Præklinisk hjerteelektrofysiologivurdering ved dobbelt spænding og calciumoptisk kortlægning af humane organotypiske hjerteskiver
Summary
Denne protokol beskriver proceduren for dyrkning og dyrkning af menneskelige hjerteskiver til præklinisk lægemiddeltest og beskriver brugen af optisk kortlægning til registrering af transmembranespænding og intracellulære calciumsignaler samtidigt fra disse skiver.
Abstract
Human hjerte skive præparater er for nylig blevet udviklet som en platform for human fysiologi undersøgelser og terapi test for at bygge bro mellem dyr og kliniske forsøg. Talrige dyre- og cellemodeller er blevet brugt til at undersøge virkningerne af narkotika, men disse reaktioner er ofte forskellige hos mennesker. Menneskelige hjerte skiver giver en fordel for test af lægemidler i, at de er direkte afledt af levedygtige menneskelige hjerter. Ud over at have bevaret flercellede strukturer, celle-celle kobling, og ekstracellulære matrix miljøer, kan humant hjertevæv skiver bruges til direkte at teste effekten af utallige lægemidler på voksne menneskelige hjertefysiologi. Hvad adskiller denne model fra andre hjerte præparater, såsom hele hjerter eller kiler, er, at skiver kan blive udsat for mere langsigtet kultur. Som sådan, hjerte skiver mulighed for at studere de akutte såvel som kroniske virkninger af narkotika. Endvidere, evnen til at indsamle flere hundrede til tusind skiver fra et enkelt hjerte gør dette til en high-throughput model til at teste flere lægemidler i varierende koncentrationer og kombinationer med andre lægemidler på samme tid. Skiver kan fremstilles fra en given region af hjertet. I denne protokol beskriver vi forberedelsen af venstre ventrikelskiver ved at isolere vævsterninger fra venstre ventrikelfri væg og skære dem i skiver ved hjælp af en højpræcisions vibrerende mikrotom. Disse skiver kan derefter enten blive udsat for akutte eksperimenter til at måle baseline hjerte elektrofysiologiske funktion eller dyrkes for kroniske lægemiddelundersøgelser. Denne protokol beskriver også dobbelt optisk kortlægning af hjerteskiver til samtidige registreringer af transmembrane potentialer og intracellulære calciumdynamik for at bestemme virkningerne af de lægemidler, der undersøges.
Introduction
Dyremodeller har været et værdifuldt redskab, der anvendes til at forstå de underliggende mekanismer i menneskers fysiologi og patofysiologi, samt en platform for indledende test af behandlinger til behandling af forskellige sygdomme1. Der er gjort store fremskridt inden for biomedicinsk forskning baseret på disse dyreforsøg2. Der er dog betydelige forskelle mellem forskelligearter mellem humane og animalske fysiologier, herunder mus, rotter, marsvin, kaniner, får, svin og hunde3,4. Som et resultat, der har været mange lægemidler, gen, og celle behandlinger, der viste lovende under dyreforsøg fase, men undlod at leve op til resultaterne i kliniske forsøg5. At bygge bro over denne kløft, isolerede hjerte myocytter og human induceret pluripotente stamceller (iPSCs) blev udviklet som modeller til at teste reaktionen af human fysiologi til forskellige lægemidler og sygdomme6. Stamcelleafledte kardiomyocytter har været meget udbredt i organ-on-a-chip systemer som et surrogat for hjertet6,7,8. Nytten af iPSC-afledte kardiomyocytter (iPSC-CMs) hæmmes imidlertid af deres relativt umodne fænotype og den manglende repræsentation af kardiomyocyt-delpopulationen. det modne myokardi er en kompleks struktur bestående af flere samektiske celletyper såsom fibroblaster, neuroner, makrofager og endotelceller. På den anden side, isolerede menneskelige kardiomyocytter er elektrisk modne, og forskellige cardiomyocyt subpopulationer kan opnås ved at ændre dyrkning parametre9. Stadig, disse myocytter generelt udviser ændret handling potentielle morfologier på grund af manglen på celle-celle kobling, hurtig afdædisisering, og forekomsten af proarytmisk adfærd in vitro10,11. Nogle af begrænsningerne blev behandlet af 3D cellekultur modeller af iPSC-CMs og hjerte myocytter. Disse modeller, som omfatter sfæroider, hydrogel stillads indkapslet 3D-kulturer, manipuleret hjertevæv (EHTs), og hjerte-på-en-chip-systemer, bruge flere hjertecellepopulationer såsom kardiomyocytter, fibroblaster, og endotelceller. De enten selvsamle eller samle langs et stillads til at danne 3D-strukturer, og nogle endda reproducere den komplekse anisotropiske karakter af myokardiet. Disse modeller er blevet rapporteret at have celler af modne fænotyper, kontraktile egenskaber, og molekylære profiler svarende til hjertevæv. Hjerte-på-en-chip-systemet giver også mulighed for at studere systemiske virkninger i test af lægemidler og sygdomsmodeller. In vitro-cellebaserede modeller mangler imidlertid den oprindelige ekstracellulære matrix og kan derfor ikke nøjagtigt efterligne elektrofysiologi på organniveau. Menneskelige hjerte skiver, derimod, har en intakt ekstracellulær matrix og indfødte celle-til-celle kontakter, hvilket gør dem nyttige for mere præcist at undersøge arytmogene egenskaber af det menneskelige myokardi.
