Preklinische Cardiale Elektrofysiologie Beoordeling door Dual Voltage en Calcium Optical Mapping van human organotypic cardiale plakjes
Summary
Dit protocol beschrijft de procedure voor het doorsnijden en kweken van menselijke cardiale plakjes voor preklinische geneesmiddelentesten en beschrijft het gebruik van optische mapping voor het opnemen van transmembranespanning en intracellulaire calciumsignalen gelijktijdig van deze plakjes.
Abstract
Menselijke cardiale slice preparaten zijn onlangs ontwikkeld als een platform voor menselijke fysiologie studies en therapie testen om de kloof tussen dier en klinische proeven te overbruggen. Tal van dier- en celmodellen zijn gebruikt om de effecten van drugs te onderzoeken, maar deze reacties verschillen vaak bij de mens. Menselijke cardiale plakjes bieden een voordeel voor het testen van geneesmiddelen in dat ze rechtstreeks zijn afgeleid van levensvatbare menselijke harten. Naast het behoud van meercellige structuren, celcelkoppeling en extracellulaire matrixomgevingen, kunnen menselijke hartweefselplakjes worden gebruikt om het effect van ontelbare geneesmiddelen op de menselijke hartfysiologie direct te testen. Wat dit model onderscheidt van andere hartpreparaten, zoals hele harten of wiggen, is dat plakjes kunnen worden onderworpen aan cultuur op langere termijn. Als zodanig, cardiale plakjes zorgen voor het bestuderen van de acute en chronische effecten van drugs. Bovendien, de mogelijkheid om enkele honderden tot duizend plakjes te verzamelen van een enkel hart maakt dit een high-throughput model om verschillende geneesmiddelen te testen in verschillende concentraties en combinaties met andere geneesmiddelen op hetzelfde moment. Plakjes kunnen worden bereid uit een bepaalde regio van het hart. In dit protocol beschrijven we de voorbereiding van linker ventriculaire plakjes door weefselblokjes van de linker ventriculaire vrije muur te isoleren en ze in plakjes te snijden met behulp van een hoge precisie vibrerende microtome. Deze plakjes kunnen vervolgens worden onderworpen aan acute experimenten om baseline cardiale elektrofysiologische functie te meten of gekweekt voor chronische medicijnstudies. Dit protocol beschrijft ook dubbele optische mapping van cardiale segmenten voor gelijktijdige opnames van transmembrane potentialen en intracellulaire calciumdynamica om de effecten van de onderzochte geneesmiddelen te bepalen.
Introduction
Diermodellen zijn een waardevol instrument dat wordt gebruikt voor het begrijpen van de onderliggende mechanismen van de menselijke fysiologie en pathofysiologie, evenals een platform voor het inleidende testen van therapieën voor de behandeling van verschillende ziekten1. Er zijn grote stappen gezet op het gebied van biomedisch onderzoek op basis van deze dierstudies2. Er bestaan echter aanzienlijke verschillen tussen soorten tussen menselijke en dierlijke fysiologie, waaronder muizen, ratten, cavia’s, konijnen, schapen, varkens en honden3,4. Als gevolg hiervan zijn er tal van geneesmiddelen, gen en celtherapieën die belofte tijdens de dierproeven fase toonde, maar niet aan de resultaten in klinische studies5. Om deze kloof te overbruggen, werden geïsoleerde cardiale myocyten en door de mens veroorzaakte pluripotente stamcellen (iPSC’s) ontwikkeld als modellen om de respons van de menselijke fysiologie op verschillende geneesmiddelen en ziekten te testen6. Stamcel-afgeleide cardiomyocyten zijn op grote schaal gebruikt in organ-on-a-chip systemen als een surrogaat van het hart6,7,8. Het nut van iPSC-afgeleide cardiomyocyten (iPSC-CMs) wordt echter belemmerd door hun relatief onrijpe fenotype en het gebrek aan representatie van de cardiomyocyte subpopulatie; het volwassen myocardium is een complexe structuur die bestaat uit verschillende naast elkaar bestaande celtypen zoals fibroblasten, neuronen, macrofagen en endotheelcellen. Aan de andere kant, geïsoleerde menselijke cardiomyocyten zijn elektrisch volwassen, en verschillende cardiomyocyte subpopulaties kunnen worden verkregen door het veranderen van culturing parameters9. Toch vertonen deze myocyten over het algemeen veranderde actie potentiële morfologieën als gevolg van het gebrek aan celcelkoppeling, snelle de-differentiatie en het optreden van proarritmisch gedrag in vitro10,11. Sommige van de beperkingen werden aangepakt door 3D-cel cultuur modellen van iPSC-CMs en cardiale myocyten. Deze modellen, waaronder sferoïden, hydrogel steiger ingekapseld 3D culturen, ontworpen hartweefsels (EHTs), en hart-op-een-chip systemen, gebruik maken van meerdere cardiale cel populaties zoals cardiomyocyten, fibroblasten, en endotheelcellen. Ze ofwel zelf monteren of monteren langs een steiger om 3D-structuren te vormen, en sommige zelfs reproduceren de complexe anisotropische aard van het myocardium. Deze modellen zijn gemeld te hebben cellen van volwassen fenotypes, contractiele eigenschappen, en moleculaire profielen vergelijkbaar met hartweefsel. Het heart-on-a-chip systeem maakt het ook mogelijk om systemische effecten te bestuderen in medicijntesten en ziektemodellen. In vitro celgebaseerde modellen missen echter de native extracellulaire matrix en kunnen daarom de elektrofysiologie op orgaanniveau niet nauwkeurig nabootsen. Menselijke cardiale plakjes, daarentegen, hebben een intacte extracellulaire matrix en inheemse cel-naar-cel contacten, waardoor ze nuttig voor een nauwkeuriger onderzoek van aritmogene eigenschappen van het menselijke myocardium.
