Denne protokol beskriver proceduren for dyrkning og dyrkning af menneskelige hjerteskiver til præklinisk lægemiddeltest og beskriver brugen af optisk kortlægning til registrering af transmembranespænding og intracellulære calciumsignaler samtidigt fra disse skiver.
Human hjerte skive præparater er for nylig blevet udviklet som en platform for human fysiologi undersøgelser og terapi test for at bygge bro mellem dyr og kliniske forsøg. Talrige dyre- og cellemodeller er blevet brugt til at undersøge virkningerne af narkotika, men disse reaktioner er ofte forskellige hos mennesker. Menneskelige hjerte skiver giver en fordel for test af lægemidler i, at de er direkte afledt af levedygtige menneskelige hjerter. Ud over at have bevaret flercellede strukturer, celle-celle kobling, og ekstracellulære matrix miljøer, kan humant hjertevæv skiver bruges til direkte at teste effekten af utallige lægemidler på voksne menneskelige hjertefysiologi. Hvad adskiller denne model fra andre hjerte præparater, såsom hele hjerter eller kiler, er, at skiver kan blive udsat for mere langsigtet kultur. Som sådan, hjerte skiver mulighed for at studere de akutte såvel som kroniske virkninger af narkotika. Endvidere, evnen til at indsamle flere hundrede til tusind skiver fra et enkelt hjerte gør dette til en high-throughput model til at teste flere lægemidler i varierende koncentrationer og kombinationer med andre lægemidler på samme tid. Skiver kan fremstilles fra en given region af hjertet. I denne protokol beskriver vi forberedelsen af venstre ventrikelskiver ved at isolere vævsterninger fra venstre ventrikelfri væg og skære dem i skiver ved hjælp af en højpræcisions vibrerende mikrotom. Disse skiver kan derefter enten blive udsat for akutte eksperimenter til at måle baseline hjerte elektrofysiologiske funktion eller dyrkes for kroniske lægemiddelundersøgelser. Denne protokol beskriver også dobbelt optisk kortlægning af hjerteskiver til samtidige registreringer af transmembrane potentialer og intracellulære calciumdynamik for at bestemme virkningerne af de lægemidler, der undersøges.
Dyremodeller har været et værdifuldt redskab, der anvendes til at forstå de underliggende mekanismer i menneskers fysiologi og patofysiologi, samt en platform for indledende test af behandlinger til behandling af forskellige sygdomme1. Der er gjort store fremskridt inden for biomedicinsk forskning baseret på disse dyreforsøg2. Der er dog betydelige forskelle mellem forskelligearter mellem humane og animalske fysiologier, herunder mus, rotter, marsvin, kaniner, får, svin og hunde3,4. Som et resultat, der har været mange lægemidler, gen, og celle behandlinger, der viste lovende under dyreforsøg fase, men undlod at leve op til resultaterne i kliniske forsøg5. At bygge bro over denne kløft, isolerede hjerte myocytter og human induceret pluripotente stamceller (iPSCs) blev udviklet som modeller til at teste reaktionen af human fysiologi til forskellige lægemidler og sygdomme6. Stamcelleafledte kardiomyocytter har været meget udbredt i organ-on-a-chip systemer som et surrogat for hjertet6,7,8. Nytten af iPSC-afledte kardiomyocytter (iPSC-CMs) hæmmes imidlertid af deres relativt umodne fænotype og den manglende repræsentation af kardiomyocyt-delpopulationen. det modne myokardi er en kompleks struktur bestående af flere samektiske celletyper såsom fibroblaster, neuroner, makrofager og endotelceller. På den anden side, isolerede menneskelige kardiomyocytter er elektrisk modne, og forskellige cardiomyocyt subpopulationer kan opnås ved at ændre dyrkning parametre9. Stadig, disse myocytter generelt udviser ændret handling potentielle morfologier på grund af manglen på celle-celle kobling, hurtig afdædisisering, og forekomsten af proarytmisk adfærd in vitro10,11. Nogle af