Summary

मानव ऑर्गेनोटिपिक कार्डियक स्लाइस के ड्यूल वोल्टेज और कैल्शियम ऑप्टिकल मैपिंग द्वारा प्रीक्लिनिकल कार्डियक इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी मूल्यांकन

Published: June 16, 2020
doi:

Summary

यह प्रोटोकॉल प्रीक्लिनिकल दवा परीक्षण के लिए मानव हृदय स्लाइस को खंडित करने और बनाने की प्रक्रिया का वर्णन करता है और इन स्लाइस से एक साथ ट्रांसमेम्ब्रान वोल्टेज और इंट्रासेलुलर कैल्शियम संकेतों को रिकॉर्ड करने के लिए ऑप्टिकल मैपिंग के उपयोग का विवरण देता है।

Abstract

मानव हृदय टुकड़ा तैयारी हाल ही में पशु और नैदानिक परीक्षणों के बीच अंतर को पाटने के लिए मानव शरीर विज्ञान अध्ययन और चिकित्सा परीक्षण के लिए एक मंच के रूप में विकसित किया गया है । दवाओं के प्रभावों की जांच करने के लिए कई पशु और सेल मॉडल का उपयोग किया गया है, फिर भी ये प्रतिक्रियाएं अक्सर मनुष्यों में भिन्न होती हैं। मानव हृदय स्लाइस दवा परीक्षण के लिए एक लाभ प्रदान करते हैं कि वे सीधे व्यवहार्य मानव दिलों से प्राप्त होते हैं। संरक्षित बहुकोशिकीय संरचनाओं, सेल-सेल युग्मन, और बाह्य मैट्रिक्स वातावरण होने के अलावा, मानव हृदय ऊतक स्लाइस का उपयोग वयस्क मानव हृदय शरीर विज्ञान पर असंख्य दवाओं के प्रभाव का सीधे परीक्षण करने के लिए किया जा सकता है। क्या इस मॉडल को अन्य दिल की तैयारी से अलग करता है, जैसे कि पूरे दिल या वेजेज, यह है कि स्लाइस को दीर्घकालिक संस्कृति के अधीन किया जा सकता है। जैसे, हृदय स्लाइस दवाओं के तीव्र और साथ ही पुराने प्रभावों का अध्ययन करने के लिए अनुमति देते हैं। इसके अलावा, एक ही दिल से एक हजार स्लाइस के लिए कई सौ इकट्ठा करने की क्षमता यह एक उच्च थ्रूपुट मॉडल बनाता है एक ही समय में अंय दवाओं के साथ अलग सांद्रता और संयोजन पर कई दवाओं का परीक्षण करने के लिए । स्लाइस दिल के किसी भी क्षेत्र से तैयार किया जा सकता है। इस प्रोटोकॉल में, हम बाएं वेंट्रिकुलर मुक्त दीवार से ऊतक क्यूब्स को अलग करके बाएं वेंट्रिकुलर स्लाइस की तैयारी का वर्णन करते हैं और उन्हें एक उच्च सटीक कंपन माइक्रोटॉम का उपयोग करके स्लाइस में विभाजित करते हैं। इन स्लाइस तो या तो बेसलाइन हृदय इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल समारोह को मापने के लिए तीव्र प्रयोगों के अधीन किया जा सकता है या पुरानी दवा अध्ययन के लिए सुसंस्कृत । यह प्रोटोकॉल जांच की जा रही दवाओं के प्रभावों को निर्धारित करने के लिए ट्रांसमेम्ब्रान क्षमता और इंट्रासेलुलर कैल्शियम गतिशीलता की एक साथ रिकॉर्डिंग के लिए कार्डियक स्लाइस के दोहरे ऑप्टिकल मानचित्रण का भी वर्णन करता है।

