Summary
在这里，我们描述了一种协议，使用全孔免疫荧光、组织清除、共聚焦显微镜和3D重建来可视化和分析小鼠胚胎的咽弓动脉3、4和6。
Abstract
咽弓动脉（PAA）3、4和6的不当形成或重塑导致一些最严重的先天性心脏病。为了研究PAA的形成，我们开发了一种方案，使用全支式免疫荧光结合苯基醇/苯甲酸苯甲酸酯（BABB）组织清除和共聚焦显微镜。这允许以精细的细胞分辨率可视化咽喉拱内体，以及血管的 3D 连接。使用软件，我们建立了一个协议，以量化PAA中的内皮细胞 （EC） 数量，以及咽喉拱门 3、4 和 6 内围绕 PAA 的血管丛中的 E 数。该方法应用于整个胚胎时，对胚胎血管进行综合的可视化和定量分析。
Introduction
在小鼠胚胎形成期间，咽喉弓动脉（PAAs）出现为对称的两侧动脉对，将心脏与背动脉1连接起来。随着胚胎的发展，第一和第二对PAA回归，而第3、4和6PAA经历一系列不对称的重塑事件，形成主动脉2。
PAAs 3、4 和 6 通过血管生成而发展，这是血管的脱层3。这些弓动脉形成或改造的缺陷导致各种先天性心脏缺陷，如在DiGeorge综合征44，55患者看到。因此，理解调节PAA发展的机制可以导致对先天性心脏病（CHD）病因的更好理解。
目前用于可视化和分析PAA发展的方法包括组织部分的免疫荧光、血管铸件、印度墨水注射、高分辨率的异见显微镜和/或全卡免疫组织化学11、4、5、6、7。4,5,6,7在这里，我们描述了一种结合全载式免疫荧光、共聚焦显微镜和3D图像渲染的协议，以便收集、分析和量化体积数据、血管连接性和细胞识别。此外，我们详细介绍了一种将每个咽喉拱中的ECs数量分割和量化的方法，作为研究咽喉弓血管丛的形成及其重新改造到PAA的方法。虽然该协议是专为分析PAA发展而设计的，但它可用于分析其他正在发育的血管网络。
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Protocol
罗格斯大学机构动物护理和使用委员会批准了动物使用和程序。
1. 准备解决方案
- 用 0.1% Triton-X-100 （PBST） 制备 1 L 的磷酸盐缓冲盐水，并消毒过滤器。此解决方案可在室温 （RT） 下存储至少一年。
- 准备600μL的阻塞缓冲液，由PBST中正常驴血清的10%组成。每次使此解决方案新鲜。
- 在流量罩中制备以下 50 mL 甲醇 （MeOH） 稀释剂：在去离子水中 （dH2O） 中的 25% MeOH，在 dH2O 中制备 50% MeOH，在 dH2O 中混合 75% MeOH。存储在 RT 中。
- 在50 mL锥形管中制备以下50 mL的苯基醇-苯甲酸酯（BABB）溶液。
- 对于 100% BABB，将 32 mL 苯甲酸苯甲酸添加到 16 mL 的苯基醇（每体积比 2：1 体积）。
- 对于 50% BABB，将 16 mL 苯甲酸苯甲酸苯甲酸苯甲酸酯和 8 mL 苯基醇加入到 24 mL 的 MeOH 中。
- 用铝箔覆盖锥形管，防止光线照射。这些解决方案可在 RT 中存储长达一年。
注意事项：BABB 具有毒性和腐蚀性。应根据 MSDS 处理和处置。
2. 胚胎解剖和固定
注：此协议适用于从任何小鼠应变中分离的 E9.5 和 E10.5 小鼠胚胎（雄或雌性）。对于更年轻和年长的胚胎，应经实验确定孵化时间，以最大化荧光信号的信号与噪声比。
- 用 1x PBS 填充一个 35 mm 和一个 60 mm 的培养皿，并放置在冰上，直到需要为止。
- 通过CO2吸入对怀孕的小鼠进行安乐死。作为安乐死的次要措施，进行宫颈错位。
- 用70%乙醇清洁大坝的腹部区域。使用钳子捏住腹部区域，使用手术剪刀从中线腹壁底部开始，进行V型切口;继续打开胸腔。抬起腹部组织，将肠子移到一侧，露出子宫角。