Onderzoekers hebben menselijke cardiale organotypische plakjes ontwikkeld als fysiologisch preklinisch platform voor acute en chronische geneesmiddelentesten en om cardiale elektrofysiologie en hartziekteprogressie12,13,,14,15,16,17,18,19te bestuderen . In vergelijking met iPSC-afgeleide cardiomyocyten, menselijke cardiale plakjes meer trouw repliceren volwassen menselijke cardiale elektrofysiologie met een volwassen cardiomyocyte fenotype. In vergelijking met geïsoleerde menselijke cardiomyocyten vertonen hartsplakjes fysiologische werkingsmogelijkheden vanwege de goed bewaarde celcelkoppeling en het intrinsieke bestaan van hun inheemse intra- en extracellulaire omgevingen.
Dit protocol beschrijft het proces van het genereren van menselijke hartschijfjes uit hele donorharten, het uitvoeren van acute (d.w.z. uren-lange) en chronische (dat wil zeggen, dagen-lange) studies om cardiale elektrofysiologie parameters te testen via optische mapping. Hoewel dit protocol alleen het gebruik van het linker ventriculaire (LV) weefsel beschrijft, is het met succes toegepast op andere delen van het hart, evenals andere soorten zoals muizen, ratten, cavia’s en varkens14,20,21,22. Ons laboratorium maakt gebruik van hele menselijke donorharten die de afgelopen 5 jaar zijn afgewezen voor transplantatie, maar het is haalbaar dat deze zelfde procedures worden uitgevoerd op weefsels van donorhartmonsters die met alternatieve middelen zijn verkregen (bijvoorbeeld linker-ventriculaire hulpverlening [LVAD]-implantaties, biopsieën, myectomieën) zolang de weefsels de mogelijkheid hebben om in kubussen te worden gesneusd. Optische mapping wordt gebruikt voor analyse in deze studie vanwege de capaciteit om tegelijkertijd optische actiemogelijkheden en calciumtransiënten in kaart te brengen met een hoge ruimtelijke (100 x 100 pixels) en tijdelijke (>1.000 frames/s) resolutie. Alternatieve methoden kunnen ook worden gebruikt, zoals multi-elektrodenarrays (MEA’s) of micro-elektroden, maar deze technieken worden beperkt door hun relatief lage ruimtelijke resoluties. Daarnaast zijn MEA’s ontworpen voor gebruik met celculturen, en scherpe micro-elektroden worden gemakkelijker beheerd voor gebruik met hele harten of grote weefselwiggen.
Het doel van het artikel is om meer onderzoekers in staat te stellen menselijke cardiale weefsels te gebruiken voor cardiale elektrofysiologie studies. Opgemerkt moet worden dat de technologie beschreven in dit artikel is relatief eenvoudig en gunstig voor korte termijn studies (in de orde van enkele uren tot dagen). Meer fysiologische biomimetische cultuur voor studies op langere termijn (in de orde van weken) is besproken en beschreven door een aantal andere studies12,18,23. Elektrische stimulatie, mechanische belasting en weefselrekken zijn voordelige conditioneringsmechanismen die het begin van in vitro weefsel remodelleren12,18,23kunnen helpen beperken.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hier presenteren we stapsgewijze methoden om levensvatbare cardiale plakjes te verkrijgen van cardioplegisch gearresteerde menselijke harten en om functioneel te karakteriseren de plakjes met behulp van dubbele optische mapping van transmembrane potentieel en intracellulaire calcium. Met een bewaard gebleven extracellulaire omgeving en inheemse celcelkoppeling kunnen menselijke hartsplakjes worden gebruikt als een nauwkeurig model van het menselijk hart voor fundamentele wetenschappelijke ontdekking en voor het testen va…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Financiering door NIH (subsidies R21 EB023106, R44 HL139248 en R01 HL126802), door Stichting Leducq (project RHYTHM) en een American Heart Association Postdoctoral Fellowship (19POST34370122) worden dankbaar erkend.