Introduction

पशु मॉडल मानव शरीर विज्ञान और रोगविज्ञान के अंतर्निहित तंत्र को समझने के लिए उपयोग किया जाने वाला एक मूल्यवान उपकरण रहा है, साथ ही विभिन्न रोगों के इलाज के लिए उपचारों के प्रारंभिक परीक्षण के लिए एक मंच1। इन पशुअध्ययनोंके आधार पर जैव चिकित्सा अनुसंधान के क्षेत्र में काफी प्रगति हुई है । हालांकि, चूहों, चूहों, गिनी सूअरों, खरगोशों, भेड़, सूअरों औरकुत्तों,सहित मानव और पशु शारीरिक विज्ञान के बीच महत्वपूर्ण अंतरप्रजाति मतभेद मौजूदहैं। नतीजतन, कई दवा, जीन और सेल उपचार हुए हैं जिन्होंने पशु परीक्षण चरण के दौरान वादा दिखाया लेकिन नैदानिक परीक्षणों में परिणामों तक खरा बनने में विफल रहे5। इस अंतर को पाटने के लिए, विभिन्न दवाओं औररोगोंके लिए मानव शरीर विज्ञान की प्रतिक्रिया का परीक्षण करने के लिए अलग-अलग कार्डियक मायोसाइट्स और मानव प्रेरित प्लेरिपोटेंट स्टेम सेल (आईपीएससी) को मॉडल के रूप में विकसित किया गया था। स्टेम सेल से व्युत्पन्न कार्डियोमायोसाइट्स का व्यापक रूप से अंग-ऑन-ए-चिप सिस्टम,में हृदय6,,7,8के किराए के रूप में उपयोग किया गया है। हालांकि, आईपीएससी-व्युत्पन्न कार्डियोमायोसाइट्स (आईपीएससी-सीएम) की उपयोगिता उनके अपेक्षाकृत अपरिपक्व फेनोटाइप और कार्डियोमायोसाइट उपजनसंख्या के प्रतिनिधित्व की कमी से बाधित होती है; परिपक्व मायोकार्डियम एक जटिल संरचना है जिसमें फाइब्रोब्लास्ट, न्यूरॉन्स, मैक्रोफेज और एंडोथेलियल कोशिकाओं जैसे कई सह-अस्तित्व वाले सेल प्रकार शामिल हैं। दूसरी ओर, अलग-थलग मानव कार्डियोमायोसाइट्स विद्युत रूप से परिपक्व होते हैं, और विभिन्न कार्डियोमायोसाइट उप-जनसंख्याको 9गुणों को बदलकर प्राप्त किया जा सकता है। फिर भी, ये मायोसाइट्स आम तौर पर सेल-सेल कपलिंग, तेजी से डी-विभेदन, और विट्रो10, 11,में प्रोरेथिक व्यवहार की कमी के कारण कार्रवाई संभावित मॉर्फोलोजी को बदलदेतेहैं। कुछ सीमाओं को आईपीएससी-सीएम और कार्डियक मायोसाइट्स के 3डी सेल कल्चर मॉडल द्वारा संबोधित किया गया था। ये मॉडल, जिनमें स्पेरोइड्स, हाइड्रोगेल पाड़ ने 3डी संस्कृतियों, इंजीनियर हार्ट टिश्यू (ईएचटी) और हार्ट-ऑन-ए-चिप सिस्टम को समझाया, कार्डियोमायोसाइट्स, फाइब्रोब्लास्ट और एंडोथेलियल कोशिकाओं जैसे कई कार्डियक सेल आबादी का उपयोग करें। वे या तो 3 डी संरचनाओं को बनाने के लिए एक पाड़ के साथ स्वयं इकट्ठा होते हैं या इकट्ठा होते हैं, और कुछ मायोकार्डियम की जटिल एनिसोट्रोपिक प्रकृति को भी पुन: पेश करते हैं। इन मॉडलों में कार्डियक टिश्यू के समान परिपक्व फेनोटाइप, अनुबंध गुण और आणविक प्रोफाइल की कोशिकाएं बताई गई हैं। हार्ट-ऑन-ए-चिप सिस्टम भी दवा परीक्षण और रोग मॉडल में प्रणालीगत प्रभावों के अध्ययन की अनुमति देता है। हालांकि, इन विट्रो सेल-आधारित मॉडल में देशी एक्सट्रासेलुलर मैट्रिक्स की कमी है और इसलिए अंग स्तर इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी की सही नकल नहीं कर सकते हैं। इसके विपरीत, मानव हृदय स्लाइस में एक अक्षुण्ण बाह्य मैट्रिक्स और देशी सेल-टू-सेल संपर्क होते हैं, जिससे वे मानव मायोकार्डियम के अतालताजनक गुणों की अधिक सटीक जांच के लिए उपयोगी होते हैं।