- 在阴道管的底座上切开，用钳子将子宫从大坝上拉开。在每个卵巢上做一个额外的切口，以释放子宫。将子宫转移到含有冷1x PBS的60毫米培养皿之一。
- 使用直剪刀，在每个植入部位之间切割子宫壁。拿起一个带有玻璃移液管的二分，然后转移到35毫米的培养皿与1xPBS。在解剖显微镜下，将直剪刀插入二分和子宫壁之间的空间。切割并拆下子宫壁。
- 用细钳子，通过小心地沿着组织进行横向切口，并将组织从蛋黄囊中拉开，从胚胎中取出二分体和赖歇特的膜。通过小心地将组织从胚胎中拉开，并在异体炎和脐带静脉上切开，去除蛋黄囊和羊水囊。
注：蛋黄囊可用于基因分型胚胎。 - 用玻璃移液将每个胚胎转移到单独的 2 mL 管中，管子中填充 1 mL 的 1x PBS。使用唯一标识符标记每个管。
- 要修复胚胎，请小心地取出 1x PBS，并在 1x PBS 中加入 4% 的甲醛 （PFA） 溶液。在4°C孵育，一夜之间用温和的搅拌。
注：4%PFA 固定适用于该协议中提到的抗体。但是，固定程序应针对其他抗体进行优化。
3. 胚胎染色
注：在本节中，胚胎渗透并沾染原抗体和继发抗体。由于PAA开发进行迅速，胚胎阶段的差异将极大地影响下游的分析。因此，胚胎必须经过仔细计数的躯体来匹配对照组和突变对，才能在进一步操作之前与年龄相匹配。
- 要洗涤胚胎，请小心地去除4%的PFA并加入1倍PBS。轻轻反转管子几次。将管子放在右侧，让胚胎下沉。重复洗涤3次。将带胚胎的管子放在冰上。
注：（可选停止点）在进行完注后，胚胎可以在分级系列的MeOH中脱水，每次稀释30min，如第1.3节，并储存在-20°C的100%MeOH，供以后使用长达6个月。 - 对于 E10.5 胚胎，使用玻璃移液管将一个胚胎转移到充满冷冻 1x PBS 的 35 mm 培养皿中。小心地用细钳子将胚胎捏在后肢上方，进行横向切割，以去除后半部分的胚胎。这允许胚胎平躺在一个凹陷位置的步骤4.2。用新鲜的1x PBS将胚胎放回2 mL管中。
注：对照胚胎和突变胚胎可以在一个管中配对并染色相同的抗体溶液，步骤3.3到3.8。- 如果将两个胚胎染色在一起，则用细钳子捏下一个胚胎的头部，以进行横向切割。这将区分每个管内两种不同基因型的胚胎。
- 为了渗透胚胎，从管子里伸出1xPBS，小心不要接触胚胎。添加 1 mL 的 PBST。将管置于 4°C 处，一夜之间轻轻搅拌。
注：（可选停止点）胚胎可以在4°C的PBST溶液中保存数天。 - 为了防止抗体的非特异性结合，首先从管子中取出PBST，小心不要接触胚胎。在胚胎中加入600 μL的阻塞缓冲液。在4°C下用柔和的搅拌在4°C处挡住胚胎。
注：在使用前，需要在台式离心机上以最高速度旋转阻塞溶液，以清除碎屑。 - 要染色和量化 E，请使用针对 VEGFR2 和 ERG 的抗体。抗体溶液在阻塞缓冲液中制造。抗VEGFR2抗体稀释1：200，ERG抗体稀释1：1000。
注：抗体溶液在使用前需要在台式离心机上以最高速度旋转，然后才能清除颗粒物。- 要用原抗体孵育胚胎，请从管子中取出阻塞缓冲液，小心不要接触胚胎。在每个管中加入600 μL的原抗体溶液。在4°C下用温和搅拌孵育胚胎4-5天。
- 要洗净抗体溶液的胚胎，请先从管子中取出主要抗体溶液。在室温 （RT） 下，在室温下使用 1 mL 的 PBST，每小时用 1 mL 的 PBST 进行洗涤胚胎，并轻轻搅拌。在白天洗4-5次胚胎，然后在4°C下用温和的搅拌孵育过夜。第二天重复进行重点。
- 通过稀释抗山羊Alexa Fluor 488和抗小鼠Alexa Fluor 555 1：300在阻塞缓冲液，使二次抗体解决方案。稀释块缓冲液中的库存 DAPI 1：1000。
注：抗体溶液必须在使用前立即在台式离心机上以最高速度旋转，然后才能清除颗粒物。此外，其他Alexa氟染料可用于代替488或555。- 要用继发抗体孵育胚胎，请从管子中取出PBST。在每个管中加入600 μL的二次抗体溶液。在4°C下用温和搅拌孵育胚胎4-5天。
