Preklinisk hjertelektrofysiologi vurdering av dual spenning og kalsium optisk kartlegging av humane organotypiske hjerteskiver

Summary

Denne protokollen beskriver prosedyren for snitting og kulturing av menneskelige hjerteskiver for preklinisk narkotikatesting og detaljer bruk av optisk kartlegging for registrering av transmembranespenning og intracellulære kalsiumsignaler samtidig fra disse skivene.

Abstract

Menneskelige hjerteskivepreparater har nylig blitt utviklet som en plattform for humane fysiologistudier og terapitesting for å bygge bro mellom dyre- og kliniske studier. Tallrike dyre- og cellemodeller har blitt brukt til å undersøke effekten av narkotika, men disse svarene varierer ofte hos mennesker. Menneskelige hjerteskiver gir en fordel for narkotikatesting ved at de er direkte avledet fra levedyktige menneskelige hjerter. I tillegg til å ha bevart flercellede strukturer, cellecellekobling og ekstracellulære matrisemiljøer, kan menneskelige hjertevevskiver brukes til å direkte teste effekten av utallige legemidler på voksen menneskelig hjertefysiologi. Det som skiller denne modellen fra andre hjertepreparater, for eksempel hele hjerter eller kiler, er at skiver kan bli utsatt for langsiktig kultur. Som sådan tillater hjerteskiver å studere de akutte så vel som kroniske effektene av narkotika. Videre gjør evnen til å samle flere hundre til tusen skiver fra et enkelt hjerte dette til en høygjennomstrømningsmodell for å teste flere stoffer ved varierende konsentrasjoner og kombinasjoner med andre stoffer samtidig. Skiver kan tilberedes fra en gitt region av hjertet. I denne protokollen beskriver vi utarbeidelsen av venstre ventrikulære skiver ved å isolere vevskuber fra venstre ventrikulær fri vegg og dele dem i skiver ved hjelp av en høy presisjon vibrerende mikrotom. Disse skivene kan da enten bli utsatt for akutte eksperimenter for å måle baseline hjerteelektrofysiologisk funksjon eller dyrket for kroniske legemiddelstudier. Denne protokollen beskriver også to optiske kartlegging av hjerteskiver for samtidige registreringer av transmembbrane potensialer og intracellulær kalsiumdynamikk for å bestemme effekten av narkotika som undersøkes.

Introduction

Dyremodeller har vært et verdifullt verktøy som brukes for å forstå de underliggende mekanismene for menneskelig fysiologi og patofysiologi, samt en plattform for foreløpig testing av terapier for å behandle ulike sykdommer¹. Store fremskritt har blitt tatt innen biomedisinsk forskning basert på disse dyrestudier². Det finnes imidlertid betydelige forskjeller mellom menneske- og dyrefysiologier, inkludert mus, rotter, marsvin, kaniner, sauer, griser og hunder^3,,4. Som et resultat har det vært mange legemiddel-, gen- og cellebehandlinger som viste løfte under dyretestingsstadiet, men klarte ikke å leve opp til resultatene i kliniske studier⁵. For å bygge bro over dette gapet ble isolerte hjertemycytter og humane pluripotente stamceller (iPSCer) utviklet som modeller for å teste responsen av menneskelig fysiologi til ulike stoffer og sykdommer⁶. Stamcelleavledede kardiomyocytter har vært mye brukt i organ-on-a-chip-systemer som et surrogat i hjertet^6,,7,,8. Nytten av iPSC-avledede kardiomyocytter (iPSC-CMs) er imidlertid hindret av deres relativt umodne fenotype og mangel på representasjon av kardiomyocyte subpopulation; det modne myokardiet er en kompleks struktur som består av flere sameksisterende celletyper som fibroblaster, nevroner, makrofager og endotelceller. På den annen side er isolerte humane kardiomyocytter elektrisk modne, og forskjellige kardiomyocyte subpopulasjoner kan oppnås ved å endre kulturing parametere⁹. Likevel viser disse myocytter generelt endret handling potensielle morfologier på grunn av mangel på celle-celle kobling, rask de-differensiering, og forekomst av proarrhythmic atferd in vitro^10,11. Noen av begrensningene ble adressert av 3D-cellekulturmodeller av iPSC-CMs og hjertemycytter. Disse modellene, som inkluderer sfæroider, hydrogel stillas innkapslet 3D-kulturer, konstruert hjertevev (EHTs), og hjerte-på-en-chip systemer, bruke flere hjertecellepopulasjoner som kardiomyocytter, fibroblaster, og endotelceller. De enten selv montere eller montere langs et stillas for å danne 3D strukturer, og noen selv reprodusere komplekse anisotropisk natur myokardiet. Disse modellene har blitt rapportert å ha celler av modne fenotyper, kontraktile egenskaper, og molekylære profiler som ligner på hjertevev. Hjerte-på-en-chip-systemet tillater også studiet av systemiske effekter i narkotikatesting og sykdomsmodeller. In vitro cellebaserte modeller mangler imidlertid den innfødte ekstracellulære matrisen og kan derfor ikke nøyaktig etterligne organnivåelektrofysiologi. Menneskelige hjerteskiver, derimot, har en intakt ekstracellulær matrise og innfødte celle-til-celle-kontakter, noe som gjør dem nyttige for mer nøyaktig å undersøke arytmogene egenskaper av det menneskelige myokardiet.

