Preklinisk hjärtelektrofysiologisk bedömning av dubbel spänning och kalciumoptisk kartläggning av mänskliga organotypiska hjärtskivor
Summary
Detta protokoll beskriver förfarandet för snittning och odling mänskliga hjärt skivor för prekliniska drogtester och detaljer användningen av optisk kartläggning för registrering transmembrane spänning och intracellulära kalcium signaler samtidigt från dessa skivor.
Abstract
Humana hjärtskivor preparat har nyligen utvecklats som en plattform för mänskliga fysiologi studier och terapi testning för att överbrygga klyftan mellan djur och kliniska prövningar. Många djur- och cellmodeller har använts för att undersöka effekterna av droger, men dessa svar skiljer sig ofta åt hos människor. Mänskliga hjärt skivor erbjuder en fördel för drogtester i att de är direkt härrör från livskraftiga mänskliga hjärtan. Förutom att ha bevarat flercelliga strukturer, cellcellskoppling och extracellulära matrismiljöer, kan mänskliga hjärtvävnadsskivor användas för att direkt testa effekten av otaliga läkemedel på vuxna mänskliga hjärtfysiologi. Det som skiljer denna modell från andra hjärtförberedelser, såsom hela hjärtan eller kilar, är att skivor kan utsättas för långsiktig kultur. Som sådan, hjärt skivor möjliggör att studera de akuta och kroniska effekterna av läkemedel. Dessutom, förmågan att samla flera hundra till tusen skivor från ett enda hjärta gör detta till en hög genomströmning modell för att testa flera läkemedel vid varierande koncentrationer och kombinationer med andra läkemedel på samma gång. Skivor kan förberedas från en viss region i hjärtat. I detta protokoll beskriver vi beredningen av vänster Ventrikulärt skivor genom att isolera vävnad kuber från den vänstra Ventrikulärt fri vägg och snittning dem i skivor med hjälp av en hög precision vibrerande mikrotom. Dessa skivor kan sedan antingen utsättas för akuta experiment för att mäta hjärtelektrofysiologisk funktion vid baslinjen eller odlas för kroniska läkemedelsstudier. Detta protokoll beskriver också dubbla optiska kartläggning av hjärt skivor för samtidiga inspelningar av transmembran potentialer och intracellulära kalcium dynamik för att bestämma effekterna av de läkemedel som undersöks.
Introduction
Djurmodeller har varit ett värdefullt verktyg som används för att förstå de underliggande mekanismerna för människans fysiologi och patofysiologi, samt en plattform för preliminär testning av terapier för behandling av olika sjukdomar1. Stora framsteg har tagits inom området biomedicinsk forskning baserad på dessa djurstudier2. Det finns dock betydande skillnader mellan arter mellan mänskliga och animaliska fysiologi, inklusive möss, råttor, marsvin, kaniner, får, grisar och hundar3,,4. Som ett resultat, Det har varit många läkemedel, gen, och cell terapier som visade lovande under djurförsök skede men misslyckades med att leva upp till resultaten i kliniska prövningar5. För att överbrygga denna klyfta utvecklades isolerade hjärtmyocyter och humaninducerade pluripotenta stamceller (iPSC) som modeller för att testa människans fysiologis svar på olika läkemedel och sjukdomar6. Stamceller-härledda kardiomyocyter har använts i stor utsträckning i organ-on-a-chip system som ett surrogat för hjärtat6,7,8. Nyttan av iPSC-härledda kardiomyocyter (iPSC-CMs) hindras dock av deras relativt omogna fenotyp och bristen på representation av cardiomyocyte subpopulation; mogna hjärtmuskeln är en komplex struktur som består av flera samtidiga celltyper såsom fibroblaster, nervceller, makrofager och endotelceller. Å andra sidan, isolerade mänskliga kardiomyocyter är elektriskt mogna, och olika kardiomyocyte subpopulationer kan erhållas genom att ändra odling parametrar9. Fortfarande, dessa myocyter uppvisar i allmänhet förändrad åtgärd potentiella morfologier på grund av bristen på cell-cell koppling, snabb avdifferentiering, och förekomsten av proarytmic beteende in vitro10,11. Några av begränsningarna togs upp av 3D cell kultur modeller av iPSC-CMs och hjärt myocyter. Dessa modeller, som inkluderar sfäroider, hydrogel byggnadsställning inkapslade 3D-kulturer, konstruerade hjärtvävnader (EHTs), och heart-on-a-chip system, använda flera hjärtcell populationer såsom kardiomyocyter, fibroblaster, och endotelceller. De antingen själv montera eller montera längs en byggnadsställning för att bilda 3D-strukturer, och vissa även återge den komplexa anisotropa karaktären av hjärtmuskeln. Dessa modeller har rapporterats ha celler av mogna fenotyper, kontraktila egenskaper och molekylära profiler som liknar hjärtvävnad. Hjärtat-på-ett-chip systemet möjliggör också studiet av systemiska effekter i drogtester och sjukdomsmodeller. In vitro-cellbaserade modeller saknar dock den inbyggda extracellulära matrisen och kan därför inte exakt efterlikna elektrofysiologi på organnivå. Mänskliga hjärt skivor, däremot, har en intakt extracellulär matris och infödda cell-till-cell kontakter, vilket gör dem användbara för mer exakt undersöka arytmogenic egenskaper hos den mänskliga hjärtmuskeln.