Forskere har udviklet humane karditoypiske skiver som en fysiologisk præklinisk platform for akut og kronisk lægemiddeltest og til at studere hjerteelektrofysiologi og hjertesygdomsprogression12,13,14,15,16,17,18,19. Sammenlignet med iPSC-afledte kardiomyocytter replikerer humane hjerteskiver mere trofast voksne humane hjerteelektrofysiologi med en moden kardiomyocytfænotype. Sammenlignet med isolerede humane kardiomyocytter udviser hjerteskiver fysiologiske virkningsgrader på grund af den velbevarede cellecellekobling og den iboende eksistens af deres oprindelige intra- og ekstracellulære miljøer.
Denne protokol beskriver processen med at generere menneskelige hjerteskiver fra hele donorhjerter, udføre akut (dvs. timer lange) og kroniske (dvs. dage lange) undersøgelser for at teste hjerteelektrofysiologi parametre via optisk kortlægning. Mens denne protokol beskriver kun brugen af venstre ventrikelvæv (LV), er det blevet anvendt med succes på andre områder af hjertet samt andre arter såsom mus, rotter, marsvin og svin14,,20,,21,22. Vores laboratorium bruger hele menneskelige donor hjerter, der er blevet afvist til transplantation i de sidste 5 år, men det er muligt for de samme procedurer, der skal udføres på enhver donor hjerte prøve væv opnået ved hjælp af alternative midler (f.eks venstre venttrikulær hjælpeenhed [LVAD] implantationer, biopsier, myectomies), så længe væv har evnen til at blive opdelt i terninger. Optisk kortlægning anvendes til analyse i denne undersøgelse på grund af sin evne til samtidig at kortlægge optiske actionpotentialer og calciumtransienter med høj rumlig (100 x 100 pixels) og tidsmæssig (>1.000 frames/s) opløsning. Alternative metoder kan også anvendes, såsom multielektrode arrays (MEAs) eller mikroelektroder, men disse teknikker er begrænset af deres relativt lave rumlige opløsninger. Derudover blev MEA’er designet til brug sammen med cellekulturer, og skarpe mikroelektroder håndteres lettere til brug med hele hjerter eller store vævskiler.
Målet med artiklen er at gøre det muligt for flere forskere at bruge humane hjertevæv til hjerteelektrofysiologiundersøgelser. Det skal bemærkes, at den teknologi, der er beskrevet i denne artikel er relativt enkel og gavnlig for kortsigtede undersøgelser (i størrelsesordenen flere timer til dage). Mere fysiologisk biomimetisk kultur for længerevarende undersøgelser (i ugerækkefølgen) er blevet drøftet og beskrevet i en række andre undersøgelser12,18,23. Elektrisk stimulation, mekanisk belastning, og væv stretching er fordelagtige konditionering mekanismer, der kan hjælpe med at begrænse starten af in vitro væv remodellering12,,18,23.
Protocol
Representative Results
Discussion
Her præsenterer vi trin-for-trin metoder til at opnå levedygtige hjerte skiver fra kardioplegically anholdt menneskelige hjerter og funktionelt karakterisere skiver ved hjælp af dobbelt optisk kortlægning af transmembrane potentiale og intracellulære calcium. Med bevaret ekstracellulært miljø og native celle-celle kobling, kan menneskelige hjerteskiver bruges som en nøjagtig model af det menneskelige hjerte for grundlæggende videnskabelig opdagelse og for effektivitet og kardiotoksicitet test af farmakologiske a…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Støtte fra NIH (tilskud R21 EB023106, R44 HL139248 og R01 HL126802), af Leducq foundation (projekt RHYTHM) og en American Heart Association Postdoctoral Fellowship (19POST34370122) er taknemmeligt anerkendt.
