMs) von Proteinen ist ein entscheidender Schritt, um PTM-Übersprachung zu verstehen und ganzheitlichere Einblicke in die Proteinfunktion zu gewinnen. Trotz der Bedeutung von Multi-PTM-Anreicherungsstudien untersuchen nur wenige Studien mehr als ein PTM gleichzeitig, was teilweise auf die Kosten, die Zeit und die großen Proteinmengen zurückzuführen ist, die für die Durchführung mehrerer globaler proteomischer Analysen von PTM erforderlich sind. Die in diesem Protokoll beschriebene "Ein-Topf"-Affinitätsanreicherung überwindet diese Barrieren, indem sie die gleichzeitige Identifizierung und Quantifizierung von Peptiden mit Lysinrückständen ermöglicht, die Acetylierungs- und Präsinylierungs-PTM mit geringen Probenmengen enthalten. Eingabe. Das Protokoll umfasst die Herstellung von Proteinlysat aus Mauslebern von SIRT5-Knockout-Mäusen, die Leistung der Trypsin-Verdauung, die Anreicherung für PTMs und die Durchführung von Massenspektrometrie-Analysen mit einem datenunabhängigen Erfassungsworkflow (DIA). Da dieser Workflow die gleichzeitige Anreicherung von zwei PTMs aus derselben Probe ermöglicht, bietet er ein praktisches Werkzeug, um PTM-Übersprechen zu untersuchen, ohne dass große Probenmengen erforderlich sind, und reduziert den Zeitaufwand für die Probenvorbereitung und -daten erheblich. Akquisition und Analyse. Die DIA-Komponente des Workflows bietet umfassende PTM-spezifische Informationen. Dies ist besonders wichtig, wenn die PTM-Standortlokalisierung untersucht wird, da DIA umfassende Sätze von Fragmentionen bereitstellt, die rechnerisch entschlüsselt werden können, um zwischen verschiedenen PTM-Lokalisierungsisoformen zu unterscheiden.
Introduction
Eine Vielzahl von post-translationalen Modifikationen regulieren dynamisch Proteine und Bahnen durch Effekte auf die Aktivität1, Signalisierung2und Umsatz3,4. Zum Beispiel werden Proteinkiinasen durch Zugabe von Phosphatgruppen5aktiviert oder deaktiviert, und Histonacetylierung und andere Modifikationen bieten einen Mechanismus, um die Chromatinstruktur zu ändern und als transkriptionelle Regulierungsmechanismen6,7zu dienen. In den letzten Jahren hat sich der Beweis, dass mehrere PTMs arbeiten in Konzert oder konkurrieren, um Proteinfunktion oder Aktivität zu regulieren8,9,10,11. Daher ist das Verständnis von PTM-Crosstalk ein aufkommender Bedarf in der PTM-Forschung. Die meisten verfügbaren proteomischen Workflows zum Identifizieren und Quantifizieren von PTM-Sites konzentrieren sich jedoch auf einzelne Modifikationen und nicht auf das Zusammenspiel mehrerer Änderungen. Der beschriebene Workflow korreliert spezifische Proteinmodifikationen "Hot-Spots" und Lysinrückstände, die durch mehrere verschiedene PTMs modifiziert werden.
In der wissenschaftlichen Gemeinschaft wächst der Bedarf an praktikablen Methoden, um mehrere PTMs gleichzeitig zu untersuchen12. Die meisten Methoden zur globalen Identifizierung und Quantifizierung der Standorte mehrerer Arten von PTMs sind aufgrund der hohen Kosten und der menge des erforderlichen Gewebes eine Herausforderung12,13. Multi-PTM-Anreicherungsexperimente sind nicht nur zeitaufwändig in Bezug auf Probenvorbereitung, Datenerfassung und Datenanalyse, sondern diese Studien erfordern in der Regel große und oft unerschwingliche Mengen an Protein11. Hier wird ein Protokoll zur gleichzeitigen Anreicherung und Analyse mehrerer PTMs beschrieben, das auch mehrere dieser Barrieren anspricht und eine groß angelegte PTM-Profilerstellung und Diebewertung von Crosstalk zwischen verschiedenen PTMs14ermöglicht. Dieser Ein-Topf-Workflow skizziert eine praktische Möglichkeit für biomedizinische Forscher, mehrere PTMs global zu profilieren, co-modifizierte Peptide zu identifizieren und PTM-Übersprechen auf effiziente und kostengünstige Weise zu untersuchen14,15.
Hier wird diese Methode durch die Untersuchung der mitochondrialen Proteinacylierung gezeigt, die erstmals vor über 50 Jahren untersucht wurde16. Es konzentriert sich speziell auf Lysin-Acetylierung17 und Präsinylierung18, einschließlich des Ko-Vorkommens dieser Modifikationen an Proteinen und sogar Co-Modifikation auf Peptidebene. Da die Studie ein Sirtuin 5 (SIRT5) Knockout-Maus-Modell verwendet, wurde es ausgewählt, sich auf die Anreicherung von Acetylierungs- und Bernstein-Sites zu konzentrieren. Diese Entscheidung wurde getroffen, weil Prägnsalverfahren Ziele von SIRT5 Desuccinylase sind und daher erwartet werden, dass sie bei KO-Mäusen eine signifikante Upregulation aufweisen, was sie in diesem Fall zu den relevantesten PTMs macht. Beide PTMs sind biologisch relevant, wie kürzlich von Carrico et al.19zusammengefasst. Im Allgemeinen zeigt acetylierung wichtige Auswirkungen auf die Genexpression und den Stoffwechsel, und Succinylierung wurde berichtet, um den Herzstoffwechsel und Die Funktion zu regulieren20.
Das beschriebene Protokoll kann mit einer geringen Menge an Protein-Eingangsmaterial (z. B. 1 mg Proteinlysat) durchgeführt werden und reduziert die Gesamtdauer des Experiments, indem die Fürlange für die Probenverarbeitung, MS-Erfassung und Datenanalyse reduziert wird. Ein Workflowschema ist in Abbildung 1angegeben. Wir haben auch noch geringere Mengen an Ausgangsmaterial verwendet (bis zu 100 g Proteinlysat, das die entsprechend verwendeten Perlenmengen reduziert), was erwartungsgemäß die Gesamtausbeute der identifizierten azylaten Peptide reduziert; Es liefert jedoch immer noch sehr wertvolle Ergebnisse und quantifizierbare acylated Peptide.
Während so genannte Top-Down- oder Middle-Down-Workflows in der Regel keine proteolytischen Verdauungsansätze verwenden (und somit die Konnektivität mehrerer PTMs innerhalb eines Proteins beibehalten), konzentriert sich dieses Protokoll auf einen Peptid-basierten Affinitätsanreicherungsansatz, um zusätzliche Tiefe und Empfindlichkeit für die PTM-Identifikation und -Quantifizierung zu erhalten (Abbildung 1). Darüber hinaus nutzt dieser peptidzentrierte Workflow moderne Massenspektrometriemethoden, einschließlich 1) einer Kombination aus datenabhängiger Erfassung (DDA) zur Erzeugung von Spektralbibliotheken und 2) datenunabhängiger Erfassung (DIA) für eine genaue PTM-Quantifizierung in einem etikettenfreien Workflow.
