Évaluation de l’électrophysiologie cardiaque préclinique par la double tension et la cartographie optique du calcium des tranches cardiaques organotypic humaines
Summary
Ce protocole décrit la procédure de sectionnage et de culture de tranches cardiaques humaines pour les tests de médicaments précliniques et détaille l’utilisation de la cartographie optique pour l’enregistrement de la tension transmembrane et des signaux de calcium intracellulaire simultanément à partir de ces tranches.
Abstract
Des préparations de tranches cardiaques humaines ont récemment été développées comme plate-forme pour les études de physiologie humaine et les tests thérapeutiques afin de combler le fossé entre les essais animaux et cliniques. De nombreux modèles animaux et cellulaires ont été utilisés pour examiner les effets des médicaments, mais ces réponses diffèrent souvent chez l’homme. Les tranches cardiaques humaines offrent un avantage pour le dépistage des drogues en ce qu’elles sont directement dérivées de cœurs humains viables. En plus d’avoir conservé des structures multicellulaires, un couplage cellule-cellule, et des environnements de matrice extracellulaire, les tranches de tissu cardiaque humain peuvent être utilisées pour tester directement l’effet d’innombrables médicaments sur la physiologie cardiaque humaine adulte. Ce qui distingue ce modèle des autres préparations cardiaques, comme les cœurs entiers ou les coins, c’est que les tranches peuvent être soumises à une culture à plus long terme. En tant que tel, les tranches cardiaques permettent d’étudier les effets aigus ainsi que chroniques des médicaments. En outre, la capacité de recueillir plusieurs centaines à mille tranches d’un seul cœur en fait un modèle à haut débit pour tester plusieurs médicaments à des concentrations et des combinaisons variables avec d’autres médicaments en même temps. Des tranches peuvent être préparées à partir de n’importe quelle région du cœur. Dans ce protocole, nous décrivons la préparation des tranches ventriculaires gauches en isolant les cubes de tissu de la paroi libre ventriculaire gauche et en les sectionnant en tranches à l’aide d’un microtome vibrant de haute précision. Ces tranches peuvent alors être soumises à des expériences aiguës pour mesurer la fonction électrophysiologique cardiaque de base ou cultivées pour des études de médicaments chroniques. Ce protocole décrit également la double cartographie optique des tranches cardiaques pour des enregistrements simultanés des potentiels transmembranes et de la dynamique intracellulaire de calcium pour déterminer les effets des drogues étudiées.
Introduction
Les modèles animaux ont été un outil précieux utilisé pour comprendre les mécanismes sous-jacents de la physiologie humaine et de la pathophysiologie, ainsi qu’une plate-forme pour les tests préliminaires des thérapies pour traiter diverses maladies1. De grands progrès ont été réalisés dans le domaine de la recherche biomédicale sur la base de ces études animales2. Cependant, il existe d’importantes différences entre les espèces entre les physiologies humaines et animales, y compris les souris, les rats, les cochons d’Inde, les lapins, les moutons, les porcs et les chiens3,4. En conséquence, il y a eu de nombreuses thérapies médicamenteuses, géniques et cellulaires qui se sont montrées prometteuses au cours de l’étape de l’expérimentation animale, mais qui n’ont pas été à la hauteur des résultats des essais cliniques5. Pour combler cet écart, des myocytes cardiaques isolés et des cellules souches pluripotentes induites par l’homme (iPSC) ont été développés comme modèles pour tester la réponse de la physiologie humaine à divers médicaments et maladies6. Les cardiomyocytes dérivés de cellules souches ont été largement utilisés dans les systèmes d’organes sur puce comme substitut du cœur6,7,8. Cependant, l’utilité des cardiomyocytes dérivés de l’iPSC (iPSC-CM) est entravée par leur phénotype relativement immature et le manque de représentation de la sous-population de cardiomyocytes; le myocarde mature est une structure complexe composée de plusieurs types de cellules coexistantes tels que les fibroblastes, les neurones, les macrophages et