Materials
| 1mL BD Syringe | Thomas Scientific | 309597 | |
| 2,3-butanedione monoxime | Sigma-Aldrich | B0753 | |
| 6 well culture plates | Corning | 3516 | |
| Biosafety cabinet | ThermoFisher Scientific | 1377 | |
| Blebbistatin | Cayman | 13186 | |
| Bubble Trap | Radnoti | 130149 | |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | C1016 | |
| Corning Cell Strainers | Fisher Scientific | 07-201-432 | |
| Di-4-ANEPPS | Biotium | stock solution at 1.25 mg/mL in DMSO | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| Dumont #3c Forceps | Fine Science Tools | 11231-20 | |
| Emission dichroic mirror | Chroma | T630LPXR-UF1 | |
| Emission filter (RH237) | Chroma | ET690/50m | |
| Emission Filter (Rhod2AM) | Chroma | ET590/33m | |
| Excitation dichroic mirror | Chroma | T550LPXR-UF1 | |
| Excitation Filter | Chroma | ET500/40x | |
| Falcon 50mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 14-959-49A | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| Heat exchanger | Radnoti | 158821 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Incubator | ThermoFisher Scientific | 50145502 | |
| Insulin Transferrin Selenium (ITS) | Sigma-Aldrich | I3146 | |
| LED excitation light source | Prizmatix | UHP-Mic-LED-520 | |
| Magnessium chloride hexahydrate | Sigma-Aldrich | M9272 | |
| Medium 199 | ThermoFisher Scientific | 11150059 | |
| Micam Ultima L type CMOS camera | Scimedia | N/A | |
| Minutien Pins | Fine Science Tools | 26002-10 | |
| Pennicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | |
| Peristaltic Pump | Cole Parmer | EW-07522-20 | |
| Platinum pacing wire | Alfa Aesar | 43275 | |
| Pluronic F127 | ThermoFisher Scientific | P6867 | nonionic, surfactant polyol |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P3911 | |
| Powerlab data acquisition and stimulator | AD Instruments | Powerlab 4/26 | |
| RH237 | Biotium | 61018 | |
| Rhod2AM | ThermoFisher Scientific | R1245MP | |
| Rhod-2AM | Invitrogen, Carlsbad, CA | ||
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S6014 | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S9625 | |
| Sterilizer, dry bead | Sigma-Aldrich | Z378550 | |
| Stone Oxygen Diffuser | Waterwood | B00O0NUVM0 | |
| TissueSeal – Histoacryl Topical Skin Adhesive | gobiomed | AESCULAP | |
| UltraPure Low Melting Point Agarose | Thermo Fisher Scientific | 16520100 | |
| Ultrasound sonicator | Branson 1800 | ||
| Vibratome | Campden Instruments | 7000 smz |
References
- Ericsson, A. C., Crim, M. J., Franklin, C. L. A brief history of animal modeling. Missouri Medicine. 110 (3), 201-205 (2013).
- Choudhary, A., Ibdah, J. A. Animal models in today’s translational medicine world. Missouri Medicine. 110 (3), 220-222 (2013).
- Perlman, R. L. Mouse models of human disease: An evolutionary perspective. Evolution, Medicine, and Public Health. 2016 (1), 170-176 (2016).
- Milani-Nejad, N., Janssen, P. M. L. Small and large animal models in cardiac contraction research: advantages and disadvantages. Pharmacology & Therapeutics. 141 (3), 235-249 (2014).
- Green, A. R. Why do neuroprotective drugs that are so promising in animals fail in the clinic? An industry perspective. Clinical and Experimental Pharmacology and Physiology. 29 (11), 1030-1034 (2002).
- Shinnawi, R., Gepstein, L. iPCS cell modeling of inherited cardiac arrhythmias. Current Treatment Options in Cardiovascular Medicine. 16 (9), 331 (2014).
- Morimoto, Y., Mori, S., Sakai, F., Takeuchi, S. Human induced pluripotent stem cell-derived fiber-shaped cardiac tissue on a chip. Lab on a Chip. 16 (12), 2295-2301 (2016).
- Wang, G., et al. Modeling the mitochondrial cardiomyopathy of Barth syndrome with induced pluripotent stem cell and heart-on-chip technologies. Nature Medicine. 20 (6), 616-623 (2014).