Forskare har utvecklat mänskliga hjärt organotypic skivor som en fysiologisk preklinisk plattform för akuta och kroniska drogtester och att studera hjärt elektrofysiologisk och hjärtsjukdomprogression12,13,14,15,16,17,18,19. Jämfört med iPSC-härledda kardiomyocyter, mänskliga hjärt skivor mer troget replikera vuxna mänskliga hjärt elektrofysiologi med en mogen kardiomyocyte fenotyp. Jämfört med isolerade mänskliga kardiomyocyter uppvisar hjärtskivor fysiologiska åtgärder potentiella varaktigheter på grund av den välbevarade cellcellkopplingen och den inneboende förekomsten av deras inhemska intra- och extracellulära miljöer.
Detta protokoll beskriver processen att generera mänskliga hjärtskivor från hela donatorhjärtan, utför akuta (dvs. timmar långa) och kroniska (dvs. dagar långa) studier för att testa hjärtelektrofysiologiska parametrar via optisk kartläggning. Även om detta protokoll beskriver endast användningen av den vänstra Ventrikulärt (LV) vävnad, det har framgångsrikt tillämpas på andra regioner i hjärtat samt andra arter såsom möss, råttor, marsvin, och grisar14,20,21,22. Vårt laboratorium använder hela mänskliga givare hjärtan som har avvisats för transplantation under de senaste 5 åren, men det är möjligt för samma förfaranden som skall utföras på alla givare hjärtprov vävnader som erhållits på alternativa sätt (t.ex. vänster Ventrikulärt bistå enhet [LVAD] implantationer, tarmbiopsier, myectomies) så länge vävnaderna har förmågan att delas upp i kuber. Optisk kartläggning används för analys i denna studie på grund av dess förmåga att samtidigt kartlägga optiska verkningspotentialer och kalciumtransienter med hög rumslig (100 x 100 pixlar) och tidsmässig (>1 000 ramar/s) upplösning. Alternativa metoder kan också användas, till exempel flerelektrodematriser (MEA) eller mikroelektroder, men dessa tekniker begränsas av deras relativt låga rumsliga upplösningar. Dessutom var MEAs utformade för användning med cellkulturer, och skarpa mikroelektroder hanteras lättare för användning med hela hjärtan eller stora vävnadskilar.
Målet med artikeln är att göra det möjligt för fler forskare att använda mänskliga hjärtvävnader för hjärtelektrofysiologiska studier. Det bör noteras att den teknik som beskrivs i denna artikel är relativt enkel och fördelaktigt för kortsiktiga studier (i ordningen på flera timmar till dagar). Mer fysiologisk biomimetisk kultur för längre långtidsstudier (i ordningen veckor) har diskuterats och beskrivits av ett antal andra studier12,18,23. Elektrisk stimulering, mekanisk belastning och vävnad stretching är fördelaktiga konditioneringsmekanismer som kan bidra till att begränsa uppkomsten av in vitro vävnad remodellering12,18,23.
Protocol
Representative Results
Discussion
Här presenterar vi steg-för-steg-metoder för att få livskraftiga hjärt skivor från kardioplegically arresterade mänskliga hjärtan och att funktionellt karakterisera skivor med dubbla optiska kartläggning av transmembran potential och intracellulära kalcium. Med bevarad extracellulär miljö och infödd cellcellskoppling kan mänskliga hjärtskivor användas som en exakt modell av det mänskliga hjärtat för grundläggande vetenskaplig upptäckt och för effektivitets- och kardiotoxicitetstestning av farmakolog…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Finansiering av NIH (bidrag R21 EB023106, R44 HL139248 och R01 HL126802), av Leducq foundation (projekt RHYTHM) och en American Heart Association Postdoc Fellowship (19POST34370122) är tacksamt erkända.
