Summary

Präklinische Kardiale Elektrophysiologie Bewertung durch Dual Voltage und Calcium Optical Mapping of Human Organotypic Cardiac Slices

Published: June 16, 2020
doi:

Summary

Dieses Protokoll beschreibt das Verfahren zum Schneiden und Kultivieren menschlicher Herzscheiben für präklinische Arzneimitteltests und beschreibt die Verwendung von optischen Kartierungen zur gleichzeitigen Aufzeichnung von Transmembranspannung und intrazellulären Calciumsignalen aus diesen Scheiben.

Abstract

Humane Herzscheibenpräparate wurden vor kurzem als Plattform für Studien zur menschlichen Physiologie und Therapietests entwickelt, um die Lücke zwischen tier- und klinischen Studien zu überbrücken. Zahlreiche Tier- und Zellmodelle wurden verwendet, um die Wirkung von Medikamenten zu untersuchen, aber diese Reaktionen unterscheiden sich oft beim Menschen. Menschliche Herzscheiben bieten einen Vorteil für Arzneimitteltests, da sie direkt von lebensfähigen menschlichen Herzen abgeleitet sind. Neben der Erhaltung multizellulärer Strukturen, Zell-Zell-Kopplung und extrazellulärer Matrixumgebungen können menschliche Herzgewebescheiben verwendet werden, um die Wirkung unzähliger Medikamente auf die menschliche Herzphysiologie bei Erwachsenen direkt zu testen. Was dieses Modell von anderen Herzpräparaten wie ganzen Herzen oder Keilen unterscheidet, ist, dass Scheiben längerfristig kulturgemäß kultiviert werden können. Als solche, Herzscheiben ermöglichen die Untersuchung der akuten sowie chronischen Auswirkungen von Medikamenten. Darüber hinaus macht die Fähigkeit, mehrere hundert bis tausend Scheiben von einem einzigen Herzen zu sammeln, dies zu einem Hochdurchsatzmodell, um mehrere Medikamente in unterschiedlichen Konzentrationen und Kombinationen mit anderen Medikamenten gleichzeitig zu testen. Scheiben können aus jeder Region des Herzens zubereitet werden. In diesem Protokoll beschreiben wir die Herstellung von linksventrikulären Scheiben, indem wir Gewebewürfel von der linksventrikulären freien Wand isolieren und sie mit einem hochpräzisen vibrierenden Mikrotom in Scheiben schneiden. Diese Scheiben können dann entweder akuten Experimenten unterzogen werden, um die elektrische Ausgangsfunktion zu messen, oder für chronische Arzneimittelstudien kultiviert werden. Dieses Protokoll beschreibt auch die doppelte optische Kartierung von Herzscheiben für gleichzeitige Aufnahmen von Transmembranpotentialen und intrazellulärer Kalziumdynamik, um die Auswirkungen der untersuchten Medikamente zu bestimmen.