- Ben-Ari, M., et al. Developmental changes in electrophysiological characteristics of human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Heart Rhythm. 13 (12), 2379-2387 (2016).
- Goversen, B., van der Heyden, M. A. G., van Veen, T. A. B., de Boer, T. P. The immature electrophysiological phenotype of iPSC-CMs still hampers in vitro drug screening: Special focus on IK1. Pharmacology & Therapeutics. 183, 127-136 (2018).
- Zhang, Y., et al. Dedifferentiation and proliferation of mammalian cardiomyocytes. PloS One. 5 (9), 12559 (2010).
- Watson, S. A., et al. Biomimetic electromechanical stimulation to maintain adult myocardial slices in vitro. Nature Communications. 10, 2168 (2019).
- Fischer, C., et al. Long-term functional and structural preservation of precision-cut human myocardium under continuous electromechanical stimulation in vitro. Nature Communications. 10, 117 (2019).
- Ou, Q., et al. Physiological Biomimetic Culture System for Pig and Human Heart Slices. Circulation Research. 125 (6), 628-642 (2019).
- Qiao, Y., et al. Multiparametric slice culture platform for the investigation of human cardiac tissue physiology. Progress in Biophysics and Molecular Biology 2. 144, 139-150 (2019).
- Kang, C., et al. Human Organotypic Cultured Cardiac Slices: New Platform For High Throughput Preclinical Human Trials. Scientific Reports. 6, 28798 (2016).
- Camelliti, P., et al. Adult human heart slices are a multicellular system suitable for electrophysiological and pharmacological studies. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 51 (3), 390-398 (2011).
- Brandenburger, M., et al. Organotypic slice culture from human adult ventricular myocardium. Cardiovascular Research. 93 (1), 50-59 (2012).
- Watson, S. A., et al. Preparation of viable adult ventricular myocardial slices from large and small mammals. Nature Protocols. 12 (12), 2623-2639 (2017).
- Halbach, M., et al. Ventricular slices of adult mouse hearts – A new multicellular in vitro model for electrophysiological studies. Cellular Physiology and Biochemistry. 18 (1-3), 1-8 (2006).
- Wang, K., et al. Cardiac tissue slices: preparation, handling, and successful optical mapping. American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 308 (9), 1112-1125 (2015).
- Bussek, A., et al. Cardiac tissue slices with prolonged survival for in vitro drug safety screening. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 66 (2), 145-151 (2012).
- Watson, S. A., Terracciano, C. M., Perbellini, F. Myocardial Slices: an Intermediate Complexity Platform for Translational Cardiovascular Research. Cardiovascular Drugs and Therapy. 33 (2), 239-244 (2019).
- Rouwkema, J., Koopman, B. F. J. M., Blitterswijk, C. A. V., Dhert, W. J. A., Malda, J. Supply of nutrients to cells in engineered tissues. Biotechnology and Genetic Engineering Reviews. 26 (1), 163-178 (2009).
- Lang, D., Sulkin, M., Lou, Q., Efimov, I. R. Optical mapping of action potentials and calcium transients in the mouse heart. Journal of Visualized Experiments. (55), e3275 (2011).
- Brianna, C., et al. Open-Source Multiparametric Optocardiography. Scientific Reports. 9, 721 (2019).
- George, S. A., et al. Modulating cardiac conduction during metabolic ischemia with perfusate sodium and calcium in guinea pig hearts. American Journal of Physiology – Heart and Circulatory Physiology. 316 (4), 849-861 (2019).
- Kawara, T., et al. Activation delay after premature stimulation in chronically diseased human myocardium relates to the architecture of interstitial fibrosis. Circulation. 104 (25), 3069-3075 (2001).
- Qu, Y., et al. Action potential recording and pro-arrhythmia risk analysis in human ventricular trabeculae. Frontiers in Physiology. 5 (8), 1109 (2018).
- Franz, M. R., Swerdlow, C. D., Liem, L. B., Schaefer, J. Cycle length dependence of human action potential duration in vivo. Effects of single extrastimuli, sudden sustained rate acceleration and deceleration, and different steady-state frequencies. Journal of Clinical Investigation. 82 (3), 972-979 (1988).
- Lou, Q., et al. Transmural heterogeneity and remodeling of ventricular excitation- contraction coupling in human heart failure. Circulation. 123 (17), 1881-1890 (2011).