Materials
| 1mL BD Syringe | Thomas Scientific | 309597 | |
| 2,3-butanedione monoxime | Sigma-Aldrich | B0753 | |
| 6 well culture plates | Corning | 3516 | |
| Biosafety cabinet | ThermoFisher Scientific | 1377 | |
| Blebbistatin | Cayman | 13186 | |
| Bubble Trap | Radnoti | 130149 | |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | C1016 | |
| Corning Cell Strainers | Fisher Scientific | 07-201-432 | |
| Di-4-ANEPPS | Biotium | stock solution at 1.25 mg/mL in DMSO | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| Dumont #3c Forceps | Fine Science Tools | 11231-20 | |
| Emission dichroic mirror | Chroma | T630LPXR-UF1 | |
| Emission filter (RH237) | Chroma | ET690/50m | |
| Emission Filter (Rhod2AM) | Chroma | ET590/33m | |
| Excitation dichroic mirror | Chroma | T550LPXR-UF1 | |
| Excitation Filter | Chroma | ET500/40x | |
| Falcon 50mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 14-959-49A | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| Heat exchanger | Radnoti | 158821 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Incubator | ThermoFisher Scientific | 50145502 | |
| Insulin Transferrin Selenium (ITS) | Sigma-Aldrich | I3146 | |
| LED excitation light source | Prizmatix | UHP-Mic-LED-520 | |
| Magnessium chloride hexahydrate | Sigma-Aldrich | M9272 | |
| Medium 199 | ThermoFisher Scientific | 11150059 | |
| Micam Ultima L type CMOS camera | Scimedia | N/A | |
| Minutien Pins | Fine Science Tools | 26002-10 | |
| Pennicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | |
| Peristaltic Pump | Cole Parmer | EW-07522-20 | |
| Platinum pacing wire | Alfa Aesar | 43275 | |
| Pluronic F127 | ThermoFisher Scientific | P6867 | nonionic, surfactant polyol |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P3911 | |
| Powerlab data acquisition and stimulator | AD Instruments | Powerlab 4/26 | |
| RH237 | Biotium | 61018 | |
| Rhod2AM | ThermoFisher Scientific | R1245MP | |
| Rhod-2AM | Invitrogen, Carlsbad, CA | ||
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S6014 | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S9625 | |
| Sterilizer, dry bead | Sigma-Aldrich | Z378550 | |
| Stone Oxygen Diffuser | Waterwood | B00O0NUVM0 | |
| TissueSeal – Histoacryl Topical Skin Adhesive | gobiomed | AESCULAP | |
| UltraPure Low Melting Point Agarose | Thermo Fisher Scientific | 16520100 | |
| Ultrasound sonicator | Branson 1800 | ||
| Vibratome | Campden Instruments | 7000 smz |
References
- Ericsson, A. C., Crim, M. J., Franklin, C. L. A brief history of animal modeling. Missouri Medicine. 110 (3), 201-205 (2013).
- Choudhary, A., Ibdah, J. A. Animal models in today’s translational medicine world. Missouri Medicine. 110 (3), 220-222 (2013).
- Perlman, R. L. Mouse models of human disease: An evolutionary perspective. Evolution, Medicine, and Public Health. 2016 (1), 170-176 (2016).
- Milani-Nejad, N., Janssen, P. M. L. Small and large animal models in cardiac contraction research: advantages and disadvantages. Pharmacology & Therapeutics. 141 (3), 235-249 (2014).
- Green, A. R. Why do neuroprotective drugs that are so promising in animals fail in the clinic? An industry perspective. Clinical and Experimental Pharmacology and Physiology. 29 (11), 1030-1034 (2002).
- Shinnawi, R., Gepstein, L. iPCS cell modeling of inherited cardiac arrhythmias. Current Treatment Options in Cardiovascular Medicine. 16 (9), 331 (2014).
- Morimoto, Y., Mori, S., Sakai, F., Takeuchi, S. Human induced pluripotent stem cell-derived fiber-shaped cardiac tissue on a chip. Lab on a Chip. 16 (12), 2295-2301 (2016).