शोधकर्ताओं ने मानव हृदय ऑर्गेनोटिपिक स्लाइस को तीव्र और पुरानी दवा परीक्षण के लिए एक शारीरिक पूर्व नैदानिक मंच के रूप में विकसित किया है और कार्डियक इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी और हृदय रोग प्रगति 12 ,13, 14,,15,16,,17,16,18,19,,19का अध्ययन किया है । जब आईपीएससी-व्युत्पन्न कार्डियोमायोसाइट्स के साथ तुलना की जाती है, तो मानव हृदय स्लाइस वयस्क मानव हृदय इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी को परिपक्व कार्डियोमायोसाइट फेनोटाइप के साथ अधिक ईमानदारी से दोहराते हैं। अलग-थलग मानव कार्डियोमायोसाइट्स के साथ तुलना किए जाने पर, कार्डियक स्लाइस अच्छी तरह से संरक्षित सेल-सेल कपलिंग और उनके मूल अंतर-और बाह्य वातावरण के आंतरिक अस्तित्व के कारण शारीरिक कार्रवाई संभावित अवधि प्रदर्शित करते हैं।

यह प्रोटोकॉल ऑप्टिकल मैपिंग के माध्यम से हृदय इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी मापदंडों का परीक्षण करने के लिए तीव्र (यानी, घंटे भर) और पुरानी (यानी, दिन भर) अध्ययन करने, पूरे दाता दिलों से मानव हृदय स्लाइस पैदा करने की प्रक्रिया का वर्णन करता है। जबकि यह प्रोटोकॉल केवल बाएं वेंट्रिकुलर (एलवी) ऊतक के उपयोग का वर्णन करता है, यह सफलतापूर्वक दिल के अन्य क्षेत्रों के साथ-साथ चूहों, चूहों, गिनी,सूअरों औरसूअरों 14,20, 21,,22जैसे अन्य प्रजातियों पर लागू किया गया है।,21 हमारी प्रयोगशाला पूरे मानव दाता दिलों का उपयोग करती है जिन्हें पिछले 5 वर्षों से प्रत्यारोपण के लिए अस्वीकार कर दिया गया है, लेकिन वैकल्पिक साधनों द्वारा प्राप्त किसी भी दाता हृदय नमूना ऊतकों पर किया जाना संभव है (उदाहरण के लिए, बाएं वेंट्रिकुलर असिस्ट डिवाइस [एलवीएडी] प्रत्यारोपण, बायोप्सी, मायमैक्टॉमी) जब तक ऊतकों में क्यूब्स में अनुभागित होने की क्षमता होती है। ऑप्टिकल मैपिंग को इस अध्ययन में विश्लेषण के लिए नियोजित किया गया है क्योंकि इसकी क्षमता के साथ-साथ ऑप्टिकल एक्शन क्षमता और कैल्शियम यात्रियों को उच्च स्थानिक (१०० x १०० पिक्सल) और लौकिक (>1,000 फ्रेम/एस) रिज़ॉल्यूशन के साथ मैप करने की क्षमता है । वैकल्पिक तरीकों का भी उपयोग किया जा सकता है, जैसे कि मल्टीइलेक्ट्रोड सरणी (एमईए) या माइक्रोइलेक्ट्रोड, लेकिन ये तकनीकें उनके अपेक्षाकृत कम स्थानिक संकल्पों द्वारा सीमित हैं। इसके अतिरिक्त, MEAs सेल संस्कृतियों के साथ उपयोग के लिए डिजाइन किए गए थे, और तेज माइक्रोइलेक्ट्रोड पूरे दिल या बड़े ऊतक वेजेज के साथ उपयोग के लिए अधिक आसानी से प्रबंधित किए जाते हैं।