Materials
| 1mL BD Syringe | Thomas Scientific | 309597 | |
| 2,3-butanedione monoxime | Sigma-Aldrich | B0753 | |
| 6 well culture plates | Corning | 3516 | |
| Biosafety cabinet | ThermoFisher Scientific | 1377 | |
| Blebbistatin | Cayman | 13186 | |
| Bubble Trap | Radnoti | 130149 | |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | C1016 | |
| Corning Cell Strainers | Fisher Scientific | 07-201-432 | |
| Di-4-ANEPPS | Biotium | stock solution at 1.25 mg/mL in DMSO | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| Dumont #3c Forceps | Fine Science Tools | 11231-20 | |
| Emission dichroic mirror | Chroma | T630LPXR-UF1 | |
| Emission filter (RH237) | Chroma | ET690/50m | |
| Emission Filter (Rhod2AM) | Chroma | ET590/33m | |
| Excitation dichroic mirror | Chroma | T550LPXR-UF1 | |
| Excitation Filter | Chroma | ET500/40x | |
| Falcon 50mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 14-959-49A | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| Heat exchanger | Radnoti | 158821 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Incubator | ThermoFisher Scientific | 50145502 | |
| Insulin Transferrin Selenium (ITS) | Sigma-Aldrich | I3146 | |
| LED excitation light source | Prizmatix | UHP-Mic-LED-520 | |
| Magnessium chloride hexahydrate | Sigma-Aldrich | M9272 | |
| Medium 199 | ThermoFisher Scientific | 11150059 | |
| Micam Ultima L type CMOS camera | Scimedia | N/A | |
| Minutien Pins | Fine Science Tools | 26002-10 | |
| Pennicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | |
| Peristaltic Pump | Cole Parmer | EW-07522-20 | |
| Platinum pacing wire | Alfa Aesar | 43275 | |
| Pluronic F127 | ThermoFisher Scientific | P6867 | nonionic, surfactant polyol |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P3911 | |
| Powerlab data acquisition and stimulator | AD Instruments | Powerlab 4/26 | |
| RH237 | Biotium | 61018 | |
| Rhod2AM | ThermoFisher Scientific | R1245MP | |
| Rhod-2AM | Invitrogen, Carlsbad, CA | ||
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S6014 | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S9625 | |
| Sterilizer, dry bead | Sigma-Aldrich | Z378550 | |
| Stone Oxygen Diffuser | Waterwood | B00O0NUVM0 | |
| TissueSeal – Histoacryl Topical Skin Adhesive | gobiomed | AESCULAP | |
| UltraPure Low Melting Point Agarose | Thermo Fisher Scientific | 16520100 | |
| Ultrasound sonicator | Branson 1800 | ||
| Vibratome | Campden Instruments | 7000 smz |
References
- Ericsson, A. C., Crim, M. J., Franklin, C. L. A brief history of animal modeling. Missouri Medicine. 110 (3), 201-205 (2013).
- Choudhary, A., Ibdah, J. A. Animal models in today’s translational medicine world. Missouri Medicine. 110 (3), 220-222 (2013).
- Perlman, R. L. Mouse models of human disease: An evolutionary perspective. Evolution, Medicine, and Public Health. 2016 (1), 170-176 (2016).
- Milani-Nejad, N., Janssen, P. M. L. Small and large animal models in cardiac contraction research: advantages and disadvantages. Pharmacology & Therapeutics. 141 (3), 235-249 (2014).
- Green, A. R. Why do neuroprotective drugs that are so promising in animals fail in the clinic? An industry perspective. Clinical and Experimental Pharmacology and Physiology. 29 (11), 1030-1034 (2002).
- Shinnawi, R., Gepstein, L. iPCS cell modeling of inherited cardiac arrhythmias. Current Treatment Options in Cardiovascular Medicine. 16 (9), 331 (2014).
- Morimoto, Y., Mori, S., Sakai, F., Takeuchi, S. Human induced pluripotent stem cell-derived fiber-shaped cardiac tissue on a chip. Lab on a Chip. 16 (12), 2295-2301 (2016).
- Wang, G., et al. Modeling the mitochondrial cardiomyopathy of Barth syndrome with induced pluripotent stem cell and heart-on-chip technologies. Nature Medicine. 20 (6), 616-623 (2014).