DIA-Workflows überwinden die Sampling-Stochasticity typischer DDA-Scanschemata, indem alle Peptidsignale innerhalb des abgetasteten m/z-Bereichs21umfassend fragmentiert werden. Diese Funktion ist auch äußerst vorteilhaft in Bezug auf die Lokalisierung der Site, weil es einfacher ist, Informationen darüber zu erhalten, welche spezifischen Fragmentionen innerhalb des Peptids modifiziert werden. Darüber hinaus ermöglichen DIA-Workflows die Identifizierung und Quantifizierung kleinerptamischer Peptid-Isoformen mit identischen Vorläuferionen. DIA-Methoden können auch eine spezifische PTM-Standortlokalisierung innerhalb eines Peptids auf der Grundlage spezifischer entsprechender Fragmentionen bestimmen, die jederzeit umfassend gemessen werden. DDA-Ansätze verwenden jedoch häufig "dynamische Ausschluss"-Funktionen, die eine mehrfache Probenahme von MS/MS für dasselbe Vorläuferion ausschließen, wodurch kleinere PTM-Isoformen fehlen.
Die hier beschriebene Strategie zur gleichzeitigen Anreicherung eignet sich ideal für Studien, die von der globalen Profilierung und Quantifizierung mehrerer PTMs, der Untersuchung von PTM-Crosstalk und dem Verständnis der dynamischen Wechselwirkungen posttranslationaler Modifikationen profitieren. Die Identifizierung mehrerer angereicherter PTMs in einem kombinierten Workflow wurde beschrieben durch: globale, serielle oder parallele Anreicherung von PTM, das proteolytische Peptide enthält, oder alternativ durch die Analyse intakter Proteine. Im direkten Vergleich mit der seriellen Anreicherung von Acetylierung und Präsination wurde die Effizienz der Ein-Topf-Methodik als sehr ähnlich14festgelegt. Diese alternativen Protokolle erfordern erhebliche Mengen an Ausgangsmaterial und Zeit und können unerschwinglich teuer sein. Im Gegensatz dazu bietet das One-Pot-Protokoll eine kostengünstige und effiziente Methode zur Anreicherung von mehr als einem PTM mit anschließender Analyse und Identifikation.
Mauslebergewebe werden von SIRT5 Knockout-Mäusen gewonnen und hier als Ausgangsmaterial verwendet. Dieses Protokoll kann auch für Proteinlysate aus verschiedenen Geweben oder Zellkulturexperimenten durchgeführt werden. Dieses Protokoll kann auf Proteinlysate angewendet werden, die aus Geweben oder Zellkulturpellets gewonnen werden.
Protocol
Alle im Protokoll beschriebenen Experimente folgen den Richtlinien des Buck Institute Institutional Animal Research Committee.
1. Extraktion von Protein aus homogenisiertem Gewebe und Verdauung mit Protease
- Den Lysepuffer auf eine Endkonzentration von 8 M Harnstoff, 50 mM Triethylammoniumbicarbonat (TEAB), 1 M Trichostatin A (TSA), 20 mM Nicotinamid, 75 mM Natriumchlorid (NaCl), 1x Protease/Phosphatase-Hemmer-Cocktail (PIC) mit HPLC-Wasser frisch vorbereiten.
- Fügen Sie eine sterile Stahlperle zu einem 2 ml Rohr hinzu, das mit einem Perlenmühlenhomogenisator kompatibel ist, und legen Sie dann das Gewebestück (erbsengroß) in das Rohr. Fügen Sie lyse Puffer (500 l) und Wirbel kurz hinzu, um sicherzustellen, dass der Puffer das Gewebestück bedeckt (bei Bedarf mehr Lysepuffer hinzufügen). Legen Sie Rohre auf vorgekühlte Adaptersätze, um sicherzustellen, dass die Rohre zwischen den beiden Adaptern des Homogenisators ausbalanciert sind.
- Proben 2x bei 25 Hz für je 3 min bei 4 °C homogenisieren. Ist das Gewebe nicht vollständig homogenisiert, drehen Sie die Rohre kurz und übertragen Sie das homogenisierte Lysat in ein frisch beschriftetes 1,5 ml-Rohr. Fügen Sie dann dem verbleibenden Gewebestück einen zusätzlichen Lysepuffer hinzu und wiederholen Sie die Homogenisierung 2x bei 25 Hz für jeweils 3 min. Zwei Homogenisierungsrunden reichen in der Regel aus, um das Gewebe aufzubrechen.
- Entfernen Sie die Metallperle mit einer Pinzette. Zwischen jeder Probe die Pinzette mit HPLC-Wasser, HPLC-grade Methanol und HPLC-Wasser wieder abspülen.
- Kombinieren Sie die homogenisierten Lysate, wenn zwei Homogenisierungsrunden aufgebracht wurden, und beschallen Sie Proben mit einem Ultraschallgerät für 10 Zyklen bei 30 s auf/30 s aus und 4 °C bei hoher Leistung.
- Zentrifugieren Sie die homogenisierten Lysate bei 14.000 x g für 10 min bei 4 °C, um das Lysat zu löschen. Übertragen Sie den Überstand (gereinigtes Lysat) auf ein neues 1,5 ml Mikrozentrifugenrohr, um jede Fettschicht zu vermeiden, die auf dem Überstand sitzen kann, und jeglichen Schmutz an der Unterseite des Rohres.
- Führen Sie einen Bicinchoninsäure-Assay (BCA) durch, um die Proteinkonzentration des gereinigten Lysats mit einer richtigen Verdünnung zu messen (z. B. 1:20 und/oder 1:200). Nach BCA-Ergebnissen, aliquot 1 mg Protein aus jeder Probe.
- Reduzieren Sie Proteine in 4,5 mM Dithiothreitol (DTT) bei 37 °C für 30 min mit Rührung bei 1.400 U/min. Anschließend Alkylatproteine in 10 mM Iodoacetamid (IAA) mit Inkubation im Dunkeln (Platz in Schublade oder Schrank) bei Raumtemperatur (RT) für 30 min.
HINWEIS: Es können alternative Reagenzien wie N-Ethylmaleimid (NEM) anstelle von IAA verwendet werden. - Fügen Sie den Proben 50 mM TEAB hinzu, um die Harnstoffkonzentration auf unter 2 M zu verdünnen. Spot 1 l der Probe auf ein pH-Papier, um sicherzustellen, dass der pH-Wert der verdünnten Probe zwischen 7,0-8,5 liegt. Fügen Sie jeder Probe Trypsin im Verhältnis 1:50 (Trypsin-zu-Protein, Wt/Wt) hinzu und verdauen Sie das Protein mit Rührung bei 37 °C über Nacht (ca. 14-16 h).
- Die Verdauungsstörungen mit 10% Ameisensäure ablöschen, um am nächsten Tag 1% Ameisensäure zu erreichen. Wirbel und drehen Sie kurz. Punkt 1 l der Probe auf pH-Streifen, um sicherzustellen, dass der Digest pH = 2-3 ist. Zentrifugenproben bei 1.800 x g für 15 min bei RT, um unlösliches Material zu pellet.
2. Entsalzung nicht angereicherter proteolytischer Peptide durch großflächige Festphasenextraktion
- Erhalten Sie Kartuschen, die C18-Harz enthalten und bis zu 10 mg Protein binden können. Passen Sie diese Patronen in ein Vakuumgerät ein, um Vakuumabsaugung zu verwenden, die die Flüssigkeit während jeder der folgenden Schritte durch die Patrone ziehen kann. Legen Sie für jede Peptidprobe eine Patrone fest.
- Fügen Sie 800 l 80% Acetonitril (ACN) in 0,2% Ameisensäure zu Kartuschen mit 19,8% Wasser hinzu und verwenden Sie Vakuumabsaugung, um die Flüssigkeit durchzuziehen. Wiederholen Sie diesen Schritt 1x, um eine vollständige Trocknung der Patronen zu vermeiden.