begrænsningerne blev behandlet af 3D cellekultur modeller af iPSC-CMs og hjerte myocytter. Disse modeller, som omfatter sfæroider, hydrogel stillads indkapslet 3D-kulturer, manipuleret hjertevæv (EHTs), og hjerte-på-en-chip-systemer, bruge flere hjertecellepopulationer såsom kardiomyocytter, fibroblaster, og endotelceller. De enten selvsamle eller samle langs et stillads til at danne 3D-strukturer, og nogle endda reproducere den komplekse anisotropiske karakter af myokardiet. Disse modeller er blevet rapporteret at have celler af modne fænotyper, kontraktile egenskaber, og molekylære profiler svarende til hjertevæv. Hjerte-på-en-chip-systemet giver også mulighed for at studere systemiske virkninger i test af lægemidler og sygdomsmodeller. In vitro-cellebaserede modeller mangler imidlertid den oprindelige ekstracellulære matrix og kan derfor ikke nøjagtigt efterligne elektrofysiologi på organniveau. Menneskelige hjerte skiver, derimod, har en intakt ekstracellulær matrix og indfødte celle-til-celle kontakter, hvilket gør dem nyttige for mere præcist at undersøge arytmogene egenskaber af det menneskelige myokardi.
Forskere har udviklet humane karditoypiske skiver som en fysiologisk præklinisk platform for akut og kronisk lægemiddeltest og til at studere hjerteelektrofysiologi og hjertesygdomsprogression12,13,14,15,16,17,18,19. Sammenlignet med iPSC-afledte kardiomyocytter replikerer humane hjerteskiver mere trofast voksne humane hjerteelektrofysiologi med en moden kardiomyocytfænotype. Sammenlignet med isolerede humane kardiomyocytter udviser hjerteskiver fysiologiske virkningsgrader på grund af den velbevarede cellecellekobling og den iboende eksistens af deres oprindelige intra- og ekstracellulære miljøer.
Denne protokol beskriver processen med at generere menneskelige hjerteskiver fra hele donorhjerter, udføre akut (dvs. timer lange) og kroniske (dvs. dage lange) undersøgelser for at teste hjerteelektrofysiologi parametre via optisk kortlægning. Mens denne protokol beskriver kun brugen af venstre ventrikelvæv (LV), er det blevet anvendt med succes på andre områder af hjertet samt andre arter såsom mus, rotter, marsvin og svin14,,20,,21,22. Vores laboratorium bruger hele menneskelige donor hjerter, der er blevet afvist til transplantation i de sidste 5 år, men det er muligt for de samme procedurer, der skal udføres på enhver donor hjerte prøve væv opnået ved hjælp af alternative midler (f.eks venstre venttrikulær hjælpeenhed [LVAD] implantationer, biopsier, myectomies), så længe væv har evnen til at blive opdelt i terninger. Optisk kortlægning anvendes til analyse i denne undersøgelse på grund af sin evne til samtidig at kortlægge optiske actionpotentialer og calciumtransienter med høj rumlig (100 x 100 pixels) og tidsmæssig (>1.000 frames/s) opløsning. Alternative metoder kan også anvendes, såsom multielektrode arrays (MEAs) eller mikroelektroder, men disse teknikker er begrænset af deres relativt lave rumlige opløsninger. Derudover blev MEA’er designet til brug sammen med cellekulturer, og skarpe mikroelektroder håndteres lettere til brug med hele hjerter eller store vævskiler.
Målet med artiklen er at gøre det muligt for flere forskere at bruge humane hjertevæv til hjerteelektrofysiologiundersøgelser. Det skal bemærkes, at den teknologi, der er beskrevet i denne artikel er relativt enkel og gavnlig for kortsigtede undersøgelser (i størrelsesordenen flere timer til dage). Mere fysiologisk biomimetisk kultur for længerevarende undersøgelser (i ugerækkefølgen) er blevet drøftet og beskrevet i en række andre undersøgelser12,18,23. Elektrisk stimulation, mekanisk belastning, og væv stretching er fordelagtige konditionering mekanismer, der kan hjælpe med at begrænse starten af in vitro væv remodellering12,,18,23.