- Wang, G., et al. Modeling the mitochondrial cardiomyopathy of Barth syndrome with induced pluripotent stem cell and heart-on-chip technologies. Nature Medicine. 20 (6), 616-623 (2014).
- Ben-Ari, M., et al. Developmental changes in electrophysiological characteristics of human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Heart Rhythm. 13 (12), 2379-2387 (2016).
- Goversen, B., van der Heyden, M. A. G., van Veen, T. A. B., de Boer, T. P. The immature electrophysiological phenotype of iPSC-CMs still hampers in vitro drug screening: Special focus on IK1. Pharmacology & Therapeutics. 183, 127-136 (2018).
- Zhang, Y., et al. Dedifferentiation and proliferation of mammalian cardiomyocytes. PloS One. 5 (9), 12559 (2010).
- Watson, S. A., et al. Biomimetic electromechanical stimulation to maintain adult myocardial slices in vitro. Nature Communications. 10, 2168 (2019).
- Fischer, C., et al. Long-term functional and structural preservation of precision-cut human myocardium under continuous electromechanical stimulation in vitro. Nature Communications. 10, 117 (2019).
- Ou, Q., et al. Physiological Biomimetic Culture System for Pig and Human Heart Slices. Circulation Research. 125 (6), 628-642 (2019).
- Qiao, Y., et al. Multiparametric slice culture platform for the investigation of human cardiac tissue physiology. Progress in Biophysics and Molecular Biology 2. 144, 139-150 (2019).
- Kang, C., et al. Human Organotypic Cultured Cardiac Slices: New Platform For High Throughput Preclinical Human Trials. Scientific Reports. 6, 28798 (2016).
- Camelliti, P., et al. Adult human heart slices are a multicellular system suitable for electrophysiological and pharmacological studies. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 51 (3), 390-398 (2011).
- Brandenburger, M., et al. Organotypic slice culture from human adult ventricular myocardium. Cardiovascular Research. 93 (1), 50-59 (2012).
- Watson, S. A., et al. Preparation of viable adult ventricular myocardial slices from large and small mammals. Nature Protocols. 12 (12), 2623-2639 (2017).
- Halbach, M., et al. Ventricular slices of adult mouse hearts – A new multicellular in vitro model for electrophysiological studies. Cellular Physiology and Biochemistry. 18 (1-3), 1-8 (2006).
- Wang, K., et al. Cardiac tissue slices: preparation, handling, and successful optical mapping. American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 308 (9), 1112-1125 (2015).
- Bussek, A., et al. Cardiac tissue slices with prolonged survival for in vitro drug safety screening. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 66 (2), 145-151 (2012).
- Watson, S. A., Terracciano, C. M., Perbellini, F. Myocardial Slices: an Intermediate Complexity Platform for Translational Cardiovascular Research. Cardiovascular Drugs and Therapy. 33 (2), 239-244 (2019).
- Rouwkema, J., Koopman, B. F. J. M., Blitterswijk, C. A. V., Dhert, W. J. A., Malda, J. Supply of nutrients to cells in engineered tissues. Biotechnology and Genetic Engineering Reviews. 26 (1), 163-178 (2009).
- Lang, D., Sulkin, M., Lou, Q., Efimov, I. R. Optical mapping of action potentials and calcium transients in the mouse heart. Journal of Visualized Experiments. (55), e3275 (2011).
- Brianna, C., et al. Open-Source Multiparametric Optocardiography. Scientific Reports. 9, 721 (2019).
- George, S. A., et al. Modulating cardiac conduction during metabolic ischemia with perfusate sodium and calcium in guinea pig hearts. American Journal of Physiology – Heart and Circulatory Physiology. 316 (4), 849-861 (2019).
- Kawara, T., et al. Activation delay after premature stimulation in chronically diseased human myocardium relates to the architecture of interstitial fibrosis. Circulation. 104 (25), 3069-3075 (2001).
- Qu, Y., et al. Action potential recording and pro-arrhythmia risk analysis in human ventricular trabeculae. Frontiers in Physiology. 5 (8), 1109 (2018).
- Franz, M. R., Swerdlow, C. D., Liem, L. B., Schaefer, J. Cycle length dependence of human action potential duration in vivo. Effects of single extrastimuli, sudden sustained rate acceleration and deceleration, and different steady-state frequencies. Journal of Clinical Investigation. 82 (3), 972-979 (1988).
- Lou, Q., et al. Transmural heterogeneity and remodeling of ventricular excitation- contraction coupling in human heart failure. Circulation. 123 (17), 1881-1890 (2011).