- Ausgleichspatronen durch Zugabe von 800 l 0,2 % Ameisensäure in Wasser mit Vakuumabsaugung, um das gesamte Volumen durch den Filter zu ziehen. Wiederholen Sie dies 2x. Peptide mit Vakuumabsaugung auf die Kartuschen aufladen. Peptide 2x mit 800 l 0,2% Ameisensäure in Wasser unter Vakuumabsaugung waschen.
- Ordnen Sie 1,5 ml Mikrozentrifugenrohre unter jeder Patrone an, um im letzten Schritt Peptid-Elusien zu sammeln. Unter Vakuum-Saugelute Peptide von Kartuschen, zuerst mit 800 l 80% ACN in 0,2% Ameisensäure und 19,8% Wasser, dann mit 400 l der gleichen Lösung. Trocknen Sie die entsalzten Peptidproben vollständig in einem Vakuumkonzentrator (2-3 h).
3. Gleichzeitige Anreicherung von K-acetylierten und K-sprägolylierten Peptiden mit Immunaffinitätsperlen
- Die getrockneten Peptide in 1,4 ml kaltem 1x Immun-Affinitätsreinigungspuffer (IAP) wieder aufhängen. Wirbel zum Mischen und Sicherstellen eines pH-Werts von 7 €. Zentrifugenproben bei 10.000 x g für 10 min bei 4 °C. Es kann ein kleines Pellet erscheinen.
- Peptide bei der Herstellung von Antikörperperlen auf Eis beiseite legen. Zu einem Röhrchen K-Acetyl und Tube K-Succinyl-Antikörper-Perlenschlämme (Volumen: 100 l Gülle pro Tube) 1 ml kalte 1x phosphatgepufferte Salin (PBS) hinzufügen und durch Pipettieren mischen. Übertragen Sie die gesamte Lösung auf ein neues 1,5 ml Rohr und drehen Sie in einer Miniaturzentrifuge für 30 s bei RT.
- Aspirieren Sie die PBS, achten Sie darauf, keine Perlen abzusehen. Wiederholen Sie die Wäsche 3x, indem Sie sie erneut mit 1 ml kaltem 1x PBS waschen, bei RT für 30 s zentrifugieren und das PBS abhalten.
- Die Perlen in ca. 440 L PBS wieder aussetzen. Ein Viertel der Anzahl der Perlen in jeder PTM-Röhre (100 l, vom Hersteller zur Verfügung gestellt) wird für die Ein-Topf-Anreicherung verwendet (ca. 62,5 g jedes immobilisierten Antikörpers für K-Acetyl- und K-Succinyl-Antikörperperlen). Pipette die Perlen mehrmals gut mischen. Entfernen Sie 100 l Acetyl-Lysin-Antikörperperlen und übertragen Sie sie in eine Röhre mit 200 l vorgeschnittenen Spitzen, um sicherzustellen, dass die Mastermischung durchgängig gut gemischt bleibt.
- Tun Sie das gleiche mit den Succinyl-Lysin-Antikörper-Perlen, indem Sie 100 L Succinyl-Lysin-Antikörper-Perlen in die Röhre entfernen, um gleiche Teile des Acetyl-Lysin-Antikörpers und Succinyl-Lysin-Antikörper in jedem Rohr zu erreichen. Drehen Sie für 30 s in einer Miniaturzentrifuge und aspirieren Sie Medien mit Gelladerspitze (Perlen werden weiß).
HINWEIS: Jedes Rohr sollte ein ähnliches Perlenpellet an der Unterseite haben. - Das resuspendierte Peptid direkt auf die gewaschenen Perlen pfeifen. Achten Sie darauf, Pellets zu vermeiden (schnell hinzufügen, um das Austrocknen der Perlen zu vermeiden). Die Peptide mit Perlen bei 4 °C über Nacht mit Rührung inkubieren.
4. Elution der Peptide, die an Antikörperperlen gebunden sind
- Drehen Sie die Peptidproben bei 2.000 x g für 30 s bei 4 °C. Entfernen Sie den Überstand, der ungebundene Peptide enthält, und speichern Sie ihn bei zukünftigen Experimenten, falls gewünscht. Fügen Sie 1 ml kalten 1x IAP Puffer zu den Perlen zu waschen und mischen, indem Sie 5x invertieren. Drehen Bei 2.000 x g für 30 s bei 4 °C. Apirieren Sie die IAP-Lösung und wiederholen Sie den IAP-Waschschritt 1x für insgesamt zwei Waschungen.
- 1 ml kaltes HPLC-Wasser in die Perlen geben und 5x invertieren. Drehen Bei 2.000 x g für 30 s bei 4 °C. Aspirieren Sie das Wasser. Wiederholen Sie den Wasserwaschschritt zweimal für insgesamt drei Wäschen. Drehen Sie eine zusätzliche Zeit bei 2.000 x g für 30 s bei 4 °C, um das verbleibende Wasser im Boden des Rohres zu sammeln. Saugen Sie zusätzliches Wasser ab, das sich mit flachen Gelladerspitzen gesammelt haben könnte. Achten Sie darauf, die Perlen nicht zu beaspirieren.
- Fügen Sie den Perlen 55 l 0,15 % Trifluoressigsäure in Wasser hinzu. Inkubieren Sie die Perlen für 10 min bei RT, während gelegentlich tippen Sie auf den Boden des Rohres zu mischen. Drehen Sie die Perlen bei RT für 30 s in einer Miniaturzentrifuge. Entfernen Sie die eluierten Peptide und legen Sie sie mit einer flachen Gel-Ladespitze beiseite.
- Fügen Sie den Perlen 45 l 0,15 % Trifluoressigsäure in Wasser hinzu. 10 min bei RT inkubieren, während Sie gelegentlich auf den Boden des Rohres tippen, um es zu mischen. Drehen Sie die Perlen bei RT für 30 s in einer Miniaturzentrifuge. Entfernen Sie die zweite Elution mit einer flachen Gel-Ladespitze und kombinieren Sie sie mit der ersten Elution.
- Drehen Sie die kombinierten eluierten Peptide bei 12.000 x g für 5 min bei RT, um alle Perlen, die übertragen, zu pellet. Übertragen Sie die Peptide-Probenlösung in ein neues 500-L-Rohr.
HINWEIS: Das Protokoll kann hier angehalten werden.
5. Entsalzung angereicherter Peptide
HINWEIS: Der pH-Wert der Proben sollte kleiner als 4 sein, um eine optimale Bindung an die Spitze zu erhalten, die C18-Harz enthält. Verwenden Sie eine Pipette-Spitze von 10 l, die 0,6 l C18-Harz und eine 10-L-Pipette enthält, um die Spitze zu steuern.
- Die C18-Spitze vorbefeuchten, indem man 10 l Acetonitril in die Spitze eingibt. Acetonitril in den Abfall geben. Wiederholen Sie diesen Schritt noch zwei Weitere Male.
- Die Spitze ausdemieren, indem man 3x mit 10 l 0,2% Ameisensäure in Wasser wäscht. Geben Sie die Lösung nach jedem Ausgleich in den Abfall.
- Peptide aus der Probe auf die Spitze laden, indem Sie kontinuierlich mit der Spitze angereicherte Peptidproben pipetieren und dosieren. Pipette nach oben und unten immer wieder mindestens 20x und geben Sie die restliche Lösung von der Spitze.
- Waschen Sie die Spitze mit gebundenem Peptid mit 10 l 0,2% Ameisensäure in Wasser. Abgabe lösungsdurchbringen in Den Abfall. Wiederholen Sie diesen Schritt 9x.