Introduction

Tiermodelle sind ein wertvolles Werkzeug zum Verständnis der zugrunde liegenden Mechanismen der menschlichen Physiologie und Pathophysiologie, sowie eine Plattform für Vortests von Therapien zur Behandlung verschiedener Krankheiten1. Auf der Grundlage dieser Tierstudien wurden große Fortschritte auf dem Gebiet der biomedizinischen Forschung erzielt2. Es bestehen jedoch erhebliche Unterschiede zwischen menschlichen und tierischen Physiologien, einschließlich Mäusen, Ratten, Meerschweinchen, Kaninchen, Schafen, Schweinen und Hunden3,4. Infolgedessen gab es zahlreiche Arzneimittel-, Gen- und Zelltherapien, die während der Tierversuche vielversprechend waren, aber den Ergebnissen in klinischen Studien nicht gerecht wurden5. Um diese Lücke zu überbrücken, wurden isolierte Herzmyozyten und vom Menschen induzierte pluripotente Stammzellen (iPSCs) als Modelle entwickelt, um die Reaktion der menschlichen Physiologie auf verschiedene Medikamente und Krankheiten zu testen6. Stammzell-abgeleitete Kardiomyozyten sind weit verbreitet in Organ-on-a-Chip-Systemen als Ersatz des Herzens6,7,8verwendet worden. Die Nützlichkeit von iPSC-abgeleiteten Kardiomyozyten (iPSC-CMs) wird jedoch durch ihren relativ unreifen Phänotyp und die mangelnde Repräsentation der Kardiomyozyten-Subpopulation behindert; Das reife Myokard ist eine komplexe Struktur, die aus mehreren koexistierenden Zelltypen wie Fibroblasten, Neuronen, Makrophagen und Endothelzellen besteht. Auf der anderen Seite sind isolierte menschliche Kardiomyozyten elektrisch ausgereift, und verschiedene Kardiomyozytensubpopulationen können durch Änderung der Kultivierungsparameter erhalten werden9. Dennoch weisen diese Myozyten in der Regel veränderte Wirkungspotentialmorphologien auf, da es an Zell-Zell-Kopplung, schneller Entdifferenzierung und dem Auftreten proarrhythmischen Verhaltens in vitro10,11fehlt. Einige der Einschränkungen wurden durch 3D-Zellkulturmodelle von iPSC-CMs und Herzmyozyten behoben. Diese Modelle, zu denen Sphäroide, Hydrogelgerüste, gekapselte 3D-Kulturen, technische Herzgewebe (EHTs) und Herz-auf-ein-Chip-Systeme gehören, verwenden mehrere Herzzellpopulationen wie Kardiomyozyten, Fibroblasten und Endothelzellen. Sie bauen sich entweder selbst zusammen oder montieren sich entlang eines Gerüstes zu 3D-Strukturen, und einige reproduzieren sogar die komplexe anisotrope Natur des Myokards. Diese Modelle haben Berichten zufolge Zellen von reifen Phänotypen, kontraktilen Eigenschaften und molekularen Profilen ähnlich wie Herzgewebe. Das Heart-on-a-Chip-System ermöglicht auch die Untersuchung systemischer Wirkungen in Medikamententests und Krankheitsmodellen. In vitro zellbasierten Modellen fehlt jedoch die native extrazelluläre Matrix und kann daher die Elektrophysiologie auf Organebene nicht genau imitieren. Menschliche Herzscheiben hingegen haben eine intakte extrazelluläre Matrix und native Zell-zu-Zell-Kontakte, was sie für eine genauere Untersuchung arrhythmogener Eigenschaften des menschlichen Myokards nützlich macht.

Forscher haben menschliche kardiale organotypische Scheiben als physiologische präklinische Plattform für akute und chronische Arzneimitteltests entwickelt und zur Untersuchung der Herzelektrophysiologie und der Herzkrankheitsprogression12,13,14,15,16,17,18,19. Im Vergleich zu iPSC-abgeleiteten Kardiomyozyten replizieren menschliche Herzscheiben die erwachsene menschliche Herzelektrophysiologie mit einem reifen Kardiomyozyten-Phänotyp getreuer. Im Vergleich zu isolierten menschlichen Kardiomyozyten weisen Herzscheiben aufgrund der gut erhaltenen Zell-Zell-Kopplung und der intrinsischen Existenz ihrer nativen intra- und extrazellulären Umgebungen physiologische Wirkungspotenziale auf.

Dieses Protokoll beschreibt den Prozess der Erzeugung menschlicher Herzscheiben aus ganzen Spenderherzen, die Durchführung akuter (d. h. stundenlanger) und chronischer (d. h. tagelanger) Studien zur Erprobung der Kardialelektrophysiologie-Parameter mittels optischer Kartierung. Während dieses Protokoll nur die Verwendung des linksventrikulären Gewebes (LV) beschreibt, wurde es erfolgreich auf andere Regionen des Herzens sowie andere Arten wie Mäuse, Ratten, Meerschweinchen und Schweine14,20,21,22angewendet. Unser Labor verwendet ganze menschliche Spenderherzen, die in den letzten 5 Jahren für eine Transplantation abgelehnt wurden, aber es ist möglich, dass dieselben Verfahren an allen Spenderherzprobengeweben durchgeführt werden, die auf alternative Weise gewonnen werden (z. B. linksventrikuläre Hilfsmittel [LVAD]-Implantationen, Biopsien, Myektomien), solange das Gewebe in Würfel geschnitten werden kann. Optisches Mapping wird in dieser Studie aufgrund seiner Fähigkeit verwendet, optische Aktionspotentiale und Kalziumtransienten mit hoher räumlicher (100 x 100 Pixel) und zeitlicher Auflösung (>1.000 Frames/s) gleichzeitig abzubilden. Alternative Methoden können auch verwendet werden, wie Multielektroden-Arrays (MEAs) oder Mikroelektroden, aber diese Techniken sind durch ihre relativ geringen räumlichen Auflösungen begrenzt. Darüber hinaus wurden MEAs für die Verwendung mit Zellkulturen entwickelt, und scharfe Mikroelektroden sind einfacher für die Verwendung mit ganzen Herzen oder großen Gewebekeilen zu verwalten.

