Summary

Visualisatie en analyse van faryngeale boogslagaders met behulp van Whole-mount Immunohistochemie en 3D Reconstructie

Published: March 31, 2020
doi:

Summary

Hier beschrijven we een protocol om de faryngeale boogslagaders 3, 4 en 6 muisembryo’s te visualiseren en te analyseren met behulp van immunofluorescentie, weefselclearing, confocale microscopie en 3D-reconstructie.

Abstract

Onjuiste vorming of remodelleren van de faryngeale boogslagaders (PAA’s) 3, 4 en 6 dragen bij aan enkele van de meest ernstige vormen van aangeboren hart-en vaatziekten. Om de vorming van PAA’s te bestuderen, ontwikkelden we een protocol met behulp van immunofluorescentie van de hele berg in combinatie met benzylalcohol/benzylbenzoaat (BABB) weefselclearing en confocale microscopie. Dit maakt de visualisatie van de faryngeale boog endotheel op een fijne cellulaire resolutie evenals de 3D-connectiviteit van de vasculatuur. Met behulp van software hebben we een protocol opgesteld om het aantal endotheelcellen (EV’s) in PAA’s te kwantificeren, evenals het aantal E’s in de vasculaire plexus rond de PAA’s binnen faryngeale bogen 3, 4 en 6. Wanneer toegepast op het hele embryo, biedt deze methodologie een uitgebreide visualisatie en kwantitatieve analyse van embryonale vasculatuur.

Introduction

Tijdens de embryogenese van de muis ontstaan faryngeale boogslagaders (PAA’s) als symmetrische, tweelaterale paren slagaders die het hart verbinden met de dorsaleaorta1. Naarmate het embryo zich ontwikkelt, de eerste en tweede paar PAA’s achteruit, terwijl de3e,4e, en 6e PAA’s ondergaan een reeks van asymmetrische remodelleren gebeurtenissen om de aortaboog slagaders te vormen2.

Paa’s 3, 4 en 6 ontwikkelen zich via vasculogene, dat is de de novo vorming van bloedvaten3. Afwijkingen in de vorming of remodelleren van deze boogslagaders leiden tot verschillende aangeboren hartafwijkingen, zoals die gezien bij patiënten met digeorge syndroom4,5. Daarom kan het begrijpen van mechanismen die de ontwikkeling van PAA’s reguleren leiden tot een beter begrip van aangeboren hart-en vaatziekten (CHD) etiologie.

De huidige benaderingen voor het visualiseren en analyseren van PAA-ontwikkeling omvatten immunofluorescentie van weefselsecties, vaatwerpt, India-inktinjectie, hoge resolutie episcopic microscopie en/of immunohistochemie aan de hele berg1,4,5,6,7. Hierin beschrijven we een protocol dat hele immunofluorescentie, confocale microscopie en 3D-beeldweergave combineert om volumetrische gegevens, vasculaire connectiviteit en celidentiteit te verzamelen, analyseren en kwantificeren. Verder detailleren we een methode om de aantallen EC’s in elke faryngeale boog te compartimenteren en te kwantificeren als een middel om de vorming van de faryngeale boog vasculaire plexus en de remodelleren ervan in de PAA’s te bestuderen. Hoewel dit protocol is ontworpen voor het analyseren van PAA-ontwikkeling, kan het worden gebruikt om andere zich ontwikkelende vasculaire netwerken te analyseren.

Protocol

Het gebruik en de procedures van dieren zijn goedgekeurd door het Institutioneel Comité voor dierverzorging en -gebruik van de Rutgers-universiteit. 1. Voorbereiding van oplossingen Bereid 1 L fosfaatgebufferde zoutoplossing voor met 0,1% Triton-X-100 (PBST) en filtersteriliseren. Deze oplossing kan minstens een jaar bij kamertemperatuur (RT) worden bewaard. Bereid 600 μL blokkerende buffer voor die bestaat uit 10% van het normale ezelserum in PBST. Maak deze oplossing el…

Representative Results

Het hier gepresenteerde immunofluorescentieprotocol met hele mount levert duidelijke en schone resultaten op, waardoor de 3D-reconstructie van faryngeale boogendotheel mogelijk is, zoals te zien is in figuur 1A. Het is belangrijk om embryo’s voldoende lang in elke antilichaamoplossing uit te broeden om volledige penetratie door het monster te garanderen, evenals, het grondig wassen van embryo’s na de incubatie. In figuur …

Discussion

De mogelijkheid om het endotheel in muisembryo’s in 3D te visualiseren heeft nieuwe inzichten opgeleverd in hun ontwikkeling3. Hier presenteren we een protocol dat het mogelijk maakt voor hoge resolutie 3D-beeldvorming van embryo’s, visualisatie van vasculaire connectiviteit, en kwantitatieve analyses van PAA-vorming. Dit protocol kan worden gebruikt om te zien hoe genetische veranderingen of milieubeledigingen van invloed paa ontwikkeling. De hier gerapporteerde procedure maakt gebruik van antili…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Wij danken Brianna Alexander, Caolan O’Donnell en Michael Warkala voor het zorgvuldig lezen en bewerken van dit manuscript. Dit werk werd ondersteund door de financiering van het National Heart, Lung and Blood Institute van het NIH R01 HL103920, R01 HL134935, R21 OD025323-01 aan SA; AJR wordt ondersteund door NHLBI HL103920-08S1 en het National Institute of Artritis en Spier- en Huidziekten Training subsidie T32052283-11.