- 要洗净抗体溶液的胚胎，请先从管子中取出二次抗体溶液。在RT用1 mL的PBST在RT上用温和的搅拌洗涤胚胎。在白天洗4-5次胚胎，然后在4°C下用温和的搅拌孵育过夜。第二天重复进行重点。
4. 在阿加罗斯中植入胚胎
注：在第4节中，胚胎将嵌入在琼脂中。这种嵌入过程有两个目的：在成像前正确定向胚胎，并在BABB中清除胚胎后帮助定位胚胎（步骤5.2.2- 5.3.2）。
- 通过将 2 克琼脂糖加入 200 mL 的 dH2O. 微波，直到所有琼脂溶解，制备 200 mL 的 1% 琼脂糖溶液。
注：剩余的琼脂可储存在4°C，并重新加热供以后使用。 - 使用塑料石蜡模具和玻璃移液管，轻轻地将一个胚胎转移到模具中。小心地从胚胎中取出PBST。将胚胎置于凹陷位置。快速，在模具中加入约0.5 mL的热脂糖 - 刚好够覆盖胚胎并填充模具。确保胚胎周围没有气泡。
- 将模具放在冰上，用铝箔盖住，直到琼脂凝固。
注：在去除PBST后，不要让胚胎干燥。阿加罗斯溶液必须足够温暖，才能在添加到胚胎中时保持液体。只加入足够的琼脂覆盖胚胎，但不要太多，否则将很难成像。图像深度部分由目标的工作距离决定。
5. 脱水和组织清理
注：在本节中，胚胎使用甲醇系列脱水，然后在有机溶剂BABB中清除，并安装在由橡胶垫片分离的两个盖玻片之间;在此协议中使用快速井橡胶垫块。快速井保险杠具有双面粘合表面。垫片是创建一个井，其中胚胎将被放置和保持在两个盖玻片之间。
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甲醇脱水
- 标记新的 2 mL 管，每个胚胎一个。每管加入 1 mL 25% MeOH。
- 使用干净的手术刀，轻轻地切开胚胎周围的琼脂，在胚胎周围留下足够的，以便它可以通过钳子拾取。使用细钳轻轻抓住植入胚胎的琼脂，并将其放入带有 25% MeOH 标签的管中。不要让钳子接触胚胎。
- 在黑暗中用温和的搅拌在RT孵化胚胎1小时。
- 从管子中取出25%的MeOH，小心不要触摸胚胎。每管加入 1 mL 50% MeOH。在黑暗中用温柔的搅拌在RT孵育1小时。
- 从管子中取出50%的MeOH，小心不要触摸胚胎。每管加入 1 mL 75% MeOH。在黑暗中用温柔的搅拌在RT孵育1小时。
- 从管子中取出75%的MeOH，小心不要触摸胚胎。每管加入 1 mL 100% MeOH。在黑暗中用温柔的搅拌在RT孵育1小时。重复 100% MeOH 洗涤两次。
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使用 BABB 结算
- 从管子中取出100%MeOH，小心不要触摸胚胎。每管加入1 mL 50% BABB。在黑暗中用温柔的搅拌在RT孵育1小时。
- 从管子中取出50%的BABB，小心不要接触胚胎。每管加入1 mL 100%BABB。在黑暗中用温柔的搅拌在RT孵育1小时。重复 100% BABB 洗涤两次。
注：（可选停止点）胚胎可以在管中保持100%BABB约一周。更长的储存会导致BABB溶解管的塑料。
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安装用于成像的胚胎
- 将快速井保险杠放在 24 mm x 60 mm #1.5 玻璃盖滑滑上，从一侧剥去塑料胶粘剂。通过在橡胶保险杠上的塑料胶粘剂施加温和的压力，确保盖玻片和保险杠之间没有气泡。根据胚胎数量、基因型和用于染色的抗体标记盖玻片。
注：只要其厚度足以防止挤压或挤压胚胎，任何垫片都可以放置在盖玻片之间。我们使用快速井垫片，由于其厚度和便利性，其中包括垫片两侧的粘合表面，用于将其固定到盖玻片上。 - 小心地移出管，然后从管子中丢弃 100% BABB。在管中可视化阿加罗斯嵌入的胚胎后，使用细钳子拾取琼脂，并小心地将胚胎转移到快速井内的盖玻片上 - 不要让钳子接触胚胎。
