يصف هذا البروتوكول الإجراء الخاص بالقطع و زراعة شرائح القلب البشرية لاختبار الأدوية قبل الفحص، وتفاصيل استخدام الخرائط البصرية لتسجيل الجهد عبر المُجمب وإشارات الكالسيوم داخل الخلايا في وقت واحد من هذه الشرائح.
وقد تم مؤخرا تطوير الاستعدادات شريحة القلب الإنسان كمنصة لدراسات علم وظائف الأعضاء البشرية واختبار العلاج لسد الفجوة بين التجارب الحيوانية والسريرية. وقد استخدمت العديد من نماذج الحيوانات والخلايا لدراسة آثار المخدرات، ولكن هذه الاستجابات غالبا ما تختلف في البشر. تقدم شرائح القلب البشرية ميزة لاختبار المخدرات من حيث أنها مشتقة مباشرة من قلوب الإنسان قابلة للحياة. بالإضافة إلى الحفاظ على هياكل متعددة الخلايا، اقتران الخلايا الخلية، وبيئات مصفوفة خارج الخلية، يمكن استخدام شرائح الأنسجة القلبية البشرية لاختبار مباشر تأثير الأدوية التي لا تعد ولا تحصى على وظائف الأعضاء القلبية البشرية الكبار. ما يميز هذا النموذج عن غيرها من الاستعدادات القلب، مثل قلوب كاملة أو أسافين، هو أن شرائح يمكن أن تخضع للثقافة على المدى الطويل. على هذا النحو، تسمح شرائح القلب لدراسة الآثار الحادة والمزمنة للأدوية. وعلاوة على ذلك، فإن القدرة على جمع عدة مئات إلى ألف شريحة من قلب واحد يجعل هذا نموذجا عالي الإنتاجية لاختبار العديد من الأدوية بتركيزات وتركيبات مختلفة مع أدوية أخرى في نفس الوقت. يمكن إعداد الشرائح من أي منطقة معينة من القلب. في هذا البروتوكول، ونحن وصف إعداد شرائح البطين الأيسر عن طريق عزل مكعبات الأنسجة من الجدار الأيسر خالية البطين وجزئتها إلى شرائح باستخدام microtome تهتز عالية الدقة. ويمكن بعد ذلك أن تخضع هذه الشرائح لتجارب حادة لقياس الوظيفة الكهروفسية القلبية الأساسية أو مثقفة لدراسات المخدرات المزمنة. يصف هذا البروتوكول أيضا رسم الخرائط البصرية المزدوجة لشرائح القلب للتسجيلات المتزامنة لإمكانات الميكروم عبر الخلايا وديناميات الكالسيوم داخل الخلايا لتحديد آثار الأدوية التي يجري التحقيق فيها.
وقد كانت النماذج الحيوانية أداة قيمة تستخدم لفهم الآليات الكامنة في علم وظائف الأعضاء البشرية والفيزيولوجيا المرضية، فضلا عن منصة للاختبار الأولي للعلاجات لعلاج الأمراض المختلفة1. وقد اتخذت خطوات كبيرة في مجال البحوث الطبية الحيوية استنادا إلى هذه الدراسات الحيوانية2. ومع ذلك، توجد اختلافات كبيرة بين الأنواع بين علم وظائف الأعضاء البشرية والحيوانية، بما في ذلك الفئران والجرذان والخنازير الغينية والأرانب والأغنام والخنازير والكلاب3،4. ونتيجة لذلك، كان هناك العديد من الأدوية، الجينات، والعلاجات الخلية التي أظهرت الوعد خلال مرحلة اختبار الحيوانات ولكن فشلت في الارتقاء إلى مستوى النتائج في التجارب السريرية5. ولسد هذه الفجوة، تم تطوير الخلايا القلبية المعزولة والخلايا الجذعية متعددة القدرات التي يسببها الإنسان (iPSCs) كنماذج لاختبار استجابة علم وظائف الأعضاء البشرية لمختلف الأدوية والأمراض6. وقد استخدمت الخلايا الجذعية المشتقة cardiomyocytes على نطاق واسع في الجهاز على رقاقة النظم كبديل للقلب6,7,8. ومع ذلك، فإن فائدة القلب القلبي المشتق من iPSC (iPSC-CMs) تعوقها نوعها الظاهري غير الناضج نسبيًا وعدم تمثيل السكان الفرعيين في القلب و القلب؛ عضلة القلب ناضجة عبارة عن بنية معقدة تتألف من عدة أنواع الخلايا المتعايشة مثل الخلايا الليفية، والخلايا العصبية، الضامة، والخلايا البطانية. من ناحية أخرى ، تكون الخلايا القلبية البشرية المعزولة ناضجة كهربائيًا ، ويمكن الحصول على التشكيلات