- Elute Peptide in ein neues Rohr mit 10 l eines Elutionspuffers, der 0,2% Ameisensäure, 50% Acetonitril und 49,8% Wasser enthält. Wiederholt Pipetten und geben Sie die 10 l Lösung innerhalb des neuen Rohres 15x. Wiederholen Sie diesen Schritt mit einem zusätzlichen Elutionspuffer von 10 l, der wiederholt in das gleiche Rohr wie die vorherige Elution pipet.
- Trockene Peptide vollständig im Vakuumkonzentrator (ca. 20 min). Die getrockneten Peptide in einem entsprechenden Volumen von 0,2% Ameisensäure in Wasser wieder aufsetzen.
HINWEIS: Das Protokoll kann hier angehalten werden.
6. Datenerfassung mit DDA und DIA
HINWEIS: Analysieren Sie die Proben mit DDA- und DIA LC-MS/MS-Methoden, die je nach verfügbarem massenspektrometrischen Instrument angepasst werden können. Hier wurden die Proben mit einem nano-LC 2D HPLC-System analysiert, das an ein hochauflösendes Massenspektrometer gekoppelt ist.
- Verwenden Sie ein HPLC-System in Kombination mit einem chipbasierten Plattform-HPLC-System, das direkt mit einem Massenspektrometer verbunden ist (viele LC-MS-Konfigurationen und -Systeme können auch verwendet werden).
- Analyse von Proben mit Reverse-Phase HPLC-ESI-MS/MS
- Nach der Injektion die Peptidmischungen auf einen C18-Vorsäulenchip übertragen und die Peptide durch Waschen mit mobiler Phase A bei 2 l/min für 10 min entsalzen. Übertragen Sie dann die Peptide in eine analytische Säule und werden sie mit einer Durchflussrate von 300 nL/min mit einem 2-3 h Gradienten mit den mobilen Phasen A und B entfernt. Verwenden Sie insbesondere einen linearen Gradienten von 5% mobileR Phase B bis 35% mobile Phase B über 80 min.
- Anschließend die mobile Phase B auf 80% über 5 min hochfahren und dann 80% B für 8 min halten, bevor sie für eine 25 min Re-Gleichgewicht auf 5% B zurückkehrt.
- Erstellen einer MS-Instrumentenmethode für DDA und Definieren der folgenden Instrumentenscanexperimente
- Experiment 1: MS1-Vorläuferionenscan von m/z 400-1.500 (Akkumulationszeit von 250 ms). Legen Sie den Intensitätsschwellenwert fest, um MS/MS-Scans für Ionen der Ladungszustände 2-5 bis 200 zu auslösen. Stellen Sie den dynamischen Ausschluss von Vorläuferionen auf 60 s ein.
- Experiment 2: MS/MS-Produktionenscan mit einem MS2-Scanbereich von m/z 100-1.500 (Akkumulationszeit von 100 ms pro 30-Produkt-Ionen-Scan pro Zyklus). Stellen Sie die Kollisionsenergiestreuung auf CES = 5 ein, und wählen Sie dann den "Hochempfindlichkeits-Produkt-Ionen-Scan-Modus" aus.
HINWEIS: Die DDA-Methode erfasst MS/MS-Spektren für die 30 am häufigsten vorkommenden Vorläuferionen nach jedem Vermessungs-MS1-Scan pro Zyklus, und die Gesamtzykluszeit beträgt 3,3 s. DDA-Erfassungen werden verwendet, um Spektralbibliotheken zu erstellen, wie in Abschnitt 7 beschrieben.
- Erstellen einer MS-Instrumentenmethode für DIA und Definieren der folgenden Instrumentenscanexperimente.
- Experiment 1: MS1-Vorläuferionenscan von m/z 400-1.250 (Akkumulationszeit von 250 ms) durchführen.
- Experiment 2: Ms/MS-Produktionenscans für 64 variable SWATH-Segmente mit einem MS2-Scanbereich von m/z 100-1.500 (Akkumulationszeit von 45 ms pro 64-Produkt-Ionen-Scan pro Zyklus) durchführen. Stellen Sie die Kollisionsenergiestreuung auf CES = 10 ein, und wählen Sie dann den "Hochempfindlichkeits-Produkt-Ionen-Scan-Modus" aus.
- Verwenden Sie die von Schilling et al.22 beschriebene Erfassungsstrategie 64 des variablen Fensters DIA/SWATH, um eine etikettenfreie Quantifizierung mit einer Gesamtzykluszeit von 3,2 s zu erhalten. Kurz gesagt, wird bei dieser Erfassung anstelle des Q1-Quadrupols, der einen schmalen Massenbereich bis zur Kollisionszelle überträgt, ein breiteres Fenster mit variabler Fensterbreite (5 -90 m/z) in inschritten Schritten über den gesamten Massenbereich (m/z 400 -1.250 mit 64 SWATH-Segmenten mit jeweils 45 ms Akkumulationszeit) übergeben, was eine Zykluszeit von 3,2 s ergibt, die einen MS1-Scan enthält. mit einer Akkumulationszeit von 250 ms).
ANMERKUNG: Die variable Fensterbreite wird entsprechend der Komplexität des typischen MS1-Ionenstroms angepasst, der innerhalb eines bestimmten m/z-Bereichs mit einem variablen Fensterrechneralgorithmus22 beobachtet wird (schmalere Fenster werden im "beschäftigten" m/z-Bereich gewählt, breite Fenster in m/z-Bereichen mit wenigen eluierenden Vorläuferionen). Auf anderen MS-Instrumentenplattformen können andere DIA-Fensterstrategien implementiert werden.
7. Datenanalyse
HINWEIS: Einige Datenanalyseeinstellungen sollten geändert und an das spezifische Experiment angepasst werden. Beispielsweise hängt die ausgewählte Proteindatenbank (FASTA-Datei) von der Art ab, aus der die Probe hergestellt wurde (hier Mus musculus). Im Folgenden wird die Datenanalyse für Mausproben beschrieben, die für acetylierte und prägnante Peptide angereichert sind.
- Verwenden Sie eine MS-Datenbanksuchmaschine, um DDA-Erfassungen zu analysieren. Erstellen Sie eine Datenbanksuchmaschinenmethode wie folgt:
- Für Sample Description Parameter: Wählen Sie "Identifikation" unter Sample Type, wählen Sie "Iodoestic Acid" unter "Cysteine Alkylation", wählen Sie "Trypsin" unter "Digestion" (unter der Annahme C-Terminal-Spaltung bei Lysin und Arginin), wählen Sie "TripleTOF 6600" unter Instrument, unter Spezialfaktoren, überprüfen Sie die Acetylierungsbetonung und Succinylierungsanreicherung, und wählen Sie Mus Mus musculus unter Spezies.
- Für spezifische Verarbeitungsparameter: Wählen Sie unter ID Focus "Biologische Modifikationen" aus, wählen Sie "SwissProt" unter Datenbank, aktivieren Sie "Gründliche ID" unter Suchaufwand, wählen Sie "0.05 (10%)" unter "Detected Protein Threshold" und überprüfen Sie " False Discovery Rate Analysis " unter "Ergebnisqualität"ausführen. Speichern Sie die Suchmaschinenmethode, und senden Sie die massenspektrometrischen Rohdateien zur Verarbeitung durch die Datenbanksuchmaschine mit der generierten Methode.
HINWEIS: In einem iterativen Prozess werden alle MS- und MS/MS-Scans automatisch von der Suchmaschine basierend auf anfänglichen Anmerkungen und Ergebnissen neu kalibriert.