- 从保险杠上取下第二个塑料粘合剂，并将第二个盖玻片放在顶部。轻轻按压盖玻片可去除气泡。小心不要打碎玻璃。
注：如果密封紧密，样品可以平放在 RT 黑暗中的滑动支架中长达一年。
- 将快速井保险杠放在 24 mm x 60 mm #1.5 玻璃盖滑滑上，从一侧剥去塑料胶粘剂。通过在橡胶保险杠上的塑料胶粘剂施加温和的压力，确保盖玻片和保险杠之间没有气泡。根据胚胎数量、基因型和用于染色的抗体标记盖玻片。
6. 获取数据
注：在以下步骤中，将使用共聚焦显微镜对咽喉拱门 3、4 和 6 的内窥镜进行成像。
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幻灯片在显微镜舞台上的定位
- 要对胚胎进行成像，请使用配备 20 倍水浸式目标、数值孔径 0.95、工作距离 0.95 mm 和 NIS-元素 AR 5.11.01 64 位软件的共聚焦显微镜。
- 使用宽场荧光，直观地定位咽喉拱门。围绕第 4个PAA 的字段视图进行居中。
- 如果目标的视场没有捕获整个咽喉拱形区域，则拍摄并缝合具有 1% 重叠的大图像面板。为防止样品在获取大图像过程中移动，使用模塑粘土轻轻将盖板组件固定到舞台上。
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设置采集参数
- 将针孔大小设置为 1.0。
- 在ND 采集选项卡下，使用粗调整设置成像的顶部和底部限制。根据软件规格设置 Z 步长大小。确定可按目标工作距离和样品清晰度进行成像的厚度。
- 由于胚胎的厚度，调整整个Z堆栈的增益。为每个通道（405、488 和 555）设置 Z 堆栈中间的激光强度和增益，并在"Z 强度校正"选项卡下分配值。
- 滚动穿过胚胎，直到荧光信号开始出现变暗。增加每个通道的增益，直到信号强度与上一段相似。在Z 强度校正选项卡下分配新值。重复，直到 z 堆栈完成。将设置导入回ND 获取。
- 使用运行 Z 校正选项运行扫描。
7. 使用 Imaris 软件进行分析
注：在这些步骤中，将使用 Imaris 版本 9.2.0 的显微镜图像分析软件分析共聚焦图像。在此分析中，我们将首先选择要通过创建曲面来分析的感兴趣区域。接下来，我们将使用蒙版函数直观地分隔这些区域。最后，我们将使用Spot函数来量化每个感兴趣区域内的 E 数。
- 根据步骤 6 中使用的成像软件，使用Imaris 文件转换器将图像转换为 .ims。
- 打开 .ims 文件。将图像设置为"相机/标签"下的正交 |摄像机类型面板。
- 找到 PAA 并定向图像以进行曲面。
注： 首次打开文件时，它们将显示为所有图像切片的 3D 编译。在此步骤中，PAA 将通过将 3D 图像转换为 2D 图像来定位。然后，2D 图像允许 PAA 正确定向进行分析。- 在"属性"面板下，关闭"音量"。在"属性"面板下，单击"添加新的正交切片器"。将切片方向设置为XY 平面。使用"切片位置"滚动图像，直到找到 PAA。
- 如果 PAA 与图像的顶部和底部不平行，请使用鼠标光标自由旋转图像，以便 PAA 在屏幕上从左到右运行。在"图像处理"下拉菜单下，选择"自由旋转"并单击"确定"。
- 浮出水面的第3个Pharyngeal拱门（图2A，B - B"）
注：在这些步骤中，将使用Surface工具跟踪咽喉拱门和 PAA，以生成感兴趣的"表面"区域。这将允许每个感兴趣的区域从周围组织的视觉隔离。在这里，我们描述了表面和分析第三咽弓的内皮分量的步骤。Pharyngeal 拱门 4 和 6 也进行了类似的分析。- 要在整个第 3 个咽喉拱门中显示内皮，请单击"新建曲面"按钮，该按钮位于"属性"面板下方。双击曲面 1并将新曲面重命名为"第3 个咽喉拱门"。