Materials

10x PBS MP Biomedicals PBS10X02
20x water immersion objective Nikon MRD77200
Agarose Bio-Rad Laboratories 1613101
Alexa Fluor 488 anti-goat Invitrogen A-11055
Alexa Fluor 555 anti-mouse Invitrogen A-31570
Analysis Software Imaris 9.2.0
Benzyl Alcohol Sigma-Aldrich 305197
Benzyl Benzoate Sigma-Aldrich 8.18701.0100
Cover Slips VWR 16004-312
DAPI (5 mg/mL stock) Fisher Scientific D3571
Eppendorf Tubes (2.0 mL) Fisher Scientific 05-408-138
Ethanol VWR 89370-084
Falcon tubes (50 mL) Corning 352098
Fast wells Grace Bio Labs 664113
Forceps Roboz RS-5015
Goat anti-VEGFR2 R&D Systems, Inc. AF644
Methanol VWR BDH1135-4LP
Microscope Nikon A1HD25
Mouse anti-ERG Abcam ab214341
Normal Donkey Serum Sigma-Aldrich D9663
Paraformaldehyde Electron Microscopy Sciences 15710
Pasteur pipets Fisher Scientific 13-678-20D
Petri dishes (35 mm) Genesee Scientific 32-103
Petri dishes (60 mm) Genesee Scientific 32-105
Plastic Molds VWR 18000-128
Scapels Exelint International Co. 29552
Triton-X-100 Fisher Scientific BP 151-500

References

  1. Hiruma, T., Nakajima, Y., Nakamura, H. Development of pharyngeal arch arteries in early mouse embryo. Journal of Anatomy. 201 (1), 15-29 (2002).
  2. Hutson, M. R., Kirby, M. L. Model systems for the study of heart development and disease Cardiac neural crest and conotruncal malformations. Seminars in Cell & Developmental Biology. 18 (1), 101-110 (2007).
  3. Wang, X., et al. Endothelium in the pharyngeal arches 3, 4 and 6 is derived from the second heart field. Developmental Biology. 421 (2), 108-117 (2017).
  4. Jerome, L. A., Papaioannou, V. E. DiGeorge syndrome phenotype in mice mutant for the T-box gene, Tbx1. Nature Genetics. 27 (3), 286-291 (2001).
  5. Lindsay, E. A., et al. Tbx1 haploinsufficieny in the DiGeorge syndrome region causes aortic arch defects in mice. Nature. 410 (6824), 97-101 (2001).
  6. Weninger, W., et al. Visualising the Cardiovascular System of Embryos of Biomedical Model Organisms with High Resolution Episcopic Microscopy (HREM). Journal of Cardiovascular Development and Disease. 5 (4), 58 (2018).
  7. Phillips, H. M., et al. Pax9 is required for cardiovascular development and interacts with Tbx1 in the pharyngeal endoderm to control 4th pharyngeal arch artery morphogenesis. Development. 146 (18), (2019).
  8. Vlaeminck-Guillem, V., et al. The Ets family member Erg gene is expressed in mesodermal tissues and neural crests at fundamental steps during mouse embryogenesis. Mechanisms of Development. 91 (1-2), 331-335 (2000).
  9. Ertürk, A., et al. Three-dimensional imaging of the unsectioned adult spinal cord to assess axon regeneration and glial responses after injury. Nature Medicine. 18 (1), 166-217 (2012).
  10. Azaripour, A., et al. A survey of clearing techniques for 3D imaging of tissues with special reference to connective tissue. Progress in Histochemistry and Cytochemistry. 51 (2), 9-23 (2016).
  11. Richardson, D. S., Lichtman, J. W. Clarifying Tissue Clearing. Cell. 162 (2), 246-257 (2015).
  12. Becker, K., Jährling, N., Saghafi, S., Weiler, R., Dodt, H. U. Chemical Clearing and Dehydration of GFP Expressing Mouse Brains. PLoS One. 7 (3), e33916 (2012).
  13. Ertürk, A., et al. Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO. Nature Protocols. 7 (11), 1983-1995 (2012).
  14. Kuwajima, T., et al. ClearT: a detergent- and solvent-free clearing method for neuronal and non-neuronal tissue. Development. 140 (6), 1364-1368 (2013).

Play Video

Cite This Article
Ramirez, A., Astrof, S. Visualization and Analysis of Pharyngeal Arch Arteries using Whole-mount Immunohistochemistry and 3D Reconstruction. J. Vis. Exp. (157), e60797, doi:10.3791/60797 (2020).

View Video