लेख का लक्ष्य अधिक शोधकर्ताओं को हृदय इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी अध्ययन के लिए मानव हृदय ऊतकों का उपयोग करने में सक्षम बनाना है। यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि इस लेख में वर्णित तकनीक अल्पकालिक अध्ययनों (कई घंटों से दिनों के आदेश पर) के लिए अपेक्षाकृत सरल और फायदेमंद है। दीर्घकालिक अध्ययनों (सप्ताहों के आदेश पर) के लिए अधिक शारीरिक बायोमिमेटिक संस्कृति पर चर्चा की गई है और कई अन्य अध्ययनों द्वारा वर्णित किया गया है12,,18,,23। विद्युत उत्तेजना, यांत्रिक लोडिंग और ऊतक खींचने वाले लाभप्रद कंडीशनिंग तंत्र हैं जो इन विट्रो ऊतक रिमॉडलिंग12, 18, 23,18की शुरुआत को सीमित करने में मदद करसकते23हैं।

Protocol

वर्णित सभी तरीकों को मानव कल्याण के लिए सभी संस्थागत, राष्ट्रीय और अंतरराष्ट्रीय दिशा-निर्देशों के अनुपालन में किया गया है । जॉर्ज वाशिंगटन विश्वविद्यालय में इंस्टीट्यूशन रिव्यू बोर्ड (आईआरबी) द्वा?…

Representative Results

मानव ऑर्गेनोटिपिक स्लाइस ऊपर विस्तृत प्रोटोकॉल के अनुसार एक दाता मानव दिल के बाएं वेंट्रिकल से एकत्र किए गए थे और इसमें सचित्र थेअंक 1. इस तरह एक ड्यूल कैमरा ऑप्टिकल मैपिंग सिस्टमअं…

Discussion

यहां, हम कार्डियोप्लेग्ली रूप से गिरफ्तार मानव हृदयों से व्यवहार्य हृदय स्लाइस प्राप्त करने और ट्रांसमेम्ब्रान क्षमता और इंट्रासेलुलर कैल्शियम के दोहरे ऑप्टिकल मानचित्रण का उपयोग करके स्लाइस को क?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

NIH द्वारा धन (अनुदान R21 EB023106, R44 HL139248, और R01 HL126802), Leducq फाउंडेशन (परियोजना ताल) और एक अमेरिकन हार्ट एसोसिएशन पोस्टडॉक्टोरल फैलोशिप (19POST34370122) द्वारा कृतज्ञता से स्वीकार कर रहे हैं ।