- 选择"跳过自动创建"，手动编辑。将曲面方向设置为 YZ 平面（冠状方向）。使用切片位置将第 3个咽喉拱面平面放置到第 3个PAA 和多尔萨尔 Aorta 连接的位置。
- 旋转图像，以便第3咽弓拱面平面在视图中。关闭正交切片器 1。
- 在抽奖 |轮廓 |模式选项卡，选择"距离绘制模式"功能。如果需要，调整参数设置。保持样品之间的一致曲面参数。在此示例中，顶点间距为 10 μm。
- 要开始浮出水面，请按Esc键，然后单击"绘制"按钮。用鼠标光标跟踪第3咽弓的周长。使用"切片位置"移动 10-25 个切片。追踪咽弓的周长。重复，直到咽弓完全追踪。
- 要生成跟踪区域的表面，请在"属性"面板中选择"创建曲面"按钮。
- 表面第3 个PAA （图 2C- C"）
- 要显示第 3 个PAA 的内皮，首先通过取消选择第 3个Pharyngeal 拱门曲面框，从步骤 7.4 关闭曲面区域。然后，再次单击"添加新曲面"按钮。双击曲面 1并将新曲面重命名为"第 3个 PAA"。
- 选择"跳过自动创建"，手动编辑。将曲面方向设置为 YZ 平面（冠状方向）。使用切片位置将第 3个PAA 平面放置到第3 个PAA 和多尔萨尔 Aorta 连接的位置，然后重复步骤 7.4。
- 表面结构的遮蔽
注： 在以下步骤中，每个显示感兴趣的区域将被屏蔽。遮罩允许感兴趣的区域在视觉上不同于成像组织的其余部分，并允许对这些不同的感兴趣结构进行量化。下面，我们描述了 Imaris 中用于可视化和分析 PAA 内皮质的步骤，以及丛 - 咽喉拱门内围绕 PAA 的较小血管。在这些步骤中，将屏蔽第 3 个PAA 曲面，以便仅使用第 7.7 节中描述的 Spot 函数对 PAA 进行可视化和执行分析。- 选择"音量"以可视化所有蒙版通道。按Esc键以旋转图像并将图像定位到 XY 位置。
- 在"编辑"选项卡下，选择第 3个PAA 的蒙版选择。选择 DAPI 通道并单击"确定"。对其余通道重复上述步骤。
- 在键盘上，按Ctrl + D以查看"显示调整"面板。选择每个新频道并重命名它们，以明确每个频道显示的内容。例如，这将导致三个新的通道："第三个PAA DAPI"，"第三个PAA ERG"和"第三个PAA VEGFR2"。
注：在步骤 7.6.4-7.6.7 中，我们将只为咽喉弓形丛创建通道。 - 为了将内皮丛与 PAA 分开可视化，我们将首先为第 3个PAA 曲面选择蒙版选择。选择 DAPI 通道。取消选中"选择曲面外部的体素"，并选中"选择曲面内的体素到按钮"，将曲面内的"选择体素"设置为零。单击"确定"。
- 对其余通道重复上述步骤。此操作将从新的屏蔽通道中排除包含 PAA 的区域。重命名通道以明确每个通道显示的内容。例如，这将导致三个新的渠道："非PAA DAPI"，"非PAA ERG"和"非PAA VEGFR2"。
- 要可视化第 3 咽弓中的内皮丛，请在"编辑"选项卡下为第 3 个咽喉拱门曲面选择"蒙版选择"。选择非 PAA DAPI通道。单击"确定"。
- 对剩余的非 PAA 通道重复上述步骤。重命名通道以明确每个通道显示的内容。例如，这将导致三个新的渠道："Plexus DAPI"，"Plexus ERG"和"Plexus VEGFR2"。
- 欧共体编号的量化
注：ERG 的表达标记内皮核，便于量化 EC 数。在这些步骤中，将使用 Spot 函数量化 EC 的数量，以生成 PAA 和丛中 ERG 表达式标记的每个 EC 的点。在第7.7节中，将生成蒙面PAA中每个ERG阳性细胞的斑点，然后取消选择ERG阳性、VEGFR2阴性细胞中的斑点。- 在键盘上，按Ctrl + D以查看"显示调整"面板。关闭除 PAA ERG 以外的所有通道。
- 在"属性"选项卡下，单击"添加新点"按钮。单击点 1并将其重命名为"PAA 总数量的 E"。单击蓝色箭头按钮。对于源通道，选择 PAA ERG 通道。将估计 XY 直径调整到 4 μm。单击蓝色箭头按钮，继续进入下一个面板。