les cellules endothéliales. D’autre part, les cardiomyocytes humains isolés sont électriquement matures, et différentes sous-populations de cardiomyocytes peuvent être obtenues en modifiant les paramètres de culture9. Pourtant, ces myocytes présentent généralement des morphologies potentielles d’action altérées en raison de l’absence de couplage cellule-cellule, de dé-différenciation rapide, et l’occurrence du comportement proarrhythmique in vitro10,11. Certaines des limitations ont été abordées par les modèles de culture cellulaire 3D des iPSC-CMs et des myocytes cardiaques. Ces modèles, qui incluent les sphéroïdes, les cultures 3D encapsulées d’échafaudage hydrogel, les tissus cardiaques modifiés (EHT) et les systèmes cardiaques sur puce, utilisent de multiples populations de cellules cardiaques telles que les cardiomyocytes, les fibroblastes et les cellules endothéliales. Ils s’auto-assemblent ou s’assemblent le long d’un échafaudage pour former des structures 3D, et certains reproduisent même la nature anisotrope complexe du myocarde. Ces modèles ont été rapportés pour avoir des cellules des phénotypes mûrs, des propriétés contractiles, et des profils moléculaires semblables au tissu cardiaque. Le système heart-on-a-chip permet également l’étude des effets systémiques dans les tests de dépistage de drogues et les modèles de maladies. Cependant, les modèles in vitro à base de cellules n’ont pas la matrice extracellulaire indigène et ne peuvent donc pas imiter avec précision l’électrophysiologie au niveau des organes. Les tranches cardiaques humaines, en revanche, ont une matrice extracellulaire intacte et des contacts cellulaires natifs, ce qui les rend utiles pour examiner plus précisément les propriétés arythmogènes du myocarde humain.
Les chercheurs ont développé des tranches organotypic cardiaques humaines comme plate-forme préclinique physiologique pour le dépistage aigu et chronique de drogues et pour étudier l’électrophysiologie cardiaque et la progression de la maladie cardiaque12,13,14,15,16,17,18,19. Comparés aux cardiomyocytes dérivés de l’iPSC, les tranches cardiaques humaines reproduisent plus fidèlement l’électrophysiologie cardiaque humaine adulte avec un phénotype cardiomyocyte mature. Par rapport aux cardiomyocytes humains isolés, les tranches cardiaques présentent des durées potentielles d’action physiologique en raison du couplage cellule-cellule bien conservé et de l’existence intrinsèque de leurs environnements intra- et extracellulaires indigènes.
Ce protocole décrit le processus de génération de tranches cardiaques humaines à partir de cœurs donneurs entiers, effectuant des études aiguës (c.-à-d. des heures) et chroniques (c.-à-d. des jours) pour tester les paramètres d’électrophysiologie cardiaque par la cartographie optique. Bien que ce protocole ne décrit que l’utilisation du tissu ventriculaire gauche (LV), il a été appliqué avec succès à d’autres régions du cœur ainsi qu’à d’autres espèces telles que les souris, les rats, les cobayes et les porcs14,20,21,22. Notre laboratoire utilise des cœurs entiers de donneurs humains qui ont été rejetés pour transplantation au cours des 5 dernières années, mais il est possible que ces mêmes procédures soient effectuées sur tous les tissus d’échantillons cardiaques de donneurs obtenus par d’autres moyens (p. ex., implantations, biopsies, myectomies) du dispositif d’assistance ventriculaire gauche [LVAD], tant que les tissus ont la capacité d’être sectionnés en cubes. La cartographie optique est utilisée pour l’analyse dans cette étude en raison de sa capacité à cartographier simultanément les potentiels d’action optique et les transitoires de calcium avec une haute résolution spatiale (100 x 100 pixels) et temporelle (>1 000 images/s). Des méthodes alternatives peuvent également être utilisées, telles que les tableaux multiélectrodes (MEA) ou les microélectrodes, mais ces techniques sont limitées par leurs résolutions spatiales relativement faibles. En outre, les MEA ont été conçus pour une utilisation avec des cultures cellulaires, et les microélectrodes pointues sont plus facilement gérées pour une utilisation avec des cœurs entiers ou de grands coins de tissu.
