Summary

使用全载免疫作用化学和三维重建对咽弓动脉的可视化与分析

Published: March 31, 2020
doi:

Summary

在这里,我们描述了一种协议,使用全孔免疫荧光、组织清除、共聚焦显微镜和3D重建来可视化和分析小鼠胚胎的咽弓动脉3、4和6。

Abstract

咽弓动脉(PAA)3、4和6的不当形成或重塑导致一些最严重的先天性心脏病。为了研究PAA的形成,我们开发了一种方案,使用全支式免疫荧光结合苯基醇/苯甲酸苯甲酸酯(BABB)组织清除和共聚焦显微镜。这允许以精细的细胞分辨率可视化咽喉拱内体,以及血管的 3D 连接。使用软件,我们建立了一个协议,以量化PAA中的内皮细胞 (EC) 数量,以及咽喉拱门 3、4 和 6 内围绕 PAA 的血管丛中的 E 数。该方法应用于整个胚胎时,对胚胎血管进行综合的可视化和定量分析。

Introduction

在小鼠胚胎形成期间,咽喉弓动脉(PAAs)出现为对称的两侧动脉对,将心脏与背动脉1连接起来。随着胚胎的发展,第一和第二对PAA回归,而3、4和6PAA经历一系列不对称的重塑事件,形成主动脉2。

PAAs 3、4 和 6 通过血管生成而发展,这是血管的脱层3。这些弓动脉形成或改造的缺陷导致各种先天性心脏缺陷,如在DiGeorge综合征44,55患者看到。因此,理解调节PAA发展的机制可以导致对先天性心脏病(CHD)病因的更好理解。

目前用于可视化和分析PAA发展的方法包括组织部分的免疫荧光、血管铸件、印度墨水注射、高分辨率的异见显微镜和/或全卡免疫组织化学11、4、5、6、7。4,5,6,7在这里,我们描述了一种结合全载式免疫荧光、共聚焦显微镜和3D图像渲染的协议,以便收集、分析和量化体积数据、血管连接性和细胞识别。此外,我们详细介绍了一种将每个咽喉拱中的ECs数量分割和量化的方法,作为研究咽喉弓血管丛的形成及其重新改造到PAA的方法。虽然该协议是专为分析PAA发展而设计的,但它可用于分析其他正在发育的血管网络。

Protocol

罗格斯大学机构动物护理和使用委员会批准了动物使用和程序。 1. 准备解决方案 用 0.1% Triton-X-100 (PBST) 制备 1 L 的磷酸盐缓冲盐水,并消毒过滤器。此解决方案可在室温 (RT) 下存储至少一年。 准备600μL的阻塞缓冲液,由PBST中正常驴血清的10%组成。每次使此解决方案新鲜。 在流量罩中制备以下 50 mL 甲醇 (MeOH) 稀释剂:在去离子水中 (dH2…

Representative Results

此处介绍的全载免疫荧光协议产生清晰、干净的结果,允许对咽喉拱内皮进行3D重建,如图1A所示。在每个抗体溶液中孵育胚胎足够长的时间以确保通过样品完全渗透,以及彻底清洗胚胎后抗体孵育,这一点非常重要。在图 1B中,大而明亮的点是抗体或阻塞缓冲液溶液中微粒的结果。我们发现,每次抗?…

Discussion

在3D小鼠胚胎中可视化内皮的能力为小鼠胚胎的发展提供了新的见解。在这里,我们提出了一个协议,允许对胚胎进行高分辨率的3D成像,血管连接的可视化,以及PAA形成的定量分析。该协议可用于查看基因改变或环境侮辱如何影响 PAA 发展。此处报告的程序使用针对VEGFR2和ERG的抗体来可视化PAA形成和量化EC编号;然而,额外的抗体可用于可视化和分析弓动脉发展的其他方面,如神?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

我们感谢布赖恩娜·亚历山大、曹兰·奥唐纳和迈克尔·沃卡拉仔细阅读和编辑这份手稿。这项工作得到了NIH R01 HL103920、R01 HL134935、R21 OD025323-01至SA国家心脏、肺血研究所的资助;AJR得到NHLBI HL103920-08S1和国家关节炎和肌肉骨骼和皮肤病训练补助金T32052283-11的支持。

Materials

10x PBS MP Biomedicals PBS10X02
20x water immersion objective Nikon MRD77200
Agarose Bio-Rad Laboratories 1613101
Alexa Fluor 488 anti-goat Invitrogen A-11055
Alexa Fluor 555 anti-mouse Invitrogen A-31570
Analysis Software Imaris 9.2.0
Benzyl Alcohol Sigma-Aldrich 305197
Benzyl Benzoate Sigma-Aldrich 8.18701.0100
Cover Slips VWR 16004-312
DAPI (5 mg/mL stock) Fisher Scientific D3571
Eppendorf Tubes (2.0 mL) Fisher Scientific 05-408-138
Ethanol VWR 89370-084
Falcon tubes (50 mL) Corning 352098
Fast wells Grace Bio Labs 664113
Forceps Roboz RS-5015
Goat anti-VEGFR2 R&D Systems, Inc. AF644
Methanol VWR BDH1135-4LP
Microscope Nikon A1HD25
Mouse anti-ERG Abcam ab214341
Normal Donkey Serum Sigma-Aldrich D9663
Paraformaldehyde Electron Microscopy Sciences 15710
Pasteur pipets Fisher Scientific 13-678-20D
Petri dishes (35 mm) Genesee Scientific 32-103
Petri dishes (60 mm) Genesee Scientific 32-105
Plastic Molds VWR 18000-128
Scapels Exelint International Co. 29552
Triton-X-100 Fisher Scientific BP 151-500

References

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Cite This Article
Ramirez, A., Astrof, S. Visualization and Analysis of Pharyngeal Arch Arteries using Whole-mount Immunohistochemistry and 3D Reconstruction. J. Vis. Exp. (157), e60797, doi:10.3791/60797 (2020).

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