- 调整使用滑动刻度看到的点数，以确保每个 EC 核（由 ERG 表达式标记）由一个点表示。单击绿色双箭头按钮。
- 关闭显示调整中的 PAA ERG 通道。打开 PAA VEGFR2 通道以可视化 PAA 内皮。
- 为了准确量化 EC 的数量，我们确保每个点同时表示 EC 标记、ERG 和 VEGFR2。为此，请在"编辑"选项卡下选择"对象曲面" |添加/删除面板。按Esc键，通过按住班次并选择该点，删除任何未为 VEGFR2 正位的点。
注：在以下步骤中，将生成蒙版丛中每个ERG阳性细胞的斑点，然后取消选择ERG阳性、VEGFR2阴性细胞中的点。 - 在"属性"选项卡下，单击"添加新点"按钮。选择"点 1"并重命名为"PC 总数"。单击蓝色箭头按钮。对于源通道，选择 Plexus ERG 通道。将估计 XY 直径调整到 4 μm。对于 Plexus 的 E 总数重复步骤 7.7.1 - 7.7.5。
- 单击每个点函数的"统计信息"选项卡，确定第 3 个PAA 和咽弓丛中的 E 总数。
- 对剩余的 PAA 和咽弓丛重复步骤 7.7.1 - 7.7.6。
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Representative Results
此处介绍的全载免疫荧光协议产生清晰、干净的结果，允许对咽喉拱内皮进行3D重建，如图1A所示。在每个抗体溶液中孵育胚胎足够长的时间以确保通过样品完全渗透，以及彻底清洗胚胎后抗体孵育，这一点非常重要。在图 1B中，大而明亮的点是抗体或阻塞缓冲液溶液中微粒的结果。我们发现，每次抗体孵育后，在使用前离心每个溶液和较长的PBST沐散期解决了这个问题。
图 2说明了用于表面的咽弓和 PAA 以进行分析的过程，如协议第 7 节所述。使用屏蔽功能，Imaris 软件允许视觉分隔和分析表面区域。
图3显示了咽喉拱门中不同血管室的单独遮蔽：PAA（图3A、B、C）和丛（图3A'、B'、C'）。屏蔽允许分别分析和量化每个结构中的 EC 编号。在图 3C-C'中，Spot 特征用于量化 PAA 和丛中的 E 总数，为每个表示 ERG 的原子核分配一个点。请务必注意，Spot 函数使用的算法旨在为指定大小的任何像素生成点。ERG，这里用作EC核的标记，也表达在神经峰细胞8;神经峰细胞不表达VEGFR2。图 3D显示了 Imaris Spot 函数生成的 ERG 阳性（绿色）、VEGFR2 阴性（粉红色）点的示例。因此，必须验证每个点是否表示单个 EC，并同时标有 ERG 和 VEGFR2。
| 步 | 时间 | 温度 | |
| 1 | PBST 洗涤/渗透 | 24 小时或 O/N | 4 °C |
| 2 | 阻塞缓冲区 | 25 小时或 O/N | 4 °C |
| 3 | 原抗体 | 4-5 天 | 4 °C |
| 4 | PBST 洗涤 | 每天4-5次，为期2天 | RT（如果 O/N，或 4 °C） |
| 5 | 二次抗体 | 4-5 天 | 4 °C |
| 6 | PBST 洗涤 | 每天4-5次，为期2天 | RT（如果 O/N，或 4 °C） |
| 7 | 嵌入 | 不适用 | Rt |
| 8 | 甲醇脱水和BABB | 每步 1 小时 | Rt |
表1：整个安装免疫荧光方案概述。O/N - 隔夜;RT - 室温。
图1：全安装免疫荧光后清洁和脏的图像比较。E10.5胚胎的射手视图显示使用抗VEGFR2抗体（白色）来可视化PAA内皮。与未彻底清洗的胚胎（B）相比，用PBST后抗体孵育（A）彻底洗涤的胚胎具有更高的信噪比，并产生更清晰的图像。B中的箭头显示图像中未彻底清洗或抗体溶液未离心时出现的噪声/污垢区域。请点击此处查看此图形的较大版本。