Materials

1mL BD Syringe Thomas Scientific 309597
2,3-butanedione monoxime Sigma-Aldrich B0753
6 well culture plates Corning 3516
Biosafety cabinet ThermoFisher Scientific 1377
Blebbistatin Cayman 13186
Bubble Trap Radnoti 130149
Calcium chloride Sigma-Aldrich C1016
Corning Cell Strainers Fisher Scientific 07-201-432
Di-4-ANEPPS Biotium stock solution at 1.25 mg/mL in DMSO
DMSO Sigma-Aldrich D2650
Dumont #3c Forceps Fine Science Tools 11231-20
Emission dichroic mirror Chroma T630LPXR-UF1
Emission filter (RH237) Chroma ET690/50m
Emission Filter (Rhod2AM) Chroma ET590/33m
Excitation dichroic mirror Chroma T550LPXR-UF1
Excitation Filter Chroma ET500/40x
Falcon 50mL Conical Centrifuge Tubes Fisher Scientific 14-959-49A
Glucose Sigma-Aldrich G8270
Heat exchanger Radnoti 158821
HEPES Sigma-Aldrich H3375
Incubator ThermoFisher Scientific 50145502
Insulin Transferrin Selenium (ITS) Sigma-Aldrich I3146
LED excitation light source Prizmatix UHP-Mic-LED-520
Magnessium chloride hexahydrate Sigma-Aldrich M9272
Medium 199 ThermoFisher Scientific 11150059
Micam Ultima L type CMOS camera Scimedia N/A
Minutien Pins Fine Science Tools 26002-10
Pennicillin-Streptomycin Sigma-Aldrich P4333
Peristaltic Pump Cole Parmer EW-07522-20
Platinum pacing wire Alfa Aesar 43275
Pluronic F127 ThermoFisher Scientific P6867 nonionic, surfactant polyol
Potassium chloride Sigma-Aldrich P3911
Powerlab data acquisition and stimulator AD Instruments Powerlab 4/26
RH237 Biotium 61018
Rhod2AM ThermoFisher Scientific R1245MP
Rhod-2AM Invitrogen, Carlsbad, CA
Sodium bicarbonate Sigma-Aldrich S6014
Sodium chloride Sigma-Aldrich S9625
Sterilizer, dry bead Sigma-Aldrich Z378550
Stone Oxygen Diffuser Waterwood B00O0NUVM0
TissueSeal – Histoacryl Topical Skin Adhesive gobiomed AESCULAP
UltraPure Low Melting Point Agarose Thermo Fisher Scientific 16520100
Ultrasound sonicator Branson 1800
Vibratome Campden Instruments 7000 smz

