मानव ऑर्गेनोटिपिक कार्डियक स्लाइस के ड्यूल वोल्टेज और कैल्शियम ऑप्टिकल मैपिंग द्वारा प्रीक्लिनिकल कार्डियक इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी मूल्यांकन
Summary
यह प्रोटोकॉल प्रीक्लिनिकल दवा परीक्षण के लिए मानव हृदय स्लाइस को खंडित करने और बनाने की प्रक्रिया का वर्णन करता है और इन स्लाइस से एक साथ ट्रांसमेम्ब्रान वोल्टेज और इंट्रासेलुलर कैल्शियम संकेतों को रिकॉर्ड करने के लिए ऑप्टिकल मैपिंग के उपयोग का विवरण देता है।
Abstract
मानव हृदय टुकड़ा तैयारी हाल ही में पशु और नैदानिक परीक्षणों के बीच अंतर को पाटने के लिए मानव शरीर विज्ञान अध्ययन और चिकित्सा परीक्षण के लिए एक मंच के रूप में विकसित किया गया है । दवाओं के प्रभावों की जांच करने के लिए कई पशु और सेल मॉडल का उपयोग किया गया है, फिर भी ये प्रतिक्रियाएं अक्सर मनुष्यों में भिन्न होती हैं। मानव हृदय स्लाइस दवा परीक्षण के लिए एक लाभ प्रदान करते हैं कि वे सीधे व्यवहार्य मानव दिलों से प्राप्त होते हैं। संरक्षित बहुकोशिकीय संरचनाओं, सेल-सेल युग्मन, और बाह्य मैट्रिक्स वातावरण होने के अलावा, मानव हृदय ऊतक स्लाइस का उपयोग वयस्क मानव हृदय शरीर विज्ञान पर असंख्य दवाओं के प्रभाव का सीधे परीक्षण करने के लिए किया जा सकता है। क्या इस मॉडल को अन्य दिल की तैयारी से अलग करता है, जैसे कि पूरे दिल या वेजेज, यह है कि स्लाइस को दीर्घकालिक संस्कृति के अधीन किया जा सकता है। जैसे, हृदय स्लाइस दवाओं के तीव्र और साथ ही पुराने प्रभावों का अध्ययन करने के लिए अनुमति देते हैं। इसके अलावा, एक ही दिल से एक हजार स्लाइस के लिए कई सौ इकट्ठा करने की क्षमता यह एक उच्च थ्रूपुट मॉडल बनाता है एक ही समय में अंय दवाओं के साथ अलग सांद्रता और संयोजन पर कई दवाओं का परीक्षण करने के लिए । स्लाइस दिल के किसी भी क्षेत्र से तैयार किया जा सकता है। इस प्रोटोकॉल में, हम बाएं वेंट्रिकुलर मुक्त दीवार से ऊतक क्यूब्स को अलग करके बाएं वेंट्रिकुलर स्लाइस की तैयारी का वर्णन करते हैं और उन्हें एक उच्च सटीक कंपन माइक्रोटॉम का उपयोग करके स्लाइस में विभाजित करते हैं। इन स्लाइस तो या तो बेसलाइन हृदय इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल समारोह को मापने के लिए तीव्र प्रयोगों के अधीन किया जा सकता है या पुरानी दवा अध्ययन के लिए सुसंस्कृत । यह प्रोटोकॉल जांच की जा रही दवाओं के प्रभावों को निर्धारित करने के लिए ट्रांसमेम्ब्रान क्षमता और इंट्रासेलुलर कैल्शियम गतिशीलता की एक साथ रिकॉर्डिंग के लिए कार्डियक स्लाइस के दोहरे ऑप्टिकल मानचित्रण का भी वर्णन करता है।
Introduction
पशु मॉडल मानव शरीर विज्ञान और रोगविज्ञान के अंतर्निहित तंत्र को समझने के लिए उपयोग किया जाने वाला एक मूल्यवान उपकरण रहा है, साथ ही विभिन्न रोगों के इलाज के लिए उपचारों के प्रारंभिक परीक्षण के लिए एक मंच1। इन पशुअध्ययनोंके आधार पर जैव चिकित्सा अनुसंधान के क्षेत्र में काफी प्रगति हुई है । हालांकि, चूहों, चूहों, गिनी सूअरों, खरगोशों, भेड़, सूअरों औरकुत्तों,सहित मानव और पशु शारीरिक विज्ञान के बीच महत्वपूर्ण अंतरप्रजाति मतभेद मौजूदहैं। नतीजतन, कई दवा, जीन और सेल