- Klicken Sie nach Abschluss der Suche auf "Peptid-Zusammenfassung exportieren" und filtern Sie alle Peptid-Identifikationsergebnisse durch eine "Vertrauensschwelle" von 99 in einer Tabellenkalkulationssoftware (z. B. Excel; falsche Ermittlungsrate [FDR] von 1 %).
- Filtert in der Tabellentabelle "Peptidzusammenfassung" alle Peptide, die die PTM-Anmerkung "Acetylation" und "Succinylation" in der Modifikationsspalte enthalten, um einen Ergebnisbericht zu generieren, der ausschließlich die acyatierten Peptide und die entsprechenden Proteine präsentiert.
- Um MS/MS-Spektralbibliotheken für die weitere Verarbeitung der DIA-Rohdatei und weitere relative Quantifizierung zu erstellen, öffnen Sie die DIA Quantitative Analysis Software. Wählen Sie die Registerkarte "Bibliothek" aus, klicken Sie dann (am unteren Rand der Seite) auf "Spektralbibliothek generieren" aus "Datenbanksuchmaschine" und öffnen Sie einen Datenbanksuchmaschinen-FDR-Bericht (die *FDR.xlsx-Datei), der automatisch als Teil des DDA-Rohdateidatenbanksuchprozesses generiert wurde. Klicken Sie dann auf"Weiter" und wählen Sie das "LibrarySettings Schema" und "next". Wählen Sie "Uniprot_mouse_proteome" als Datenbank, und klicken Sie dann auf "next" und "goa_mouse" als Datei für die Genanmerkung (Ontologie). Klicken Sie schließlich auf"Fertigstellen", und die Spektralbibliothek wird generiert.
HINWEIS: Informationen über die acetylierten und prägnanten Peptide aus den DDA-Rohdatendateien, Vorläuferionenscans von MS1 und Fragmentionenscans von MS2 werden in die Spektralbibliotheken aufgenommen (dies umfasst Aufbewahrungszeit, MS/MS-Fragmentierungsmuster usw.). - Verwenden Sie die dia quantitative Proteomics-Analysesoftware, um eine relative Quantifizierung der Acetylierungs- und Präsinylierungsniveaus durchzuführen und Tabellen von PTM-haltigen Peptiden zu erstellen, die für weitere Datenanalysen verwendet werden können.
- Um PTM-haltige Peptide zu analysieren und zu quantifizieren, öffnen Sie die DIA Quantitative Analysis Software, verwenden Sie das Vorlagenanalyseschema. Das Vorlagenschema ist in der Software verfügbar, indem Sie die Option "Einstellungsperspektive" | "DIA-Analyse" | "BGS PTMs" (je nach Experiment signifikant oder spärlich).
HINWEIS: Anstatt die BGS PTM-Analysevorlage in der DIA Quantitative Analysis Software zu verwenden, können alle PTM-spezifischen Einstellungen auch manuell nach folgenden Anweisungen eingerichtet werden: 1) unter "Identifikation", wählen Sie "PTM-Lokalisierung" (Wahrscheinlichkeitcutoff = 0,75); 2) in "Quantifizierung", wählen Sie "kleine Peptidgruppierung" | "modifizierte Sequenz"; und 3) unter "Post-Analyse", wählen Sie "Differential-Überfluss-Gruppierung" | "Kleine Gruppe" (Quantifizierungseinstellungen). Diese Einstellungen aktivieren die PTM-Lokalisierungsfunktion, sodass modifizierte Peptide als einzelne Einträge aufgelistet werden und Differentialanalysen auf Peptidebene durchgeführt werden. - Um die Quantifizierungsanalyse zu starten, wählen Sie die Registerkarte "Pipeline" und klicken Sie dann auf "Eine DIA-Analyse aus Datei einrichten", öffnen Sie die von Interesse befindlichen MS DIA-Rohdateien für die relative Quantifizierung. Wählen Sie "Spektralbibliothek zuweisen" und wählen Sie die Bibliothek aus, die oben erstellt wurde, klicken Sie auf "Laden" | "next". Wählen Sie das Analyseschema "BGS PTMs" aus und klicken Sie auf "weiter". Wählen Sie die entsprechende Datenbank-FASTA-Datei "Uniprot_mouse_proteome" | "next". Definieren Sie die Konditionseinstellung, die den Beispielen die verschiedenen Bedingungen zuweist, und klicken Sie auf"Weiter". Wählen Sie "goa_mouse" als Datei für die Genanmerkung (Ontologie) und klicken Sie auf"weiter". Überprüfen Sie die Analyseübersicht (Zusammenfassung der Versuchseinrichtung) und wählen Sie "Ausgabeverzeichnis" | "finish". Klicken Sie schließlich auf "Pipeline ausführen", um die beschriftungsfreie quantitative Analyse durchzuführen.
ANMERKUNG: Statistische Module in der DIA Quantitative Analysis Software führen automatisch FDR-Analysen durch, generieren Wärmekarten und Vulkandiagramme, die die verschiedenen Bedingungen vergleichen, erstellen Listen identifizierter und quantifizierter Peptide und Proteine und Q-Werte zusammen mit relativen Faltenänderungen, die verschiedene Bedingungen vergleichen.
- Um PTM-haltige Peptide zu analysieren und zu quantifizieren, öffnen Sie die DIA Quantitative Analysis Software, verwenden Sie das Vorlagenanalyseschema. Das Vorlagenschema ist in der Software verfügbar, indem Sie die Option "Einstellungsperspektive" | "DIA-Analyse" | "BGS PTMs" (je nach Experiment signifikant oder spärlich).
- Alternativ können Sie Software zum Entfernen von INTERFEREnzen von DIA-Datasets für die Verarbeitung von Daten und die Durchführung statistischer Analysen verwenden, nachdem die extrahierten Spitzenbereiche für Acetylierungs- und Präsinationsstandorte exportiert wurden.
8. Datenvisualisierung modifizierter Peptide und Bewertung der PTM-Standortlokalisierung
- Um eine generierte DIA Quantitative Analysis zu öffnen, wählen Sie die Registerkarte "Analyse" gefolgt von "Laden Sie das quantitative Analysis Software Experiment" (aus einem gespeicherten Experiment, das ein * öffnet. SNE-Datei). Navigieren Sie zum *. SNE-Ergebnisdatei und wählen Sie "öffnen".
- Klicken Sie im linken Bereich auf den Pfeil links neben der dritten Rohdatendatei *.wiff von oben, um alle 64 SWATH-Segmente zu erweitern und zu visualisieren. Klicken Sie auf den Pfeil links neben dem Segment [428.7-437.3], um das spezifische Segment zu erweitern und die für diesen Massenbereich identifizierten modifizierten Peptide anzuzeigen. Klicken Sie auf das dreifach aufgeladene Peptid KQYGEAFEK[Acetyl]R.
HINWEIS: Standardmäßig zeigt das rechte obere Panel in der Regel den MS2 XIC an, und im unteren Bereich wird MS1 Isotope Envelope XIC angezeigt.- Wählen Sie im oberen Bereich "PTM-Lokalisierungsdiagramm" aus. Wählen Sie im unteren Bereich "PTM-Lokalisierungsdiagramm" aus.
- Wählen Sie im PTM-Lokalisierungsdiagramm die obere Peptidsequenz "KQYGEAFEK[Acetyl]R" mit einem gesamten PTM-Lokalisierungswert von 18,32 aus. Klicken Sie auf den Pfeil links, um die Ansicht zu erweitern und die bestätigenden und widerlegungnden Ionen zu visualisieren. Klicken Sie auf den Pfeil neben dem "Bestätigen von Ionen", und wählen Sie dann das Ion "y3 [+42]", um dieses bestimmte Ion hervorzuheben, das bestätigt, dass sich die Acetylierungsstelle auf K2 der Peptidsequenz befindet.