Her præsenterer vi trin-for-trin metoder til at opnå levedygtige hjerte skiver fra kardioplegically anholdt menneskelige hjerter og funktionelt karakterisere skiver ved hjælp af dobbelt optisk kortlægning af transmembrane potentiale og intracellulære calcium. Med bevaret ekstracellulært miljø og native celle-celle kobling, kan menneskelige hjerteskiver bruges som en nøjagtig model af det menneskelige hjerte for grundlæggende videnskabelig opdagelse og for effektivitet og kardiotoksicitet test af farmakologiske a…
The authors have nothing to disclose.
Støtte fra NIH (tilskud R21 EB023106, R44 HL139248 og R01 HL126802), af Leducq foundation (projekt RHYTHM) og en American Heart Association Postdoctoral Fellowship (19POST34370122) er taknemmeligt anerkendt.
1mL BD Syringe | Thomas Scientific | 309597 | |
2,3-butanedione monoxime | Sigma-Aldrich | B0753 | |
6 well culture plates | Corning | 3516 | |
Biosafety cabinet | ThermoFisher Scientific | 1377 | |
Blebbistatin | Cayman | 13186 | |
Bubble Trap | Radnoti | 130149 | |
Calcium chloride | Sigma-Aldrich | C1016 | |
Corning Cell Strainers | Fisher Scientific | 07-201-432 | |
Di-4-ANEPPS | Biotium | stock solution at 1.25 mg/mL in DMSO | |
DMSO | Sigma-Aldrich | D2650 | |
Dumont #3c Forceps | Fine Science Tools | 11231-20 | |
Emission dichroic mirror | Chroma | T630LPXR-UF1 | |
Emission filter (RH237) | Chroma | ET690/50m | |
Emission Filter (Rhod2AM) | Chroma | ET590/33m | |
Excitation dichroic mirror | Chroma | T550LPXR-UF1 | |
Excitation Filter | Chroma | ET500/40x | |
Falcon 50mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 14-959-49A | |
Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
Heat exchanger | Radnoti | 158821 | |
HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
Incubator | ThermoFisher Scientific | 50145502 | |
Insulin Transferrin Selenium (ITS) | Sigma-Aldrich | I3146 | |
LED excitation light source | Prizmatix | UHP-Mic-LED-520 | |
Magnessium chloride hexahydrate | Sigma-Aldrich | M9272 | |
Medium 199 | ThermoFisher Scientific | 11150059 | |
Micam Ultima L type CMOS camera | Scimedia | N/A | |
Minutien Pins | Fine Science Tools | 26002-10 | |
Pennicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | |
Peristaltic Pump | Cole Parmer | EW-07522-20 | |
Platinum pacing wire | Alfa Aesar | 43275 | |
Pluronic F127 | ThermoFisher Scientific | P6867 | nonionic, surfactant polyol |
Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P3911 | |
Powerlab data acquisition and stimulator | AD Instruments | Powerlab 4/26 | |
RH237 | Biotium | 61018 | |
Rhod2AM | ThermoFisher Scientific | R1245MP | |
Rhod-2AM | Invitrogen, Carlsbad, CA | ||
Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S6014 | |
Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S9625 | |
Sterilizer, dry bead | Sigma-Aldrich | Z378550 | |
Stone Oxygen Diffuser | Waterwood | B00O0NUVM0 | |
TissueSeal – Histoacryl Topical Skin Adhesive | gobiomed | AESCULAP | |
UltraPure Low Melting Point Agarose | Thermo Fisher Scientific | 16520100 | |
Ultrasound sonicator | Branson 1800 | ||
Vibratome | Campden Instruments | 7000 smz |