उपचार हुए हैं जिन्होंने पशु परीक्षण चरण के दौरान वादा दिखाया लेकिन नैदानिक परीक्षणों में परिणामों तक खरा बनने में विफल रहे5। इस अंतर को पाटने के लिए, विभिन्न दवाओं औररोगोंके लिए मानव शरीर विज्ञान की प्रतिक्रिया का परीक्षण करने के लिए अलग-अलग कार्डियक मायोसाइट्स और मानव प्रेरित प्लेरिपोटेंट स्टेम सेल (आईपीएससी) को मॉडल के रूप में विकसित किया गया था। स्टेम सेल से व्युत्पन्न कार्डियोमायोसाइट्स का व्यापक रूप से अंग-ऑन-ए-चिप सिस्टम,में हृदय6,,7,8के किराए के रूप में उपयोग किया गया है। हालांकि, आईपीएससी-व्युत्पन्न कार्डियोमायोसाइट्स (आईपीएससी-सीएम) की उपयोगिता उनके अपेक्षाकृत अपरिपक्व फेनोटाइप और कार्डियोमायोसाइट उपजनसंख्या के प्रतिनिधित्व की कमी से बाधित होती है; परिपक्व मायोकार्डियम एक जटिल संरचना है जिसमें फाइब्रोब्लास्ट, न्यूरॉन्स, मैक्रोफेज और एंडोथेलियल कोशिकाओं जैसे कई सह-अस्तित्व वाले सेल प्रकार शामिल हैं। दूसरी ओर, अलग-थलग मानव कार्डियोमायोसाइट्स विद्युत रूप से परिपक्व होते हैं, और विभिन्न कार्डियोमायोसाइट उप-जनसंख्याको 9गुणों को बदलकर प्राप्त किया जा सकता है। फिर भी, ये मायोसाइट्स आम तौर पर सेल-सेल कपलिंग, तेजी से डी-विभेदन, और विट्रो10, 11,में प्रोरेथिक व्यवहार की कमी के कारण कार्रवाई संभावित मॉर्फोलोजी को बदलदेतेहैं। कुछ सीमाओं को आईपीएससी-सीएम और कार्डियक मायोसाइट्स के 3डी सेल कल्चर मॉडल द्वारा संबोधित किया गया था। ये मॉडल, जिनमें स्पेरोइड्स, हाइड्रोगेल पाड़ ने 3डी संस्कृतियों, इंजीनियर हार्ट टिश्यू (ईएचटी) और हार्ट-ऑन-ए-चिप सिस्टम को समझाया, कार्डियोमायोसाइट्स, फाइब्रोब्लास्ट और एंडोथेलियल कोशिकाओं जैसे कई कार्डियक सेल आबादी का उपयोग करें। वे या तो 3 डी संरचनाओं को बनाने के लिए एक पाड़ के साथ स्वयं इकट्ठा होते हैं या इकट्ठा होते हैं, और कुछ मायोकार्डियम की जटिल एनिसोट्रोपिक प्रकृति को भी पुन: पेश करते हैं। इन मॉडलों में कार्डियक टिश्यू के समान परिपक्व फेनोटाइप, अनुबंध गुण और आणविक प्रोफाइल की कोशिकाएं बताई गई हैं। हार्ट-ऑन-ए-चिप सिस्टम भी दवा परीक्षण और रोग मॉडल में प्रणालीगत प्रभावों के अध्ययन की अनुमति देता है। हालांकि, इन विट्रो सेल-आधारित मॉडल में देशी एक्सट्रासेलुलर मैट्रिक्स की कमी है और इसलिए अंग स्तर इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी की सही नकल नहीं कर सकते हैं। इसके विपरीत, मानव हृदय स्लाइस में एक अक्षुण्ण बाह्य मैट्रिक्स और देशी सेल-टू-सेल संपर्क होते हैं, जिससे वे मानव मायोकार्डियम के अतालताजनक गुणों की अधिक सटीक जांच के लिए उपयोगी होते हैं।
शोधकर्ताओं ने मानव हृदय ऑर्गेनोटिपिक स्लाइस को तीव्र और पुरानी दवा परीक्षण के लिए एक शारीरिक पूर्व नैदानिक मंच के रूप में विकसित किया है और कार्डियक इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी और हृदय रोग प्रगति 12 ,13, 14,,15,16,,17,16,18,19,,19का अध्ययन किया है । जब आईपीएससी-व्युत्पन्न कार्डियोमायोसाइट्स के साथ तुलना की जाती है, तो मानव हृदय स्लाइस वयस्क मानव हृदय इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी को परिपक्व कार्डियोमायोसाइट फेनोटाइप के साथ अधिक ईमानदारी से दोहराते हैं। अलग-थलग मानव कार्डियोमायोसाइट्स के साथ तुलना किए जाने पर, कार्डियक स्लाइस अच्छी तरह से संरक्षित सेल-सेल कपलिंग और उनके मूल अंतर-और बाह्य वातावरण के आंतरिक अस्तित्व के कारण शारीरिक कार्रवाई संभावित अवधि प्रदर्शित करते हैं।