- Wählen Sie im PTM-Lokalisierungsdiagramm die zweite Peptidsequenz "K[Acetyl]QYGEAFEKR" mit einem Gesamt-PTM-Lokalisierungswert von 1 aus. Klicken Sie auf den Pfeil links, um die Ansicht zu erweitern und die bestätigenden und widerlegungnden Ionen zu visualisieren. Klicken Sie auf den Pfeil neben dem "Bestätigen von Ionen", dann auf den Pfeil neben den "Refuting Ions", und wählen Sie dann einige Fragmentionen aus, um das extrahierte Ionenchromatogramm und das MS/MS-Spektren zu visualisieren und zu bewerten ( Abbildung5).
HINWEIS: Der zugewiesene PTM-Lokalisierungs-Score und die visuelle Inspektion zeigen an, dass das richtige PTM-Isomer KQYGEAFEK[Acetyl]R ist, während keine oder nur minimale Beweise für das andere mögliche PTM-Isomer K[Acetyl]QYGEAFEKR vorliegen.
Representative Results
Abbildung 1 zeigt ein allgemeines Diagramm des Arbeitsablaufs, einschließlich der Entnahme des Gewebes aus Derlebern, der Verwendung von 1 mg Protein zur Verdauung des Proteinlysats mit Trypsin, der Inkubation von Peptiden mit antikörperkonjugierten Perlen, dem Erwerb der Proben auf der MS und schließlich der Durchführung einer DIA/SWATH-Analyse der Daten unter Verwendung verschiedener quantitativer Proteomik-Softwarepakete (akademische und kommerzielle).
Abbildung 2A zeigt, wie die Zeitachse des Workflows und die Menge an Proben und Proteinen im Vergleich zu alternativen Methoden, die derzeit für Multi-PTM-Anreicherungsstudien verwendet werden, verglichen sind. Die Ein-Topf-Methode kann in der Hälfte der Zeit und mit der Hälfte der Anzahl der Proben als diese alternativen Methoden durchgeführt werden. Im Vergleich zur zwei Single-PTM-Anreicherungsmethode benötigt das One-Pot-Protokoll auch die Hälfte der Proteinmenge.
Dieses Protokoll hat sich als praktikable und kostengünstige Alternative erwiesen. Abbildung 2B zeigt, dass der Mittlere Variationskoeffizient (CV) für modifizierte Peptidbereiche bei der Ein-Topf-Methode niedriger war als bei den Anreicherungen für Einzelne-PTM und serielle PTM. Abbildung 2C,D zeigt, dass beim Vergleich der Ein-Topf-PTM- und der Ein-PTM-Anreicherungsmethoden keine nennenswerten Unterschiede zwischen den Korrelationen der Quantifizierungen auf Standortebene für die beiden Modifikationen erkennbar waren. Dies galt auch für die Peptid-Ebene und Fragment-Ebene Korrelationen. Die gleiche Beobachtung wurde für alle drei Korrelationen beim Vergleich der Ein-Topf- und Derserien-PTM-Anreicherung engt. Alle zugrunde liegenden MS-Rohdaten und verarbeiteten Excel-Ergebnisblätter, die einem aktuellen Bericht von Basisty et al.14 zugeordnet sind, sind verfügbar und können von MassIVE (MSV00081906) und ProteomeXchange (PXD008640) heruntergeladen werden.
Im Allgemeinen können Antikörperanreicherungsstrategien zwar bestimmte Einschränkungen aufweisen, wie z. B. potenzielle Epitopverschluss oder begrenzte Spezifität, aber die in dieser Studie verwendeten Antikörper sind Mischungen unabhängig erzeugter Klone und bieten somit Besonderheiten.
Experimentelle Ergebnisse dokumentieren die Möglichkeit, PTM-Übersprechen zu erkennen und zu bewerten. Abbildung 3 zeigt Daten aus einer erfolgreichen Anreicherung und zeigt ein Beispiel für ein Peptid, das mehrere und verschiedene Acylmodifikationen enthält, die PTM-Übersprache visualisieren. Abbildung 3A zeigt ein Peptid, das auf einem Lysinrückstand acetyliert und auf dem anderen prägnant ist, und Abbildung 3B zeigt dasselbe Peptid, das bei beiden Lysinen prägnant ist. Dies zeigt, dass derselbe Lysinrückstand mit beiden Acylationsgruppen modifiziert werden kann, und es besteht die Möglichkeit, dass an dieser Stelle ein Übersprechen auftritt. Abbildung 4 zeigt die Anzahl der Lysinrückstände, die wie in den Abschnitten 7.1-7.3 beschrieben identifiziert wurden, um beide Modifikationen zu tragen, was auch auf ein mögliches PTM-Übersprechen hindeutet.
Wie Abbildung 5 zeigt, können wir bei der Verarbeitung von DIA PTM-Datensätzen mit quantitativer Proteomik-Software ermitteln, welche spezifischen Lysinrückstände modifiziert werden. Dies ist ein Konzept, das als Standortlokalisierung bekannt ist, was ein wesentlicher Schritt für jede Analyse zur Bestimmung eines möglichen PTM-Überlaufs ist. Abbildung 5 zeigt zwei potentielle Isoformen zusammen mit den bestätigenden und widerbbenden Ionen für jede, die visualisiert und bewertet werden könnte, wie in den Abschnitten 8.1-8.3 beschrieben (insbesondere die Schritte 8.3.2 und 8.3.3). Auf der Grundlage dieser Informationen konnten wir sicher feststellen, welche der beiden Isoformen in der Originalprobe vorhanden war. Das MS/MS-Spektrum der bestätigten Isoform KQYGEAFEKacR zeigt deutlich, dass die y-Ionen (y2-y5), die den acetylierten Lysinrückstand enthalten, der sich um 42 m/z (die Inkrementmasse einer Acetylgruppe) verschoben hat, den spezifischen Lysinrückstand im modifizierten Peptid bestätigten.