Ziel des Artikels ist es, mehr Forschern die Verwendung menschlicher Herzgewebe für die Kardialelektrophysiologie zu ermöglichen. Es sollte beachtet werden, dass die in diesem Artikel beschriebene Technologie relativ einfach und vorteilhaft für Kurzzeitstudien ist (in der Größenordnung von mehreren Stunden bis Tagen). Mehr physiologische biomimetische Kultur für längerfristige Studien (in der Größenordnung von Wochen) wurde diskutiert und beschrieben durch eine Reihe von anderen Studien12,18,23. Elektrische Stimulation, mechanische Belastung und Gewebedehnung sind vorteilhafte Konditionierungsmechanismen, die helfen können, den Beginn der In-vitro-Gewebe-Remodellierung12,18,23zu begrenzen.

Protocol

Alle beschriebenen Methoden wurden in Übereinstimmung mit allen institutionellen, nationalen und internationalen Leitlinien für das Wohlergehen der Menschen durchgeführt. Die Forschung wurde vom Institution Review Board (IRB) an der George Washington University genehmigt. HINWEIS: Spender menschliche Herzen wurden von Washington Regional Transplant Community als deidentifiziertes entsorgtes Gewebe mit Genehmigung der George Washington University IRB erworben. Explantierte Herzen werden kard…

Representative Results

Menschliche organotypische Scheiben wurden aus der linken Herzkammer eines Spenders menschliches Herz gemäß dem oben beschriebenen Protokoll gesammelt und inAbbildung 1. Ein optisches Kartensystem mit zwei Kameras wie inAbbildung 2wurde in der aufrechten Bildgebungskonfiguration verwendet, um nach Abschluss des Schneidprotokolls eine simultane optische Kartierung von Spannung und Kalzium etwa 1 h durchzuführen. Die Daten wurden mit RHYTHM1.2 (<strong class="x…

Discussion

Hier stellen wir Schritt-für-Schritt-Methoden vor, um lebensfähige Herzscheiben aus kardioplegisch verhafteten menschlichen Herzen zu erhalten und die Scheiben funktionell mit Hilfe der doppelten optischen Kartierung von Transmembranpotenzial und intrazellulärem Kalzium zu charakterisieren. Mit einer erhaltenen extrazellulären Umgebung und nativer Zell-Zell-Kopplung können menschliche Herzscheiben als genaues Modell des menschlichen Herzens für grundlegende wissenschaftliche Entdeckungen und für Wirksamkeits- und …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Die Finanzierung durch die NIH (Grants R21 EB023106, R44 HL139248 und R01 HL126802), durch die Leducq Foundation (Projekt RHYTHM) und ein American Heart Association Postdoctoral Fellowship (19POST34370122) werden dankbar gewürdigt.