यह प्रोटोकॉल ऑप्टिकल मैपिंग के माध्यम से हृदय इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी मापदंडों का परीक्षण करने के लिए तीव्र (यानी, घंटे भर) और पुरानी (यानी, दिन भर) अध्ययन करने, पूरे दाता दिलों से मानव हृदय स्लाइस पैदा करने की प्रक्रिया का वर्णन करता है। जबकि यह प्रोटोकॉल केवल बाएं वेंट्रिकुलर (एलवी) ऊतक के उपयोग का वर्णन करता है, यह सफलतापूर्वक दिल के अन्य क्षेत्रों के साथ-साथ चूहों, चूहों, गिनी,सूअरों औरसूअरों 14,20, 21,,22जैसे अन्य प्रजातियों पर लागू किया गया है।,21 हमारी प्रयोगशाला पूरे मानव दाता दिलों का उपयोग करती है जिन्हें पिछले 5 वर्षों से प्रत्यारोपण के लिए अस्वीकार कर दिया गया है, लेकिन वैकल्पिक साधनों द्वारा प्राप्त किसी भी दाता हृदय नमूना ऊतकों पर किया जाना संभव है (उदाहरण के लिए, बाएं वेंट्रिकुलर असिस्ट डिवाइस [एलवीएडी] प्रत्यारोपण, बायोप्सी, मायमैक्टॉमी) जब तक ऊतकों में क्यूब्स में अनुभागित होने की क्षमता होती है। ऑप्टिकल मैपिंग को इस अध्ययन में विश्लेषण के लिए नियोजित किया गया है क्योंकि इसकी क्षमता के साथ-साथ ऑप्टिकल एक्शन क्षमता और कैल्शियम यात्रियों को उच्च स्थानिक (१०० x १०० पिक्सल) और लौकिक (>1,000 फ्रेम/एस) रिज़ॉल्यूशन के साथ मैप करने की क्षमता है । वैकल्पिक तरीकों का भी उपयोग किया जा सकता है, जैसे कि मल्टीइलेक्ट्रोड सरणी (एमईए) या माइक्रोइलेक्ट्रोड, लेकिन ये तकनीकें उनके अपेक्षाकृत कम स्थानिक संकल्पों द्वारा सीमित हैं। इसके अतिरिक्त, MEAs सेल संस्कृतियों के साथ उपयोग के लिए डिजाइन किए गए थे, और तेज माइक्रोइलेक्ट्रोड पूरे दिल या बड़े ऊतक वेजेज के साथ उपयोग के लिए अधिक आसानी से प्रबंधित किए जाते हैं।
लेख का लक्ष्य अधिक शोधकर्ताओं को हृदय इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी अध्ययन के लिए मानव हृदय ऊतकों का उपयोग करने में सक्षम बनाना है। यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि इस लेख में वर्णित तकनीक अल्पकालिक अध्ययनों (कई घंटों से दिनों के आदेश पर) के लिए अपेक्षाकृत सरल और फायदेमंद है। दीर्घकालिक अध्ययनों (सप्ताहों के आदेश पर) के लिए अधिक शारीरिक बायोमिमेटिक संस्कृति पर चर्चा की गई है और कई अन्य अध्ययनों द्वारा वर्णित किया गया है12,,18,,23। विद्युत उत्तेजना, यांत्रिक लोडिंग और ऊतक खींचने वाले लाभप्रद कंडीशनिंग तंत्र हैं जो इन विट्रो ऊतक रिमॉडलिंग12, 18, 23,18की शुरुआत को सीमित करने में मदद करसकते23हैं।
Protocol
Representative Results
Discussion
यहां, हम कार्डियोप्लेग्ली रूप से गिरफ्तार मानव हृदयों से व्यवहार्य हृदय स्लाइस प्राप्त करने और ट्रांसमेम्ब्रान क्षमता और इंट्रासेलुलर कैल्शियम के दोहरे ऑप्टिकल मानचित्रण का उपयोग करके स्लाइस को क?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