Forskere har utviklet humane hjerteorganotypiske skiver som en fysiologisk preklinisk plattform for akutt og kronisk narkotikatesting og for å studere hjerteelektrofysiologi og hjertesykdomprogresjon^{12,13,,14,15,16,17,18,19}. Sammenlignet med iPSC-avledede kardiomyocytter, humane hjerteskiver mer trofast replikere voksen menneskelig hjerteelektrofysiologi med en moden kardiomyocyte fenotype. Sammenlignet med isolerte humane kardiomyocytter viser hjerteskiver fysiologiske virkningspotensialvarierigheter på grunn av den godt bevarte cellecellekoblingen og den iboende eksistensen av deres innfødte intra- og ekstracellulære miljøer.

Denne protokollen beskriver prosessen med å generere menneskelige hjerteskiver fra hele donorhjerter, utføre akutte (dvs. timer lange) og kroniske (dvs. dager lange) studier for å teste hjerteelektrofysiologiparametere via optisk kartlegging. Mens denne protokollen beskriver bare bruken av venstre ventrikkel (LV) vev, det har blitt brukt til andre regioner av hjertet samt andre arter som mus, rotter, marsvin, og griser^14,20,21,22. Vårt laboratorium bruker hele menneskelige donorhjerter som har blitt avvist for transplantasjon de siste 5 årene, men det er mulig for disse samme prosedyrene å bli utført på noen donor hjerte prøve vev oppnådd ved alternative midler (f.eks venstre ventrikulær hjelpeenhet [LVAD] implantasjoner, biopsier, myectomies) så lenge vevet har evnen til å bli delt inn i terninger. Optisk kartlegging er brukt for analyse i denne studien på grunn av sin evne til å samtidig kartlegge optiske handlingspotensialer og kalsiumtransienter med høy romlig (100 x 100 piksler) og temporal (> 1000 rammer / s) oppløsning. Alternative metoder kan også brukes, for eksempel multielectrode arrays (MEAer) eller mikroelektroder, men disse teknikkene er begrenset av deres relativt lave romlige oppløsninger. I tillegg ble MEAer designet for bruk med cellekulturer, og skarpe mikroelektroder håndteres lettere for bruk med hele hjerter eller store vevkiler.

Målet med artikkelen er å gjøre det mulig for flere forskere å bruke humant hjertevev for hjerteelektrofysiologistudier. Det bør bemerkes at teknologien som er beskrevet i denne artikkelen er relativt enkel og gunstig for kortsiktige studier (i størrelsesorden flere timer til dager). Mer fysiologisk biomimetisk kultur for langsiktige studier (i rekkefølge av uker) har blitt diskutert og beskrevet av en rekke andre studier^12,18,23. Elektrisk stimulering, mekanisk lasting og vevstrekking er fordelaktige kondisjoneringsmekanismer som kan bidra til å begrense utbruddet av in vitro vevsremodellering^12,,18,23.

