Этот протокол описывает процедуру секционирования и культивирования человеческих сердечных ломтиков для доклинического тестирования на наркотики и подробно описывает использование оптического картирования для записи трансмембранное напряжение и внутриклеточные сигналы кальция одновременно из этих ломтиков.
Препараты сердечного ломтика человека недавно были разработаны в качестве платформы для исследований физиологии человека и тестирования терапии, чтобы преодолеть разрыв между животными и клиническими испытаниями. Многочисленные модели животных и клеток были использованы для изучения последствий наркотиков, но эти ответы часто отличаются у людей. Человеческие сердечные ломтики предлагают преимущество для тестирования на наркотики в том, что они непосредственно получены из жизнеспособных человеческих сердец. В дополнение к сохранению многоклеточных структур, клеточной связи и внеклеточной матрицы среды, человеческие сердечные ткани ломтики могут быть использованы для непосредственного тестирования влияния бесчисленных препаратов на взрослых человека сердечной физиологии. Что отличает эту модель от других препаратов сердца, таких как целые сердца или клинья, является то, что ломтики могут быть подвергнуты долгосрочной культуры. Таким образом, сердечные ломтики позволяют изучать острые, а также хронические эффекты наркотиков. Кроме того, способность собирать от нескольких сотен до тысячи ломтиков из одного сердца делает это высокопроизводительной модели для тестирования нескольких препаратов в различной концентрации и комбинаций с другими препаратами в то же время. Кусочки могут быть подготовлены из любой области сердца. В этом протоколе мы описываем подготовку ломтиков левого желудочка путем изоляции кубиков тканей от левой стены желудочка и срезания их на кусочки с помощью высокой точности вибрирующих микротомов. Эти ломтики могут быть либо подвергнуты острым экспериментам для измерения базовой сердечной электрофизиологической функции или культивируются для хронических исследований наркотиков. Этот протокол также описывает двойное оптическое картирование сердечных ломтиков для одновременных записей трансмембраных потенциалов и внутриклеточной динамики кальция для определения влияния исследуемых препаратов.
Модели животных были ценным инструментом, используемым для понимания основных механизмов физиологии и патофизиологии человека, а также платформой для предварительного тестирования методов лечения различных заболеваний1. Большие успехи были приняты в области биомедицинских исследований на основе этих исследований на животных2. Тем не менее, значительные межвидовые различия существуют между человеческими и животными физиологии, в том числе мышей, крыс, морских свинок, кроликов, овец, свиней и собак3,4. В результате, были многочисленные лекарства, гены и клетки терапии, которые показали обещание во время стадии тестирования на животных, но не оправдали результатов в клинических испытаниях5. Чтобы преодолеть этот разрыв, изолированные сердечные миоциты и индуцированные человеком плюрипотентные стволовые клетки (iPSCs) были разработаны в качестве моделей для проверки реакции физиологии человека на различные препараты и болезни6. Стволовые клетки полученных кардиомиоцитов были широко использованы в орган-на-чип систем в качестве суррогата сердца6,7,8. Однако полезность кардиомиоцитов, полученных из IPSC (iPSC-CMs), затрудняется их относительно незрелым фенотипом и отсутствием представления субпопуляляции кардиомиоцитов; зрелый миокард представляет собой сложную структуру, состоящую из нескольких сосуществующих типов клеток, таких как фибробласты, нейроны, макрофаги и эндотелиальные клетки. С другой стороны, изолированные кардиомиоциты человека являются электрически зрелыми, и различные субпопуляции кардиомиоцитов могут быть получены путем изменения параметров культивирования9. Тем не менее, эти миоциты обычно демонстрируют измененные действия потенциальных морфологии из-за отсутствия клеточной связи, быстрой де-дифференциации, и возникновение проаритмического поведения в пробирке10,11. Некоторые ограничения были рассмотрены 3D-модели клеточной культуры iPSC-CMs и сердечных миоцитов. Эти модели, которые включают сфероиды, гидрогеля эшафот инкапсулированные 3D культуры, инженерии тканей сердца (EHTs), и сердце-на-чип системы, использовать несколько сердечных клеток населения, таких как кардиомиоциты, фибробласты, и эндотелиальных клеток. Они либо самостоятельно собираются, либо собираются вдоль эшафота, чтобы сформировать 3D структуры, а некоторые даже воспроизводят сложную анисотропную природу миокарда. Сообщается, что эти модели имеют клетки зрелых фенотипов, сократительные свойства и молекулярные профили, похожие на сердечную ткань. Система «сердце-на-чип» также позволяет изучать системные эффекты при тестировании на наркотики и моделях заболеваний. Тем не менее, в пробирке на основе клеток модели не имеют родной внеклеточной матрицы и, следовательно, не может точно имитировать электрофизиологии уровня органа. Человеческие сердечные ломтики, напротив, имеют нетронутую внеклеточную матрицу и родные контакты между клетками, что делает их полезными для более точного изучения аритмогенных свойств человеческого миокарда.
Исследователи разработали человеческие сердечные органотипические ломтики в качестве физиологической доклинической платформы для острого и хронического тестирования на наркотики и для изучения сердечной электрофизиологии и прогрессирования сердечных заболеваний12,13,,14,15,16,17,18,19. По сравнению с iPSC-производными кардиомиоцитами, человеческие сердечные ломтики более точно реплицируют взрослую сердечную электрофизиологию сердца человека со зрелым кардиомиоцитом фенотипом. По сравнению с изолированными кардиомиоцитами человека, сердечные ломтики обладают физиологическим потенциалом действия из-за хорошо сохранившейся клеточной связи и внутреннего существования их родной внутри- и внеклеточной среды.