Materials

1mL BD Syringe Thomas Scientific 309597
2,3-butanedione monoxime Sigma-Aldrich B0753
6 well culture plates Corning 3516
Biosafety cabinet ThermoFisher Scientific 1377
Blebbistatin Cayman 13186
Bubble Trap Radnoti 130149
Calcium chloride Sigma-Aldrich C1016
Corning Cell Strainers Fisher Scientific 07-201-432
Di-4-ANEPPS Biotium stock solution at 1.25 mg/mL in DMSO
DMSO Sigma-Aldrich D2650
Dumont #3c Forceps Fine Science Tools 11231-20
Emission dichroic mirror Chroma T630LPXR-UF1
Emission filter (RH237) Chroma ET690/50m
Emission Filter (Rhod2AM) Chroma ET590/33m
Excitation dichroic mirror Chroma T550LPXR-UF1
Excitation Filter Chroma ET500/40x
Falcon 50mL Conical Centrifuge Tubes Fisher Scientific 14-959-49A
Glucose Sigma-Aldrich G8270
Heat exchanger Radnoti 158821
HEPES Sigma-Aldrich H3375
Incubator ThermoFisher Scientific 50145502
Insulin Transferrin Selenium (ITS) Sigma-Aldrich I3146
LED excitation light source Prizmatix UHP-Mic-LED-520
Magnessium chloride hexahydrate Sigma-Aldrich M9272
Medium 199 ThermoFisher Scientific 11150059
Micam Ultima L type CMOS camera Scimedia N/A
Minutien Pins Fine Science Tools 26002-10
Pennicillin-Streptomycin Sigma-Aldrich P4333
Peristaltic Pump Cole Parmer EW-07522-20
Platinum pacing wire Alfa Aesar 43275
Pluronic F127 ThermoFisher Scientific P6867 nonionic, surfactant polyol
Potassium chloride Sigma-Aldrich P3911
Powerlab data acquisition and stimulator AD Instruments Powerlab 4/26
RH237 Biotium 61018
Rhod2AM ThermoFisher Scientific R1245MP
Rhod-2AM Invitrogen, Carlsbad, CA
Sodium bicarbonate Sigma-Aldrich S6014
Sodium chloride Sigma-Aldrich S9625
Sterilizer, dry bead Sigma-Aldrich Z378550
Stone Oxygen Diffuser Waterwood B00O0NUVM0
TissueSeal – Histoacryl Topical Skin Adhesive gobiomed AESCULAP
UltraPure Low Melting Point Agarose Thermo Fisher Scientific 16520100
Ultrasound sonicator Branson 1800
Vibratome Campden Instruments 7000 smz