الفرعية القلبية المختلفة عن طريق تغيير معلمات الاستزراع9. لا يزال، هذه myocytes عموما عرض العمل المحتملة morphologies بسبب عدم وجود اقتران الخلية الخلية، سريع دي التمايز، وحدوث سلوك proarrhythmic في المختبر10،11. تم معالجة بعض القيود من قبل نماذج ثقافة الخلايا ثلاثية الأبعاد من iPSC-CMs و myocytes القلبية. هذه النماذج، التي تشمل spheroids، سقالة هيدروجيل مغلفة الثقافات 3D، أنسجة القلب المهندسة (EHTs)، وأنظمة القلب على رقاقة، واستخدام مجموعات الخلايا القلبية متعددة مثل خلايا القلب، الخلايا الليفية، والخلايا البطانية. إما أنها ذاتية التجمع أو التجمع على طول سقالة لتشكيل هياكل 3D، وبعض حتى إعادة إنتاج الطبيعة المعقدة أنيسروبيك من عضلة القلب. وقد تم الإبلاغ عن هذه النماذج أن يكون خلايا من الأنماط الظاهرية ناضجة، وخصائص انقباضية، وملامح الجزيئية مماثلة للأنسجة القلب. كما يسمح نظام القلب على رقاقة بدراسة الآثار النظامية في اختبار المخدرات ونماذج الأمراض. ومع ذلك، في النماذج المستندة إلى الخلايا في المختبر تفتقر إلى مصفوفة خارج الخلية الأصلي وبالتالي لا يمكن تقليد بدقة الجهاز مستوى الفيزيولوجيا الكهربائية. شرائح القلب البشري، على النقيض من ذلك، لديها مصفوفة خارج الخلية سليمة والمخالط الأصلية من الخلايا إلى الخلية، مما يجعلها مفيدة لمزيد من التدقيق في فحص خصائص عدم انتظام ضربات القلب البشرية.
وقد طور الباحثون شرائح الجهاز القلبي البشري كمنصة قبل كلينية فسيولوجية لاختبار الأدوية الحادة والمزمنة ودراسة الفيزيولوجيا الكهربائية القلبية وتطور أمراض القلب12,13,14,15,16,17,18,19. بالمقارنة مع الخلايا القلبية المشتقة من iPSC ، فإن شرائح القلب البشرية تكرر بأمانة أكبر أمراض القلب البشرية البالغة مع النمط الظاهري للقلب الناضج. بالمقارنة مع خلايا القلب البشرية المعزولة، شرائح القلب المعرض فترات العمل الفسيولوجية المحتملة بسبب اقتران الخلايا المحفوظة جيدا والوجود الجوهري لبيئاتهم داخل وخارج الخلية الأصلية.
يصف هذا البروتوكول عملية توليد شرائح القلب البشرية من قلوب المتبرعين بالكامل، وأداء دراسات حادة (أي ساعات طويلة) ومزمنة (أي أيام) لاختبار بارامترات الفيزيولوجيا الكهربائية القلبية عن طريق رسم الخرائط البصرية. في حين أن هذا البروتوكول يصف فقط استخدام أنسجة البطين الأيسر (LV) ، فقد تم تطبيقه بنجاح على مناطق أخرى من القلب وكذلك أنواع أخرى مثل الفئران والجرذان والخنازير الغينيةوالخنازير 14،20،21،22. يستخدم مختبرنا قلوب المتبرعين البشريين بالكامل التي تم رفضها للزرع على مدى السنوات الخمس الماضية ، ولكن من الممكن تنفيذ هذه الإجراءات نفسها على أي أنسجة عينة قلب متبرع تم الحصول عليها بوسائل بديلة (على سبيل المثال ، جهاز المساعدة البطيني الأيسر [LVAD] زرع ، خزعات ، استئصالات myectomies) طالما أن الأنسجة لديها القدرة على أن تكون مقطعة إلى مكعبات. يستخدم رسم الخرائط البصرية للتحليل في هذه الدراسة نظرا لقدرته على رسم خريطة في وقت واحد إمكانات العمل البصري والكالسيوم العابرين مع ارتفاع المكانية (100 × 100 بكسل) والزمانية (> 1000 إطار / ق) القرار. ويمكن أيضاً استخدام طرق بديلة، مثل صفيفات multielectrode (الاتفاقات المتعددة الأعراق) أو ميكروليكتروديس، ولكن هذه التقنيات محدودة بسبب دقة مكانيتها المنخفضة نسبياً. بالإضافة إلى ذلك، تم تصميم الاتفاقات MEA للاستخدام مع الثقافات الخلية، ويتم إدارة microelectrodes حادة أكثر سهولة للاستخدام مع قلوب كاملة أو أسافين الأنسجة الكبيرة.