图2：咽弓（PA）和PAA的浮出水面。2D 下垂视图 （A） 用于标识共聚焦图像中 PAA 的位置。日冕正交切片器 （A， 黄线） 通过 PAA 放置.然后，使用 Imaris 中的距离绘图工具，在日冕方向中显示咽弓 （B） 和 PAA （C） .距离绘图工具设置为 10 μm，用于跟踪第 3咽弓（B） 或 PAA （C） 的周长。轮廓通过整个拱门（B'，C'）每 10-25 个切片绘制。轮廓组合起来，生成咽弓（B）或 PAA （C）的 3D 表面。请点击此处查看此图形的较大版本。
图 3：PAA 和丛中 EC 编号的量化。3D 重建用于在 PAA 或 EC 丛中分别可视化容器结构和 EC 标记的表达式。面板A-A'在 PAA（A， 黄色） 和丛 （A'， 粉红色） 显示 VEGFR2 的表达。面板A"说明了 PAA 和丛 VEGFR2 表达式的合并。面板B-B'在 PAA（B， 红色） 和丛 （B'， 绿色） 显示 ERG 的表达。面板B"说明了 PAA 和丛的合并。C-C'.Imaris 中的 Spot 函数用于量化 PAA 或丛中的 E 数。PAA（C、红色） 或丛中的每个 ERG 阳性细胞 （C'， 绿色） 被分配一个点来标记单个 EC。C'-D中的箭头显示了 Imaris Spot 函数生成的丛中 ERG 阳性、VEGFR2 负点示例。此点被排除在量化之外。请点击此处查看此图形的较大版本。
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Discussion
在3D小鼠胚胎中可视化内皮的能力为小鼠胚胎的发展提供了新的见解。在这里，我们提出了一个协议，允许对胚胎进行高分辨率的3D成像，血管连接的可视化，以及PAA形成的定量分析。该协议可用于查看基因改变或环境侮辱如何影响 PAA 发展。此处报告的程序使用针对VEGFR2和ERG的抗体来可视化PAA形成和量化EC编号;然而，额外的抗体可用于可视化和分析弓动脉发展的其他方面，如神经峰的招募或平滑的肌肉细胞分化。如果这个程序要在胚胎形成的早期阶段使用，重要的是要注意，在该协议中检测到的某些抗原（例如ERG）可能尚未表达。其他核污渍，如DAPI或DRAQ5或带有核标记的跟踪器的血统标记可用于量化EC编号。
协议内有几个关键步骤：确保 1 ）胚胎不会在溶液变化之间燥 ;2） 胚胎在抗体孵育后彻底清洗;和3）胚胎完全脱水与MeOH之前组织清除与BABB。
在组织清理之前，甲醇的冲刷有两个目的：消除由于胚胎中荧光蛋白（例如用于系系追踪的EGFP或tdTomato的表达）引起的荧光，以及使组织脱水。消除荧光蛋白中的荧光允许使用任何组合的荧光波进行成像。针对EGFP和TdTomato（樱桃）的抗体可用于可视化这些荧光蛋白的表达。或者，MeOH可以替换为四氢富兰，以保持荧光蛋白的荧光9。
我们发现，由于光散射，在BABB清除之前未适当脱水的胚胎很难成像。BABB 是一种疏水性溶液，需要有机溶剂完全脱水才能清除不透明组织。完全清除确保能够在胚胎10，11,11内获得尽可能深的水平的图像。在此协议中，我们使用了 20 倍的水浸式目标，因为在我们的实验时，它工作距离长，可用。油浸式目标更适合此协议，因为 BABB 和油的折射率比水和 BABB 更接近。然而，尽管折射率存在差异，但该协议中使用的水浸式目标提供了出色的图像质量。
此协议有一些限制。这里使用的BABB清除是有毒和腐蚀性的11，12，13。,12,13BABB溶解胶水和塑料。如果在成像过程中处理不当样品，则 BABB 可能会损坏显微镜客观透镜，该镜头可能通过盖玻片的裂纹或快速井保险杠和盖玻片之间的密封破裂而从样品中逸出。不使用有机溶剂的清除方法，如CLARITY，可用作替代品10，11，14。10,11,14CLARITY的折射率匹配解决方案具有与水类似的折射率，如果使用水浸式目标，则具有合适的清除方法。该协议的另一个限制是，它只能在非活组织上执行，从而阻止其应用活成像。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