L’objectif de l’article est de permettre à un plus grand nombre de chercheurs d’utiliser les tissus cardiaques humains pour des études d’électrophysiologie cardiaque. Il convient de noter que la technologie décrite dans cet article est relativement simple et bénéfique pour les études à court terme (de l’ordre de plusieurs heures à plusieurs jours). Une culture biomimétique plus physiologique pour les études à plus long terme (de l’ordre des semaines) a été discutée et décrite par un certain nombre d’autres études12,18,23. La stimulation électrique, la charge mécanique et l’étirement des tissus sont des mécanismes de conditionnement avantageux qui peuvent aider à limiter l’apparition du remodelage des tissus in vitro12,,18,23.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ici, nous présentons des méthodes étape par étape pour obtenir des tranches cardiaques viables des coeurs humains cardioplegically arrêtés et pour caractériser fonctionnellement les tranches utilisant la double cartographie optique du potentiel transmembrane et du calcium intracellulaire. Avec l’environnement extracellulaire préservé et le couplage cellulaire indigène-cellule, les tranches cardiaques humaines peuvent être employées comme modèle précis du coeur humain pour la découverte scientifique fonda…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Le financement des NIH (subventions R21 EB023106, R44 HL139248 et R01 HL126802), de la fondation Leducq (projet RHYTHM) et d’une bourse postdoctorale de l’American Heart Association (19POST34370122) est reconnu avec gratitude.
Materials
| 1mL BD Syringe | Thomas Scientific | 309597 | |
| 2,3-butanedione monoxime | Sigma-Aldrich | B0753 | |
| 6 well culture plates | Corning | 3516 | |
| Biosafety cabinet | ThermoFisher Scientific | 1377 | |
| Blebbistatin | Cayman | 13186 | |
| Bubble Trap | Radnoti | 130149 | |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | C1016 | |
| Corning Cell Strainers | Fisher Scientific | 07-201-432 | |
| Di-4-ANEPPS | Biotium | stock solution at 1.25 mg/mL in DMSO | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| Dumont #3c Forceps | Fine Science Tools | 11231-20 | |
| Emission dichroic mirror | Chroma | T630LPXR-UF1 | |
| Emission filter (RH237) | Chroma | ET690/50m | |
| Emission Filter (Rhod2AM) | Chroma | ET590/33m | |
| Excitation dichroic mirror | Chroma | T550LPXR-UF1 | |
| Excitation Filter | Chroma | ET500/40x | |
| Falcon 50mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 14-959-49A | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| Heat exchanger | Radnoti | 158821 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Incubator | ThermoFisher Scientific | 50145502 | |
| Insulin Transferrin Selenium (ITS) | Sigma-Aldrich | I3146 | |
| LED excitation light source | Prizmatix | UHP-Mic-LED-520 | |
| Magnessium chloride hexahydrate | Sigma-Aldrich | M9272 | |
| Medium 199 | ThermoFisher Scientific | 11150059 | |
| Micam Ultima L type CMOS camera | Scimedia | N/A | |
| Minutien Pins | Fine Science Tools | 26002-10 | |
| Pennicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | |
| Peristaltic Pump | Cole Parmer | EW-07522-20 | |
| Platinum pacing wire | Alfa Aesar | 43275 | |
| Pluronic F127 | ThermoFisher Scientific | P6867 | nonionic, surfactant polyol |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P3911 | |
| Powerlab data acquisition and stimulator | AD Instruments | Powerlab 4/26 | |
| RH237 | Biotium | 61018 | |
| Rhod2AM | ThermoFisher Scientific | R1245MP | |
| Rhod-2AM | Invitrogen, Carlsbad, CA | ||
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S6014 | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S9625 | |
| Sterilizer, dry bead | Sigma-Aldrich | Z378550 | |
| Stone Oxygen Diffuser | Waterwood | B00O0NUVM0 | |
| TissueSeal – Histoacryl Topical Skin Adhesive | gobiomed | AESCULAP | |
| UltraPure Low Melting Point Agarose | Thermo Fisher Scientific | 16520100 | |
| Ultrasound sonicator | Branson 1800 | ||
| Vibratome | Campden Instruments | 7000 smz |
References
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