Protocol

Alle metodene som er beskrevet er utført i samsvar med alle institusjonelle, nasjonale og internasjonale retningslinjer for menneskelig velferd. Forskning ble godkjent av Institution Review Board (IRB) ved George Washington University. MERK: Donor menneskelige hjerter ble kjøpt fra Washington Regional Transplant Community som deidentifisert kassert vev med godkjenning fra George Washington University IRB. Eksplantede hjerter er kardioplegisk arrestert ved å skylle hjertet med en løsning av…

Representative Results

Humane organotypiske skiver ble samlet inn fra venstre ventrikkel av et donormenneskelig hjerte i henhold til protokollen som er beskrevet ovenfor og illustrert iFigur 1. Et optisk kartsystem med to kameraer som det iFigur 2ble brukt i den oppreist bildekonfigurasjonen for å utføre samtidig optisk kartlegging av spenning og kalsium ca 1 timer etter ferdigstillelse av kutteprotokollen. Data ble analysert ved hjelp av RHYTHM1.2 (Figur 3</str…

Discussion

Her presenterer vi trinnvise metoder for å oppnå levedyktige hjerteskiver fra kardioplegisk arresterte menneskelige hjerter og for å funksjonelt karakterisere skivene ved hjelp av dobbel optisk kartlegging av transmembranepotensial og intracellulært kalsium. Med bevart ekstracellulært miljø og innfødt cellecellekobling kan menneskelige hjerteskiver brukes som en nøyaktig modell av det menneskelige hjerte for grunnleggende vitenskapelig oppdagelse og for effekt- og kardiotoksisitetstesting av farmakologiske midler…

Materials

1mL BD Syringe	Thomas Scientific	309597
2,3-butanedione monoxime	Sigma-Aldrich	B0753
6 well culture plates	Corning	3516
Biosafety cabinet	ThermoFisher Scientific	1377
Blebbistatin	Cayman	13186
Bubble Trap	Radnoti	130149
Calcium chloride	Sigma-Aldrich	C1016
Corning Cell Strainers	Fisher Scientific	07-201-432
Di-4-ANEPPS	Biotium		stock solution at 1.25 mg/mL in DMSO
DMSO	Sigma-Aldrich	D2650
Dumont #3c Forceps	Fine Science Tools	11231-20
Emission dichroic mirror	Chroma	T630LPXR-UF1
Emission filter (RH237)	Chroma	ET690/50m
Emission Filter (Rhod2AM)	Chroma	ET590/33m
Excitation dichroic mirror	Chroma	T550LPXR-UF1
Excitation Filter	Chroma	ET500/40x
Falcon 50mL Conical Centrifuge Tubes	Fisher Scientific	14-959-49A
Glucose	Sigma-Aldrich	G8270
Heat exchanger	Radnoti	158821
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375
Incubator	ThermoFisher Scientific	50145502
Insulin Transferrin Selenium (ITS)	Sigma-Aldrich	I3146
LED excitation light source	Prizmatix	UHP-Mic-LED-520
Magnessium chloride hexahydrate	Sigma-Aldrich	M9272
Medium 199	ThermoFisher Scientific	11150059
Micam Ultima L type CMOS camera	Scimedia	N/A
Minutien Pins	Fine Science Tools	26002-10
Pennicillin-Streptomycin	Sigma-Aldrich	P4333
Peristaltic Pump	Cole Parmer	EW-07522-20
Platinum pacing wire	Alfa Aesar	43275
Pluronic F127	ThermoFisher Scientific	P6867	nonionic, surfactant polyol
Potassium chloride	Sigma-Aldrich	P3911
Powerlab data acquisition and stimulator	AD Instruments	Powerlab 4/26
RH237	Biotium	61018
Rhod2AM	ThermoFisher Scientific	R1245MP
Rhod-2AM	Invitrogen, Carlsbad, CA
Sodium bicarbonate	Sigma-Aldrich	S6014
Sodium chloride	Sigma-Aldrich	S9625
Sterilizer, dry bead	Sigma-Aldrich	Z378550
Stone Oxygen Diffuser	Waterwood	B00O0NUVM0
TissueSeal – Histoacryl Topical Skin Adhesive	gobiomed	AESCULAP
UltraPure Low Melting Point Agarose	Thermo Fisher Scientific	16520100
Ultrasound sonicator		Branson 1800
Vibratome	Campden Instruments	7000 smz