我们感谢布赖恩娜·亚历山大、曹兰·奥唐纳和迈克尔·沃卡拉仔细阅读和编辑这份手稿。这项工作得到了NIH R01 HL103920、R01 HL134935、R21 OD025323-01至SA国家心脏、肺血研究所的资助;AJR得到NHLBI HL103920-08S1和国家关节炎和肌肉骨骼和皮肤病训练补助金T32052283-11的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10x PBS | MP Biomedicals | PBS10X02 | |
| 20x water immersion objective | Nikon | MRD77200 | |
| Agarose | Bio-Rad Laboratories | 1613101 | |
| Alexa Fluor 488 anti-goat | Invitrogen | A-11055 | |
| Alexa Fluor 555 anti-mouse | Invitrogen | A-31570 | |
| Analysis Software | Imaris 9.2.0 | ||
| Benzyl Alcohol | Sigma-Aldrich | 305197 | |
| Benzyl Benzoate | Sigma-Aldrich | 8.18701.0100 | |
| Cover Slips | VWR | 16004-312 | |
| DAPI (5 mg/mL stock) | Fisher Scientific | D3571 | |
| Eppendorf Tubes (2.0 mL) | Fisher Scientific | 05-408-138 | |
| Ethanol | VWR | 89370-084 | |
| Falcon tubes (50 mL) | Corning | 352098 | |
| Fast wells | Grace Bio Labs | 664113 | |
| Forceps | Roboz | RS-5015 | |
| Goat anti-VEGFR2 | R&D Systems, Inc. | AF644 | |
| Methanol | VWR | BDH1135-4LP | |
| Microscope | Nikon | A1HD25 | |
| Mouse anti-ERG | Abcam | ab214341 | |
| Normal Donkey Serum | Sigma-Aldrich | D9663 | |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| Pasteur pipets | Fisher Scientific | 13-678-20D | |
| Petri dishes (35 mm) | Genesee Scientific | 32-103 | |
| Petri dishes (60 mm) | Genesee Scientific | 32-105 | |
| Plastic Molds | VWR | 18000-128 | |
| Scapels | Exelint International Co. | 29552 | |
| Triton-X-100 | Fisher Scientific | BP 151-500 |
References
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