NIH द्वारा धन (अनुदान R21 EB023106, R44 HL139248, और R01 HL126802), Leducq फाउंडेशन (परियोजना ताल) और एक अमेरिकन हार्ट एसोसिएशन पोस्टडॉक्टोरल फैलोशिप (19POST34370122) द्वारा कृतज्ञता से स्वीकार कर रहे हैं ।
Materials
| 1mL BD Syringe | Thomas Scientific | 309597 | |
| 2,3-butanedione monoxime | Sigma-Aldrich | B0753 | |
| 6 well culture plates | Corning | 3516 | |
| Biosafety cabinet | ThermoFisher Scientific | 1377 | |
| Blebbistatin | Cayman | 13186 | |
| Bubble Trap | Radnoti | 130149 | |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | C1016 | |
| Corning Cell Strainers | Fisher Scientific | 07-201-432 | |
| Di-4-ANEPPS | Biotium | stock solution at 1.25 mg/mL in DMSO | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| Dumont #3c Forceps | Fine Science Tools | 11231-20 | |
| Emission dichroic mirror | Chroma | T630LPXR-UF1 | |
| Emission filter (RH237) | Chroma | ET690/50m | |
| Emission Filter (Rhod2AM) | Chroma | ET590/33m | |
| Excitation dichroic mirror | Chroma | T550LPXR-UF1 | |
| Excitation Filter | Chroma | ET500/40x | |
| Falcon 50mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 14-959-49A | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| Heat exchanger | Radnoti | 158821 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Incubator | ThermoFisher Scientific | 50145502 | |
| Insulin Transferrin Selenium (ITS) | Sigma-Aldrich | I3146 | |
| LED excitation light source | Prizmatix | UHP-Mic-LED-520 | |
| Magnessium chloride hexahydrate | Sigma-Aldrich | M9272 | |
| Medium 199 | ThermoFisher Scientific | 11150059 | |
| Micam Ultima L type CMOS camera | Scimedia | N/A | |
| Minutien Pins | Fine Science Tools | 26002-10 | |
| Pennicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | |
| Peristaltic Pump | Cole Parmer | EW-07522-20 | |
| Platinum pacing wire | Alfa Aesar | 43275 | |
| Pluronic F127 | ThermoFisher Scientific | P6867 | nonionic, surfactant polyol |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P3911 | |
| Powerlab data acquisition and stimulator | AD Instruments | Powerlab 4/26 | |
| RH237 | Biotium | 61018 | |
| Rhod2AM | ThermoFisher Scientific | R1245MP | |
| Rhod-2AM | Invitrogen, Carlsbad, CA | ||
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S6014 | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S9625 | |
| Sterilizer, dry bead | Sigma-Aldrich | Z378550 | |
| Stone Oxygen Diffuser | Waterwood | B00O0NUVM0 | |
| TissueSeal – Histoacryl Topical Skin Adhesive | gobiomed | AESCULAP | |
| UltraPure Low Melting Point Agarose | Thermo Fisher Scientific | 16520100 | |
| Ultrasound sonicator | Branson 1800 | ||
| Vibratome | Campden Instruments | 7000 smz |
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