References

  1. Ericsson, A. C., Crim, M. J., Franklin, C. L. A brief history of animal modeling. Missouri Medicine. 110 (3), 201-205 (2013).
  2. Choudhary, A., Ibdah, J. A. Animal models in today’s translational medicine world. Missouri Medicine. 110 (3), 220-222 (2013).
  3. Perlman, R. L. Mouse models of human disease: An evolutionary perspective. Evolution, Medicine, and Public Health. 2016 (1), 170-176 (2016).
  4. Milani-Nejad, N., Janssen, P. M. L. Small and large animal models in cardiac contraction research: advantages and disadvantages. Pharmacology & Therapeutics. 141 (3), 235-249 (2014).
  5. Green, A. R. Why do neuroprotective drugs that are so promising in animals fail in the clinic? An industry perspective. Clinical and Experimental Pharmacology and Physiology. 29 (11), 1030-1034 (2002).
  6. Shinnawi, R., Gepstein, L. iPCS cell modeling of inherited cardiac arrhythmias. Current Treatment Options in Cardiovascular Medicine. 16 (9), 331 (2014).
  7. Morimoto, Y., Mori, S., Sakai, F., Takeuchi, S. Human induced pluripotent stem cell-derived fiber-shaped cardiac tissue on a chip. Lab on a Chip. 16 (12), 2295-2301 (2016).
  8. Wang, G., et al. Modeling the mitochondrial cardiomyopathy of Barth syndrome with induced pluripotent stem cell and heart-on-chip technologies. Nature Medicine. 20 (6), 616-623 (2014).
  9. Ben-Ari, M., et al. Developmental changes in electrophysiological characteristics of human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Heart Rhythm. 13 (12), 2379-2387 (2016).
  10. Goversen, B., van der Heyden, M. A. G., van Veen, T. A. B., de Boer, T. P. The immature electrophysiological phenotype of iPSC-CMs still hampers in vitro drug screening: Special focus on IK1. Pharmacology & Therapeutics. 183, 127-136 (2018).
  11. Zhang, Y., et al. Dedifferentiation and proliferation of mammalian cardiomyocytes. PloS One. 5 (9), 12559 (2010).
  12. Watson, S. A., et al. Biomimetic electromechanical stimulation to maintain adult myocardial slices in vitro. Nature Communications. 10, 2168 (2019).
  13. Fischer, C., et al. Long-term functional and structural preservation of precision-cut human myocardium under continuous electromechanical stimulation in vitro. Nature Communications. 10, 117 (2019).
  14. Ou, Q., et al. Physiological Biomimetic Culture System for Pig and Human Heart Slices. Circulation Research. 125 (6), 628-642 (2019).
  15. Qiao, Y., et al. Multiparametric slice culture platform for the investigation of human cardiac tissue physiology. Progress in Biophysics and Molecular Biology 2. 144, 139-150 (2019).
  16. Kang, C., et al. Human Organotypic Cultured Cardiac Slices: New Platform For High Throughput Preclinical Human Trials. Scientific Reports. 6, 28798 (2016).
  17. Camelliti, P., et al. Adult human heart slices are a multicellular system suitable for electrophysiological and pharmacological studies. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 51 (3), 390-398 (2011).
  18. Brandenburger, M., et al. Organotypic slice culture from human adult ventricular myocardium. Cardiovascular Research. 93 (1), 50-59 (2012).
  19. Watson, S. A., et al. Preparation of viable adult ventricular myocardial slices from large and small mammals. Nature Protocols. 12 (12), 2623-2639 (2017).
  20. Halbach, M., et al. Ventricular slices of adult mouse hearts – A new multicellular in vitro model for electrophysiological studies. Cellular Physiology and Biochemistry. 18 (1-3), 1-8 (2006).
  21. Wang, K., et al. Cardiac tissue slices: preparation, handling, and successful optical mapping. American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 308 (9), 1112-1125 (2015).
  22. Bussek, A., et al. Cardiac tissue slices with prolonged survival for in vitro drug safety screening. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 66 (2), 145-151 (2012).
  23. Watson, S. A., Terracciano, C. M., Perbellini, F. Myocardial Slices: an Intermediate Complexity Platform for Translational Cardiovascular Research. Cardiovascular Drugs and Therapy. 33 (2), 239-244 (2019).
  24. Rouwkema, J., Koopman, B. F. J. M., Blitterswijk, C. A. V., Dhert, W. J. A., Malda, J. Supply of nutrients to cells in engineered tissues. Biotechnology and Genetic Engineering Reviews. 26 (1), 163-178 (2009).
  25. Lang, D., Sulkin, M., Lou, Q., Efimov, I. R. Optical mapping of action potentials and calcium transients in the mouse heart. Journal of Visualized Experiments. (55), e3275 (2011).
  26. Brianna, C., et al. Open-Source Multiparametric Optocardiography. Scientific Reports. 9, 721 (2019).
  27. George, S. A., et al. Modulating cardiac conduction during metabolic ischemia with perfusate sodium and calcium in guinea pig hearts. American Journal of Physiology – Heart and Circulatory Physiology. 316 (4), 849-861 (2019).
  28. Kawara, T., et al. Activation delay after premature stimulation in chronically diseased human myocardium relates to the architecture of interstitial fibrosis. Circulation. 104 (25), 3069-3075 (2001).
  29. Qu, Y., et al. Action potential recording and pro-arrhythmia risk analysis in human ventricular trabeculae. Frontiers in Physiology. 5 (8), 1109 (2018).
  30. Franz, M. R., Swerdlow, C. D., Liem, L. B., Schaefer, J. Cycle length dependence of human action potential duration in vivo. Effects of single extrastimuli, sudden sustained rate acceleration and deceleration, and different steady-state frequencies. Journal of Clinical Investigation. 82 (3), 972-979 (1988).
  31. Lou, Q., et al. Transmural heterogeneity and remodeling of ventricular excitation- contraction coupling in human heart failure. Circulation. 123 (17), 1881-1890 (2011).

Play Video

Cite This Article
George, S. A., Brennan, J. A., Efimov, I. R. Preclinical Cardiac Electrophysiology Assessment by Dual Voltage and Calcium Optical Mapping of Human Organotypic Cardiac Slices. J. Vis. Exp. (160), e60781, doi:10.3791/60781 (2020).

View Video