الهدف من هذه المادة هو تمكين المزيد من الباحثين من استخدام أنسجة القلب البشرية لدراسات الفيزيولوجيا الكهربائية القلبية. وتجدر الإشارة إلى أن التكنولوجيا المذكورة في هذه المقالة بسيطة نسبيا ومفيدة للدراسات قصيرة الأجل (على سبيل ترتيب عدة ساعات إلى أيام). وقد نوقشت الثقافة الحيوية الفسيولوجية أكثر للدراسات على المدى الطويل (على ترتيب أسابيع) ووصفها عدد من الدراسات الأخرى12,18,23. التحفيز الكهربائي، والتحميل الميكانيكي، وتمتد الأنسجة هي آليات تكييف مفيدة التي يمكن أن تساعد على الحد من بداية في الأنسجة في المختبر إعادة عرض12،18،23.
هنا، ونحن نقدم خطوة بخطوة أساليب للحصول على شرائح القلب قابلة للحياة من القلب العضوب العضوبوق البشرية وتوصيف وظيفيا شرائح باستخدام رسم الخرائط البصرية المزدوجة من إمكانات عبر مومبيبرين والكالسيوم داخل الخلايا. مع الحفاظ على البيئة خارج الخلية والخلايا الأصلية اقتران الخلية، يمكن استخد…
The authors have nothing to disclose.
التمويل من قبل المعاهد القومية للصحة (المنح R21 EB023106، R44 HL139248، وR01 HL126802)، من قبل مؤسسة Leducq (مشروع الإيقاع) وجمعية القلب الأمريكية زمالة ما بعد الدكتوراه (19POST34370122) هي المعترف بها بامتنان.
1mL BD Syringe | Thomas Scientific | 309597 | |
2,3-butanedione monoxime | Sigma-Aldrich | B0753 | |
6 well culture plates | Corning | 3516 | |
Biosafety cabinet | ThermoFisher Scientific | 1377 | |
Blebbistatin | Cayman | 13186 | |
Bubble Trap | Radnoti | 130149 | |
Calcium chloride | Sigma-Aldrich | C1016 | |
Corning Cell Strainers | Fisher Scientific | 07-201-432 | |
Di-4-ANEPPS | Biotium | stock solution at 1.25 mg/mL in DMSO | |
DMSO | Sigma-Aldrich | D2650 | |
Dumont #3c Forceps | Fine Science Tools | 11231-20 | |
Emission dichroic mirror | Chroma | T630LPXR-UF1 | |
Emission filter (RH237) | Chroma | ET690/50m | |
Emission Filter (Rhod2AM) | Chroma | ET590/33m | |
Excitation dichroic mirror | Chroma | T550LPXR-UF1 | |
Excitation Filter | Chroma | ET500/40x | |
Falcon 50mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 14-959-49A | |
Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
Heat exchanger | Radnoti | 158821 | |
HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
Incubator | ThermoFisher Scientific | 50145502 | |
Insulin Transferrin Selenium (ITS) | Sigma-Aldrich | I3146 | |
LED excitation light source | Prizmatix | UHP-Mic-LED-520 | |
Magnessium chloride hexahydrate | Sigma-Aldrich | M9272 | |
Medium 199 | ThermoFisher Scientific | 11150059 | |
Micam Ultima L type CMOS camera | Scimedia | N/A | |
Minutien Pins | Fine Science Tools | 26002-10 | |
Pennicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | |
Peristaltic Pump | Cole Parmer | EW-07522-20 | |
Platinum pacing wire | Alfa Aesar | 43275 | |
Pluronic F127 | ThermoFisher Scientific | P6867 | nonionic, surfactant polyol |
Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P3911 | |
Powerlab data acquisition and stimulator | AD Instruments | Powerlab 4/26 | |
RH237 | Biotium | 61018 | |
Rhod2AM | ThermoFisher Scientific | R1245MP | |
Rhod-2AM | Invitrogen, Carlsbad, CA | ||
Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S6014 | |
Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S9625 | |
Sterilizer, dry bead | Sigma-Aldrich | Z378550 | |
Stone Oxygen Diffuser | Waterwood | B00O0NUVM0 | |
TissueSeal – Histoacryl Topical Skin Adhesive | gobiomed | AESCULAP | |
UltraPure Low Melting Point Agarose | Thermo Fisher Scientific | 16520100 | |
Ultrasound sonicator | Branson 1800 | ||
Vibratome | Campden Instruments | 7000 smz |