- Ben-Ari, M., et al. Developmental changes in electrophysiological characteristics of human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Heart Rhythm. 13 (12), 2379-2387 (2016).
- Goversen, B., van der Heyden, M. A. G., van Veen, T. A. B., de Boer, T. P. The immature electrophysiological phenotype of iPSC-CMs still hampers in vitro drug screening: Special focus on IK1. Pharmacology & Therapeutics. 183, 127-136 (2018).
- Zhang, Y., et al. Dedifferentiation and proliferation of mammalian cardiomyocytes. PloS One. 5 (9), 12559 (2010).
- Watson, S. A., et al. Biomimetic electromechanical stimulation to maintain adult myocardial slices in vitro. Nature Communications. 10, 2168 (2019).
- Fischer, C., et al. Long-term functional and structural preservation of precision-cut human myocardium under continuous electromechanical stimulation in vitro. Nature Communications. 10, 117 (2019).
- Ou, Q., et al. Physiological Biomimetic Culture System for Pig and Human Heart Slices. Circulation Research. 125 (6), 628-642 (2019).
- Qiao, Y., et al. Multiparametric slice culture platform for the investigation of human cardiac tissue physiology. Progress in Biophysics and Molecular Biology 2. 144, 139-150 (2019).
- Kang, C., et al. Human Organotypic Cultured Cardiac Slices: New Platform For High Throughput Preclinical Human Trials. Scientific Reports. 6, 28798 (2016).
- Camelliti, P., et al. Adult human heart slices are a multicellular system suitable for electrophysiological and pharmacological studies. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 51 (3), 390-398 (2011).
- Brandenburger, M., et al. Organotypic slice culture from human adult ventricular myocardium. Cardiovascular Research. 93 (1), 50-59 (2012).
- Watson, S. A., et al. Preparation of viable adult ventricular myocardial slices from large and small mammals. Nature Protocols. 12 (12), 2623-2639 (2017).
- Halbach, M., et al. Ventricular slices of adult mouse hearts – A new multicellular in vitro model for electrophysiological studies. Cellular Physiology and Biochemistry. 18 (1-3), 1-8 (2006).
- Wang, K., et al. Cardiac tissue slices: preparation, handling, and successful optical mapping. American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 308 (9), 1112-1125 (2015).
- Bussek, A., et al. Cardiac tissue slices with prolonged survival for in vitro drug safety screening. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 66 (2), 145-151 (2012).
- Watson, S. A., Terracciano, C. M., Perbellini, F. Myocardial Slices: an Intermediate Complexity Platform for Translational Cardiovascular Research. Cardiovascular Drugs and Therapy. 33 (2), 239-244 (2019).
- Rouwkema, J., Koopman, B. F. J. M., Blitterswijk, C. A. V., Dhert, W. J. A., Malda, J. Supply of nutrients to cells in engineered tissues. Biotechnology and Genetic Engineering Reviews. 26 (1), 163-178 (2009).
- Lang, D., Sulkin, M., Lou, Q., Efimov, I. R. Optical mapping of action potentials and calcium transients in the mouse heart. Journal of Visualized Experiments. (55), e3275 (2011).
- Brianna, C., et al. Open-Source Multiparametric Optocardiography. Scientific Reports. 9, 721 (2019).
- George, S. A., et al. Modulating cardiac conduction during metabolic ischemia with perfusate sodium and calcium in guinea pig hearts. American Journal of Physiology – Heart and Circulatory Physiology. 316 (4), 849-861 (2019).
- Kawara, T., et al. Activation delay after premature stimulation in chronically diseased human myocardium relates to the architecture of interstitial fibrosis. Circulation. 104 (25), 3069-3075 (2001).
- Qu, Y., et al. Action potential recording and pro-arrhythmia risk analysis in human ventricular trabeculae. Frontiers in Physiology. 5 (8), 1109 (2018).
- Franz, M. R., Swerdlow, C. D., Liem, L. B., Schaefer, J. Cycle length dependence of human action potential duration in vivo. Effects of single extrastimuli, sudden sustained rate acceleration and deceleration, and different steady-state frequencies. Journal of Clinical Investigation. 82 (3), 972-979 (1988).
- Lou, Q., et al. Transmural heterogeneity and remodeling of ventricular excitation- contraction coupling in human heart failure. Circulation. 123 (17), 1881-1890 (2011).