Abbildung 1: Typischer Workflow für die Anreicherung von PTMs mit einem Topf. Gewebe (hier Lebern) werden von SIRT5 KO und Wildtyp (WT) Mäusen geerntet, und Proteine werden lysiert, Trypsin-verdaut in Peptide, und entsalzt. Peptide werden dann durch Immunaffinität mit Kombinationen von Succinyl- und Acetyl-Antikörperperlen angereichert. Parallele MS-Workflows messen sowohl 1) kleine Aliquots von Veränderungen der ganzen Lysatproteinexpression (zur Proteinnormalisierung) als auch 2) angereicherte acylhaltige Peptide zur Identifizierung der Acylierungsstelle (DDA-MS) und der Standortlokalisierung, gefolgt von der Quantifizierung (DIA-MS). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Vergleich des Ein-Topf-Workflows mit alternativen Methoden. (A) Vergleich von Zeit, Kosten und Materialien, die für den Ein-Topf-Workflow, die serielle PTM-Anreicherung und zwei Einzel-PTM-Anreicherungen erforderlich sind. (B) Vergleich von Lebensläufen zwischen dem Ein-Topf-Workflow, der einmaligen Acetyllysin-PTM-Anreicherung und der einzelnen Succinyllysin-PTM-Anreicherung. Spearman-Korrelationsanalyse zum Vergleich der Acylpeptid-Spitzenbereiche, die aus dem Ein-Topf-Workflow gewonnen wurden, und der Ein-PTM-Anreicherung: entsprechende Diagramme der log2-Spitzenflächenergebnisse für (C) Acetylierungsstellen und (D) Prägnannylierungsstellen. Regressionsneigungen und Korrelationsfaktoren sind in den einzelnen Panels14angegeben. Für jede der Bedingungen wurden zwei unabhängige biologische Repliken verarbeitet. Diese Zahl wurde von Basisty et al.14geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Crosstalk zwischen Acetylierung und Präsinylierungsmodifikationen von Lysinrückständen. MS/MS-Spektren tryptischer Peptide aus mitochondrialen 3-Ketoacyl-CoA-Thiolase, die die gleiche Aminosäuresequenz aufweisen, aber bei zwei Lysinrückständen mit unterschiedlichen PTMs modifiziert wurden. (A) MS/MS des Peptids AANEAGYFNEEMAPIEVKsuccTKacK und (B) MS/MS des Peptids AANEAGY Diese Zahl wurde von Basisty et al.14geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Überlappung und Übersprechen zwischen den acetylierten und prägnanten Lysinrückständen – spezifische Beispiele in Proteinkomplexen. (A) Venn-Diagramm mit Überlappung zwischen 2.235 Acetylierung und 2.173 Präsinylierungsstellen. Davon wurden 943 Standorte sowohl acetyliert als auch prägnant. Leber aus einer SIRT5 (De-Succinylase) Knockout-Maus wurde analysiert, und viele Präsinationsstellen wurden identifiziert. Tatsächlich waren sie häufiger als normalerweise in der Mausleber beobachtet (modifizierte Peptide wurden mit einem Q-Wert von <0,05 gefiltert). (B) Proteinkomplexe, die den Prozentsatz ihrer Untereinheiten zeigen, die sowohl acetylierte als auch prägnante Stellen enthalten (fette rote Linie stellt die Bedeutung dar, die durch Fishers genauen Test bestimmt wird). (C) Diagramm des ATP-Synthase-Komplexes: Protein-Untereinheiten in Rot stellen die Untereinheiten dar, die sowohl acetylierte als auch prägnante Stellen enthalten. Diese Zahl wurde von Basisty et al.14geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 5: Quantitative Proteomik-Software entschlüsselt die Lokalisierung der Peptid-Site von PTMs. Basierend auf der MS/MS-Fragmentierung des Peptids ist es möglich, Informationen über die spezifischen Lysinrückstände bereitzustellen, die die Acetylgruppe ändert. Dies zeigt die Fähigkeit der Software, wertvolle Informationen vor Ort Lokalisierung von PTMs bieten. (A) Zwei Möglichkeiten der Lysin-Rückstandsmodifikation und PTM-Standortlokalisierung: KQYGEAFEKacR (links) und KacQYGEAFEKR (rechts). "Bestätigen" und "Widerlegung" Fragmentionen werden für jede der potenziellen Standortlokalisierung isoformen des Peptids gezeigt. Basierend auf diesen Informationen werden bestätigende Und widerlegende Ergebnisse zugewiesen, was das Vorhandensein von Isoform KQYGEAFEKac Rin der Probe bestätigt. (B) MS/MS-Spektrum entsprechend der bestätigten Isoform KQYGEAFEKacR, was darauf hinweist, dass alle y-Ionen einschließlich des acetylhaltigen Lysinrückstands (y2 und höher) eine Inkrementmasse von +42 m/z aufweisen, was der Acetylmodifikation entspricht. Beobachtete b-Ionen enthalten die Modifikation nicht. (C) Extrahiertes Ionenchromatogramm (XIC) mit reichlich Spitzenflächen aus y2 und y3 Ionen, die beide die Acetylierungsstelle in der bestätigten Isoform KQYGEAFEKacR bilden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Discussion
Dieses Protokoll beschreibt eine neuartige Technik zur gleichzeitigen mehrfachen PTM-Anreicherung, um PTM-Übersprechen effektiver zu verstehen. Alternative Methoden zur Erreichung dieses Ziels sind in der Regel unerschwinglich zeitaufwändig und teuer, und sie erfordern große Mengen an Protein, um erfolgreich zu sein11,13. Dieses Protokoll stellt einen Multi-PTM-Anreicherungsworkflow dar, der die Inkubation in antikörperkonjugierten Perlen für zwei PTMs gleichzeitig beinhaltet, um die Gesamteffizienz des Experiments zu verbessern. Diese Methode beinhaltet auch die Verwendung von DDA für die Erzeugung von Spektralbibliotheken und DIA MS-Erfassungen, um die Peptide zu erkennen und zu quantifizieren, die mit reduzierten Interferenzen von Fragmentionen22,23vorhanden sind. Softwareprogramme, wie z. B. MS-Datenbanksuchmaschinen, werden verwendet, um Daten aus DDA-Akquisitionen zu analysieren und zu quantifizieren, während quantitative Proteomics Software24 und spezifische DIA Quantitative Analysis Software25 notwendig sind, um die komplexen Spektren zu interpretieren, die durch DIA-Akquisitionen erzeugt werden.
Es gibt mehrere wichtige Schritte innerhalb dieses Protokolls, die sorgfältig befolgt werden sollten. Da das Hauptziel des Protokolls darin besteht, mehrere PTMs gleichzeitig anzureichern, ist der Anti-Antikörper-Affinitätsanreicherungsschritt (Abschnitt 2) entscheidend für den Erfolg des Experiments. Bei der Durchführung von Wärteilen an den Perlen ist es notwendig, sicherzustellen, dass keine der Perlen versehentlich angesaugt wird. Es ist auch notwendig, dass die Harnstoffkonzentration vor der Verdauung mit Trypsin (Schritt 1.8) auf 1 M verdünnt wurde. Obwohl 8 M Harnstoff früher im Protokoll zur Proteinlöslichkeit benötigt wird, hemmen Harnstoffkonzentrationen über 1 M die enzymatische Aktivität von Trypsin. Darüber hinaus ist es wichtig, den pH-Wert der Probe im gesamten Protokoll konsequent zu überprüfen. Dies ist besonders wichtig vor der Verdauung. Wenn der pH-Wert der Probe und die Trypsin-Lösung vor der Inkubation nicht angemessen neutralisiert werden, kann dies zu einer ineffizienten Verdauung führen, bei der viele Dekolleté-Stellen übersehen werden können, was zu weniger Peptid-Identifikationen führen kann.
Einige Änderungen am Protokoll können beim Vorbereiten von Beispielen hilfreich sein. Für ein Proteinlysat, das aus 1 mg Ausgangsmaterial beschafft wird, kann ein Viertel der in jedem PTM-Scanrohr enthaltenen Antikörperperlen als kostengünstige Alternative verwendet werden. Eine größere Menge an Ausgangsmaterial kann für bessere Ergebnisse verwendet werden, solange die Menge der verwendeten Antikörperperlen proportional erhöht wird. Eine weitere Änderung, die den Workflow verbessern kann, ist, Proben mit einer anderen Protease zusätzlich zu Trypsin zu verdauen. Diese Änderung würde zu einer größeren Variabilität der geklammerten Peptide führen und eine erhöhte Abdeckung von Proteinrückständen bieten. Obwohl nicht notwendig, wird empfohlen, dass Trypsin eines der Enzyme für die PTM-Analyse aufgrund seiner hohen Spaltungssspezifität26sein sollte.
