Summary

Visualisierung und Analyse von Pharyngeal Arch Arterien mittels ganzer Immunhistochemie und 3D-Rekonstruktion

Published: March 31, 2020
doi:

Summary

Hier beschreiben wir ein Protokoll zur Visualisierung und Analyse der Rachenbogenarterien 3, 4 und 6 von Mausembryonen mit ganzer Immunfluoreszenz, Gewebeklärung, konfokaler Mikroskopie und 3D-Rekonstruktion.

Abstract

Unsachgemäße Bildung oder Umgestaltung der Pharyngealbogenarterien (PAAs) 3, 4 und 6 tragen zu einigen der schwersten Formen der angeborenen Herzkrankheit bei. Um die Bildung von PAAs zu untersuchen, entwickelten wir ein Protokoll mit ganzer Immunfluoreszenz in Verbindung mit Benzylalkohol/Benzylbenzoat (BABB) Gewebeclearing und konfokaler Mikroskopie. Dies ermöglicht die Visualisierung des Pharyngealbogenendothel summieren bei feiner Zellauflösung sowie die 3D-Konnektivität der Vaskulatur. Mithilfe von Software haben wir ein Protokoll zur Quantifizierung der Anzahl der Endothelzellen (ECs) in PAAs sowie der Anzahl der ECs innerhalb des Gefäßplexus, der die PAAs in den Pharyngealbögen 3, 4 und 6 umgibt, erstellt. Wenn sie auf den gesamten Embryo angewendet wird, bietet diese Methode eine umfassende Visualisierung und quantitative Analyse der embryonalen Vaskulatur.

Introduction

Während der Mausembryogenese entstehen Pharyngealbogenarterien (PAAs) als symmetrische, bilaterale Arterienpaare, die das Herz mit der dorsalen Aortae1verbinden. Während sich der Embryo entwickelt, gehen das erste und zweite PAAs-Paar zurück, während die3.,4.und6. PAAs eine Reihe asymmetrischer Umbauereignisse durchlaufen, um die Aortenbogenarterien zu bilden2.

Die PAAs 3, 4 und 6 entwickeln sich über Vaskulogenese, die die de novo Bildung von Blutgefäßen3ist. Defekte bei der Bildung oder Umgestaltung dieser Bogenarterien führen zu verschiedenen angeborenen Herzfehlern, wie sie bei Patienten mit DiGeorge-Syndrom4,5beobachtet werden. Daher kann das Verständnis von Mechanismen, die die Entwicklung von PAAs regulieren, zu einem besseren Verständnis der angeborenen Herzkrankheit (CHD) Ätiologie führen.

Aktuelle Ansätze zur Visualisierung und Analyse der PAA-Entwicklung umfassen die Immunfluoreszenz von Gewebeabschnitten, Gefäßabgüsse, Indien-Tinteninjektion, hochauflösende episkopische Mikroskopie und/oder Ganzleitimmunhistochemie1,4,5,6,7. Hierin beschreiben wir ein Protokoll, das Immunfluoreszenz, konfokale Mikroskopie und 3D-Bildwiedergabe kombiniert, um volumetrische Daten, vaskuläre Konnektivität und Zellidentität zu sammeln, zu analysieren und zu quantifizieren. Darüber hinaus beschreiben wir eine Methode zur Abschottung und Quantifizierung der Anzahl der ECs in jedem Rachenbogen als Mittel zur Untersuchung der Bildung des Pharyngealbogen-Gefäßplexus und dessen Umgestaltung in die PAAs. Während dieses Protokoll für die Analyse der PAA-Entwicklung entwickelt wurde, kann es verwendet werden, um andere sich entwickelnde Gefäßnetzwerke zu analysieren.

Protocol

Die Verwendung und die Verfahren für Tiere wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee der Rutgers University genehmigt. 1. Vorbereitung von Lösungen 1 L Phosphat gepufferte Salin mit 0,1% Triton-X-100 (PBST) und Filtersterilisieren vorbereiten. Diese Lösung kann mindestens ein Jahr lang bei Raumtemperatur (RT) gelagert werden. Bereiten Sie 600 l Blockierpuffer vor, der aus 10 % des normalen Eselsserums in PBST besteht. Machen Sie diese Lösung jedes Mal frisc…

Representative Results

Das hier vorgestellte Immunfluoreszenzprotokoll mit ganzer Montaterzeugtkeit liefert klare und saubere Ergebnisse, die eine 3D-Rekonstruktion des Pharyngealbogenendothel ermöglichen, wie in Abbildung 1Adargestellt. Es ist wichtig, Embryonen für eine ausreichende Zeit in jeder Antikörperlösung zu inkubieren, um eine vollständige Penetration durch die Probe zu gewährleisten, sowie, gründlich waschen Embryonen nach Derinkubation. In <stro…

Discussion

Die Möglichkeit, das Endothel in Mausembryonen in 3D zu visualisieren, hat neue Einblicke in ihre Entwicklung 3gegeben. Hier stellen wir ein Protokoll vor, das eine hochauflösende 3D-Bildgebung von Embryonen, die Visualisierung der vaskulären Konnektivität und quantitative Analysen der PAA-Bildung ermöglicht. Dieses Protokoll kann verwendet werden, um zu sehen, wie genetische Veränderungen oder Umweltbeleidigungen die ENTWICKLUNG der PAA beeinflussen. Das hier beschriebene Verfahren verwende…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Wir danken Brianna Alexander, Caolan O’Donnell und Michael Warkala für die sorgfältige Lektüre und Bearbeitung dieses Manuskripts. Diese Arbeit wurde durch die Finanzierung durch das National Heart, Lung and Blood Institute des NIH R01 HL103920, R01 HL134935, R21 OD025323-01 bis SA unterstützt; AJR wird unterstützt von NHLBI HL103920-08S1 und dem National Institute of Arthritis and Musculoskeletal and Skin Diseases Training Grant T32052283-11.

Materials

10x PBS MP Biomedicals PBS10X02
20x water immersion objective Nikon MRD77200
Agarose Bio-Rad Laboratories 1613101
Alexa Fluor 488 anti-goat Invitrogen A-11055
Alexa Fluor 555 anti-mouse Invitrogen A-31570
Analysis Software Imaris 9.2.0
Benzyl Alcohol Sigma-Aldrich 305197
Benzyl Benzoate Sigma-Aldrich 8.18701.0100
Cover Slips VWR 16004-312
DAPI (5 mg/mL stock) Fisher Scientific D3571
Eppendorf Tubes (2.0 mL) Fisher Scientific 05-408-138
Ethanol VWR 89370-084
Falcon tubes (50 mL) Corning 352098
Fast wells Grace Bio Labs 664113
Forceps Roboz RS-5015
Goat anti-VEGFR2 R&D Systems, Inc. AF644
Methanol VWR BDH1135-4LP
Microscope Nikon A1HD25
Mouse anti-ERG Abcam ab214341
Normal Donkey Serum Sigma-Aldrich D9663
Paraformaldehyde Electron Microscopy Sciences 15710
Pasteur pipets Fisher Scientific 13-678-20D
Petri dishes (35 mm) Genesee Scientific 32-103
Petri dishes (60 mm) Genesee Scientific 32-105
Plastic Molds VWR 18000-128
Scapels Exelint International Co. 29552
Triton-X-100 Fisher Scientific BP 151-500

References

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Cite This Article
Ramirez, A., Astrof, S. Visualization and Analysis of Pharyngeal Arch Arteries using Whole-mount Immunohistochemistry and 3D Reconstruction. J. Vis. Exp. (157), e60797, doi:10.3791/60797 (2020).

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