References

  1. Ericsson, A. C., Crim, M. J., Franklin, C. L. A brief history of animal modeling. Missouri Medicine. 110 (3), 201-205 (2013).
  2. Choudhary, A., Ibdah, J. A. Animal models in today’s translational medicine world. Missouri Medicine. 110 (3), 220-222 (2013).
  3. Perlman, R. L. Mouse models of human disease: An evolutionary perspective. Evolution, Medicine, and Public Health. 2016 (1), 170-176 (2016).
  4. Milani-Nejad, N., Janssen, P. M. L. Small and large animal models in cardiac contraction research: advantages and disadvantages. Pharmacology & Therapeutics. 141 (3), 235-249 (2014).
  5. Green, A. R. Why do neuroprotective drugs that are so promising in animals fail in the clinic? An industry perspective. Clinical and Experimental Pharmacology and Physiology. 29 (11), 1030-1034 (2002).
  6. Shinnawi, R., Gepstein, L. iPCS cell modeling of inherited cardiac arrhythmias. Current Treatment Options in Cardiovascular Medicine. 16 (9), 331 (2014).
  7. Morimoto, Y., Mori, S., Sakai, F., Takeuchi, S. Human induced pluripotent stem cell-derived fiber-shaped cardiac tissue on a chip. Lab on a Chip. 16 (12), 2295-2301 (2016).
  8. Wang, G., et al. Modeling the mitochondrial cardiomyopathy of Barth syndrome with induced pluripotent stem cell and heart-on-chip technologies. Nature Medicine. 20 (6), 616-623 (2014).
  9. Ben-Ari, M., et al. Developmental changes in electrophysiological characteristics of human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Heart Rhythm. 13 (12), 2379-2387 (2016).
  10. Goversen, B., van der Heyden, M. A. G., van Veen, T. A. B., de Boer, T. P. The immature electrophysiological phenotype of iPSC-CMs still hampers in vitro drug screening: Special focus on IK1. Pharmacology & Therapeutics. 183, 127-136 (2018).
  11. Zhang, Y., et al. Dedifferentiation and proliferation of mammalian cardiomyocytes. PloS One. 5 (9), 12559 (2010).
  12. Watson, S. A., et al. Biomimetic electromechanical stimulation to maintain adult myocardial slices in vitro. Nature Communications. 10, 2168 (2019).
  13. Fischer, C., et al. Long-term functional and structural preservation of precision-cut human myocardium under continuous electromechanical stimulation in vitro. Nature Communications. 10, 117 (2019).
  14. Ou, Q., et al. Physiological Biomimetic Culture System for Pig and Human Heart Slices. Circulation Research. 125 (6), 628-642 (2019).
  15. Qiao, Y., et al. Multiparametric slice culture platform for the investigation of human cardiac tissue physiology. Progress in Biophysics and Molecular Biology 2. 144, 139-150 (2019).
  16. Kang, C., et al. Human Organotypic Cultured Cardiac Slices: New Platform For High Throughput Preclinical Human Trials. Scientific Reports. 6, 28798 (2016).
  17. Camelliti, P., et al. Adult human heart slices are a multicellular system suitable for electrophysiological and pharmacological studies. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 51 (3), 390-398 (2011).
  18. Brandenburger, M., et al. Organotypic slice culture from human adult ventricular myocardium. Cardiovascular Research. 93 (1), 50-59 (2012).
  19. Watson, S. A., et al. Preparation of viable adult ventricular myocardial slices from large and small mammals. Nature Protocols. 12 (12), 2623-2639 (2017).
  20. Halbach, M., et al. Ventricular slices of adult mouse hearts – A new multicellular in vitro model for electrophysiological studies. Cellular Physiology and Biochemistry. 18 (1-3), 1-8 (2006).
  21. Wang, K., et al. Cardiac tissue slices: preparation, handling, and successful optical mapping. American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 308 (9), 1112-1125 (2015).
  22. Bussek, A., et al. Cardiac tissue slices with prolonged survival for in vitro drug safety screening. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 66 (2), 145-151 (2012).
  23. Watson, S. A., Terracciano, C. M., Perbellini, F. Myocardial Slices: an Intermediate Complexity Platform for Translational Cardiovascular Research. Cardiovascular Drugs and Therapy. 33 (2), 239-244 (2019).
  24. Rouwkema, J., Koopman, B. F. J. M., Blitterswijk, C. A. V., Dhert, W. J. A., Malda, J. Supply of nutrients to cells in engineered tissues. Biotechnology and Genetic Engineering Reviews. 26 (1), 163-178 (2009).
  25. Lang, D., Sulkin, M., Lou, Q., Efimov, I. R. Optical mapping of action potentials and calcium transients in the mouse heart. Journal of Visualized Experiments. (55), e3275 (2011).
  26. Brianna, C., et al. Open-Source Multiparametric Optocardiography. Scientific Reports. 9, 721 (2019).
  27. George, S. A., et al. Modulating cardiac conduction during metabolic ischemia with perfusate sodium and calcium in guinea pig hearts. American Journal of Physiology – Heart and Circulatory Physiology. 316 (4), 849-861 (2019).
  28. Kawara, T., et al. Activation delay after premature stimulation in chronically diseased human myocardium relates to the architecture of interstitial fibrosis. Circulation. 104 (25), 3069-3075 (2001).
  29. Qu, Y., et al. Action potential recording and pro-arrhythmia risk analysis in human ventricular trabeculae. Frontiers in Physiology. 5 (8), 1109 (2018).
  30. Franz, M. R., Swerdlow, C. D., Liem, L. B., Schaefer, J. Cycle length dependence of human action potential duration in vivo. Effects of single extrastimuli, sudden sustained rate acceleration and deceleration, and different steady-state frequencies. Journal of Clinical Investigation. 82 (3), 972-979 (1988).
  31. Lou, Q., et al. Transmural heterogeneity and remodeling of ventricular excitation- contraction coupling in human heart failure. Circulation. 123 (17), 1881-1890 (2011).

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George, S. A., Brennan, J. A., Efimov, I. R. Preclinical Cardiac Electrophysiology Assessment by Dual Voltage and Calcium Optical Mapping of Human Organotypic Cardiac Slices. J. Vis. Exp. (160), e60781, doi:10.3791/60781 (2020).

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