Этот протокол описывает процесс генерации сердечных ломтиков человека из целых донорских сердец, выполняя острые (т.е. часовые) и хронические (т.е. многодневные) исследования для проверки параметров сердечной электрофизиологии с помощью оптического картирования. Хотя этот протокол описывает только использование левой желудочковой (LV) ткани, он был успешно применен к другим регионам сердца, а также других видов, таких как мыши, крысы, морские свинки, и свиньи14,20,21,22. Наша лаборатория использует целые человеческие донорские сердца, которые были отклонены для трансплантации в течение последних 5 лет, но это возможно для этих же процедур, которые будут проводиться на любой донорской ткани образца сердца, полученные альтернативными средствами (например, левый желудочковый аппарат помощи “LVAD” имплантации, биопсии, миэктомии) до тех пор, как ткани имеют возможность быть разделены в кубики. Оптическое картирование используется для анализа в данном исследовании из-за его способности одновременно картировать оптические потенциалы действия и транзитор кальция с высоким пространственным (100 х 100 пикселей) и временным разрешением (1000 кадров/с). Можно также использовать альтернативные методы, такие как многоэлектронные массивы (MEA) или микроэлектроде, но эти методы ограничены относительно низкими пространственными разрешениями. Кроме того, MEAs были разработаны для использования с клеточными культурами, и острые микроэлектроды легче управлять для использования с целыми сердцами или большими клиньями ткани.
Цель статьи состоит в том, чтобы дать возможность большему числу исследователей использовать человеческие сердечные ткани для кардиологических электрофизиологических исследований. Следует отметить, что технология, описанная в данной статье, является относительно простой и полезной для краткосрочных исследований (порядка нескольких часов в дни). Более физиологической биомиметической культуры для долгосрочных исследований (на порядок недель) была обсуждена и описана рядом других исследований12,18,23. Электрическая стимуляция, механическая нагрузка и растяжение тканей являются выгодными механизмами кондиционирования, которые могут помочь ограничить начало ткани in vitro ремоделирования12,,18,,23.
Здесь мы представляем пошаговые методы получения жизнеспособных сердечных ломтиков из кардиоплегически арестованных человеческих сердец и функционально характеризуем ломтики с помощью двойного оптического картирования трансмембрана потенциала и внутриклеточного кальция. С сохра…
The authors have nothing to disclose.
Финансирование NIH (гранты R21 EB023106, R44 HL139248 и R01 HL126802), фондом Leducq (проект RHYTHM) и Американской ассоциацией сердца постдокторской стипендии (19POST34370122) с благодарностью признаны.
1mL BD Syringe | Thomas Scientific | 309597 | |
2,3-butanedione monoxime | Sigma-Aldrich | B0753 | |
6 well culture plates | Corning | 3516 | |
Biosafety cabinet | ThermoFisher Scientific | 1377 | |
Blebbistatin | Cayman | 13186 | |
Bubble Trap | Radnoti | 130149 | |
Calcium chloride | Sigma-Aldrich | C1016 | |
Corning Cell Strainers | Fisher Scientific | 07-201-432 | |
Di-4-ANEPPS | Biotium | stock solution at 1.25 mg/mL in DMSO | |
DMSO | Sigma-Aldrich | D2650 | |
Dumont #3c Forceps | Fine Science Tools | 11231-20 | |
Emission dichroic mirror | Chroma | T630LPXR-UF1 | |
Emission filter (RH237) | Chroma | ET690/50m | |
Emission Filter (Rhod2AM) | Chroma | ET590/33m | |
Excitation dichroic mirror | Chroma | T550LPXR-UF1 | |
Excitation Filter | Chroma | ET500/40x | |
Falcon 50mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 14-959-49A | |
Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
Heat exchanger | Radnoti | 158821 | |
HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
Incubator | ThermoFisher Scientific | 50145502 | |
Insulin Transferrin Selenium (ITS) | Sigma-Aldrich | I3146 | |
LED excitation light source | Prizmatix | UHP-Mic-LED-520 | |
Magnessium chloride hexahydrate | Sigma-Aldrich | M9272 | |
Medium 199 | ThermoFisher Scientific | 11150059 | |
Micam Ultima L type CMOS camera | Scimedia | N/A | |
Minutien Pins | Fine Science Tools | 26002-10 | |
Pennicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | |
Peristaltic Pump | Cole Parmer | EW-07522-20 | |
Platinum pacing wire | Alfa Aesar | 43275 | |
Pluronic F127 | ThermoFisher Scientific | P6867 | nonionic, surfactant polyol |
Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P3911 | |
Powerlab data acquisition and stimulator | AD Instruments | Powerlab 4/26 | |
RH237 | Biotium | 61018 | |
Rhod2AM | ThermoFisher Scientific | R1245MP | |
Rhod-2AM | Invitrogen, Carlsbad, CA | ||
Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S6014 | |
Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S9625 | |
Sterilizer, dry bead | Sigma-Aldrich | Z378550 | |
Stone Oxygen Diffuser | Waterwood | B00O0NUVM0 | |
TissueSeal – Histoacryl Topical Skin Adhesive | gobiomed | AESCULAP | |
UltraPure Low Melting Point Agarose | Thermo Fisher Scientific | 16520100 | |
Ultrasound sonicator | Branson 1800 | ||
Vibratome | Campden Instruments | 7000 smz |