Eine Einschränkung dieses Protokolls besteht darin, dass die untersuchten PTMs ähnliche Chemikalien benötigen, um gleichzeitig angereichert zu werden14. Die Verfahren für die verschiedenen Antikörperkonjugatierten Perlen müssen ähnlich sein und ähnliche Lösungsmittel und Lösungen, einschließlich ähnlicher Elutionsbedingungen, und vorzugsweise vom gleichen Anbieter verwenden. Aus diesem Grund verwendet die hier skizzierte Methode konsequent Acetylierung und Prägnantierung als Beispiel, die beide antikörperkonjugierte Perlen verwenden (Cell Signaling Technology, Inc). Obwohl diese Methode theoretisch auf eine beliebige Anzahl von PTM angewendet werden kann, wären zusätzliche Studien erforderlich, um die genaue Einschränkung des Protokolls in dieser Hinsicht zu bewerten. Da es sich um eine Antikörper-basierte Anreicherungsmethode handelt, kann die Methode nur eine relative Quantifizierung von PTM-Standorten ermöglichen.
Im Vergleich zu bestehenden Multi-PTM-Anreicherungsmethoden ist dieser Workflow eine praktikablere und kostengünstigere Alternative. Aus diesem Experiment wurde festgestellt, dass die Wirksamkeit dieser Methode sehr gut mit alternativen Methoden wie individuellen oder seriellen Anreicherungen verglichen wird. Abbildung 2B zeigt, dass der mediane CV für modifizierte Peptidspitzenbereiche im Ein-Topf-Verfahren im Vergleich zu Ein-PTM-Anreicherungen und seriellen PTM-Anreicherungen13tatsächlich verringert wurde. Wir analysierten weiter die experimentellen Ergebnisse, die Quantifizierungen auf Standortebene für Acetylierung oder Präsination bewerten. Darüber hinaus zeigte die Spearman-Korrelationsanalyse (Abbildung 2C,D) , dass die PTM-Anreicherung mit einem Topf ähnlich wie die Single-PTM-Anreicherungs-Workflows abspielte. Dies galt auch für die Peptid- und Fragment-Korrelationen. Die gleiche Beobachtung wurde für alle drei Korrelationen beim Vergleich von Ein-Topf mit serieller PTM-Anreicherung durchgeführt.
Dieses Protokoll ermöglicht es Forschern, faszinierende biologische Einblicke in PTM-Übergespräche auf schnelle und kostengünstige Weise zu machen. Die DIA-Komponente des Workflows ermöglicht es Forschern, mehr über PTMs zu verstehen, da sie Informationen über die Standortlokalisierung liefert und Herausforderungen wie die geringe Auslastung von PTMs vor Ort bewältigt. Vorläuferionen werden mit DDA tendenziell ausgeschlossen, was besonders wichtig ist, wenn ptMs untersucht werden, da die Auslastung der Standorte oft so niedrig ist, dass diese Peptide nicht für MS/MS ausgewählt werden, aber dennoch wichtige Informationen enthalten. Nachholexperimente könnten durchgeführt werden, um die Obergrenze zu bewerten, wie viele PTMs mit dieser Methode gleichzeitig angereichert werden können. Eine zukünftige Verbesserung dieses Workflows kann die Entwicklung fortschrittlicherer Softwareplattformen umfassen, um die Analyse der Standortlokalisierung und der Auslastung der PTM-Standorte weiter zu automatisieren.
Disclosures
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Acknowledgments
Wir würdigen die Unterstützung durch den NIH Shared Instrumentation Grant für das TripleTOF-System am Buck Institute (1S10 OD016281). Diese Arbeit wurde auch vom National Institute of Allergy and Infectious Disease (R01 AI108255 bis B.S.) und dem National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases (R24 DK085610 an Eric Verdin; R01 DK090242 an Eric Goetzman). X.X. wurde durch ein Stipendium der National Institutes of Health (NIH-Stipendium T32GM8806, an Judith Campisi und Lisa Ellerby) unterstützt, N.B. wurde durch ein Postdoktorandenstipendium der Glenn Foundation for Medical Research unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 M Triethylammonium biocarbonate buffer (TEAB) | Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA | T7408 | |
| Acetonitrile, Burdick and Jackson LC-MS grade | Burdick and Jackson, Muskegon, MI, USA | 36XL66 | |
| Bioruptor sonicator | Diagenode, Denville, NJ, USA | B01020001 | |
| C18 pre-column chip (200 µm x 6 mm ChromXP C18-CL chip, 3 um, 120 A) | SCIEX, Framingham, MA, USA | 5015841 | |
| C18-CL chip (75 µm x 15 cm ChromXP, 3 µm, 300 Å) | SCIEX, Framingham, MA, USA | 804-00001 | |
| Dithiothreitol (DTT) | Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA | D9779-5G | |
| Eppendorf Thermomixer Compact | Eppendorf AG, Hamburg, Germany | T1317-1EA | |
| Eppendorf Tube (2.0 mL Safelock) | Eppendorf AG, Hamburg, Germany | 22363352 | |
| Formic acid | Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA | F0507-500ML | |
| Indexed retention time (iRT) normalization peptide standard | Biognosys AG, Schlieren, Zurich, Switzerland | Ki-3002-2 | |
| Iodoacetamide (IAA) | Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA | I1149-25G | |
| mapDIA | web link | software for interference removal of DIA datasets | |
| Methanol, Burdick and Jackson LC-MS grade | Burdick and Jackson, Muskegon, MI, USA | BJLC230-4 | |
| PURELAB flex 1 ultrapure water dispenser | VWR International, Radnor, PA, USA | 89204-088 | |
| mProphet in Skyline | incorporated in Skyline | integrated statistical algorithms for FDR assessments | |
| Oasis HLB SPE cartridges | Waters Corp., Milford, MA, USA | WAT094225 | cartridges for desalting protein lysates, up to 50 mg material |
| Phosphate buffered saline solution | Life Technologies | 10010023 | |
| Pierce BCA Assay | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | 23225 | |
| ProteinPilot 5.0 - 'MS database search engine' | SCIEX, Framingham, MA, USA | software download SCIEX | MS database search engine |
| PTMScan Succinyl-Lysine Motif [Succ-K] Kit #13764 | Cell Signaling Technology | 13764 | antibody beads for affinity enrichment |
| PTMScan Acetyl-Lysine Motif [Ac-K] Kit #13416 | Cell Signaling Technology | 13416 | antibody beads for affinity enrichment |
| Sequencing-grade lyophilized trypsin | Life Technologies | 23225 | |
| Skyline - 'Quantitative Proteomics Software' | MacCoss lab (academic) | open source software | Quantitative Proteomics Software (academic) |
| Spectronaut - 'DIA Quantitative Analysis Software' | Biognosys AG, Schlieren, Zurich, Switzerland | Sw-3001 | DIA Quantitative Analysis Software / PTM site localization |
| Thermo Scientific Savant SPD131DDA Speedvac Concentrator | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | SPD131DDA-115 | instrument to concentrate liquid volume of samples |
| TissueLyser II | Qiagen, Hilden, Germany | 85300 | instrument for efficient lysis of tissue |
| Trifluoroacetic acid (TFA) | Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA | T6508-1L | |
| TripleTOF 6600: orthoganol quadrupole time-of-flight (QqTOF)mass spectrometer | SCIEX, Framingham, MA, USA | Per quote | high resolution mass spectrometer |
| Ultra Plus nano-LC 2D HPLC system | SCIEX, Eksigent Division, Framingham, MA, USA | Model #845 | chromatographic separation system |
| Urea | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | PI29700 | |
| Water, Burdick and Jackson LC-MS | Burdick and Jackson, Muskegon, MI, USA | 600-30-76 | |
| ZipTip C18 Pipette Tips, P10 | Merck Millipore Ltd, Tullagreen, Carrigtwohill, Co. Cork, IRL | ZTC18S096 | C-18 resin loaded tips for desalting of peptide mixtures |
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