Visualisering og analyse af Pharyngeal Arch Arterier ved hjælp af fuld-mount Immunohistochemistry og 3D Rekonstruktion
Summary
Her beskriver vi en protokol til at visualisere og analysere svælg bue arterierne 3, 4 og 6 af mus embryoner ved hjælp af hele mount immunfluorescens, væv clearing, konfokal mikroskopi, og 3D rekonstruktion.
Abstract
Forkert dannelse eller remodeling af svælg bue arterier (PAAs) 3, 4 og 6 bidrage til nogle af de mest alvorlige former for medfødt hjertesygdom. For at studere dannelsen af PAA’er udviklede vi en protokol ved hjælp af fuldmonteret immunfluorescens kombineret med benzylalkohol/benzylbenzoat (BABB) vævsclearing og konfokal mikroskopi. Dette giver mulighed for visualisering af svælg bue endotel på en fin cellulær opløsning samt 3D-forbindelse af vaskulaturen. Ved hjælp af software har vi etableret en protokol til kvantificering af antallet af endotelceller (ECs) i PAA’er samt antallet af eCs inden for den vaskulære plexus omkring PAA’erne inden for svælgbuer 3, 4 og 6. Når denne metode anvendes på hele embryonet, giver den en omfattende visualisering og kvantitativ analyse af embryonal vaskulatur.
Introduction
Under mus embryogenese, svælg bue arterier (PAAs) opstår som symmetriske, bi-laterale par arterier, der forbinder hjertet med dorsale aortae1. Som embryoet udvikler sig, den første og andet par PAAs regress, mens 3rd, 4th, og 6th PAAs gennemgå en række asymmetriske remodeling begivenheder til at danne aorta bue arterier2.
PaA’erne 3, 4 og 6 udvikler sig via vaskulogenese, som er de novo-dannelsen af blodkar3. Defekter i dannelsen eller ombygning af disse bue arterier giver anledning til forskellige medfødte hjertefejl, såsom dem, der ses hos patienter med DiGeorge syndrom4,5. Derfor kan forståelse af mekanismer, der regulerer udviklingen af PAA’er, føre til en bedre forståelse af medfødt hjertesygdom (CHD) ætiologi.
Nuværende tilgange til visualisering og analyse paa udvikling omfatter immunfluorescens af væv sektioner, vaskulære kaster, Indien blæk injektion, høj opløsning episkopi, og / eller hele mount immunhistokemi1,4,,5,,6,7. Heri beskriver vi en protokol, der kombinerer helmonteret immunfluorescens, konfokal mikroskopi og 3D-billedgengivelse for at indsamle, analysere og kvantificere volumetriske data, vaskulære konnektivitet og celleidentitet. Yderligere, vi detaljer en metode til at opdele og kvantificere antallet af ECs i hver svælg bue som et middel til at studere dannelsen af svælg arch vaskulære plexus og dens remodeling i PAAs. Mens denne protokol er designet til at analysere PAA udvikling, kan det bruges til at analysere andre udvikle vaskulære netværk.
Protocol
Representative Results
Discussion
Evnen til at visualisere endotel i museembryoner i 3D har givet ny indsigt i deres udvikling3. Her præsenterer vi en protokol, der giver mulighed for høj opløsning 3D-billeddannelse af embryoner, visualisering af vaskulære tilslutningsmuligheder, og kvantitative analyser af PAA dannelse. Denne protokol kan anvendes til at se, hvordan genetiske ændringer eller miljømæssige fornærmelser indvirkning PAA udvikling. Den procedure, der rapporteres her, anvender antistoffer mod VEGFR2 og ERG til …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker Brianna Alexander, Caolan O’Donnell og Michael Warkala for omhyggelig læsning og redigering af dette manuskript. Dette arbejde blev støttet af midler fra National Heart, Lung and Blood Institute af NIH R01 HL103920, R01 HL134935, R21 OD025323-01 til SA; AJR er støttet af NHLBI HL103920-08S1 og National Institute of Arthritis og muskel- og skelet-og hudsygdomme Uddannelse tilskud T32052283-11.
Materials
| 10x PBS | MP Biomedicals | PBS10X02 | |
| 20x water immersion objective | Nikon | MRD77200 | |
| Agarose | Bio-Rad Laboratories | 1613101 | |
| Alexa Fluor 488 anti-goat | Invitrogen | A-11055 | |
| Alexa Fluor 555 anti-mouse | Invitrogen | A-31570 | |
| Analysis Software | Imaris 9.2.0 | ||
| Benzyl Alcohol | Sigma-Aldrich | 305197 | |
| Benzyl Benzoate | Sigma-Aldrich | 8.18701.0100 | |
| Cover Slips | VWR | 16004-312 | |
| DAPI (5 mg/mL stock) | Fisher Scientific | D3571 | |
| Eppendorf Tubes (2.0 mL) | Fisher Scientific | 05-408-138 | |
| Ethanol | VWR | 89370-084 | |
| Falcon tubes (50 mL) | Corning | 352098 | |
| Fast wells | Grace Bio Labs | 664113 | |
| Forceps | Roboz | RS-5015 | |
| Goat anti-VEGFR2 | R&D Systems, Inc. | AF644 | |
| Methanol | VWR | BDH1135-4LP | |
| Microscope | Nikon | A1HD25 | |
| Mouse anti-ERG | Abcam | ab214341 | |
| Normal Donkey Serum | Sigma-Aldrich | D9663 | |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| Pasteur pipets | Fisher Scientific | 13-678-20D | |
| Petri dishes (35 mm) | Genesee Scientific | 32-103 | |
| Petri dishes (60 mm) | Genesee Scientific | 32-105 | |
| Plastic Molds | VWR | 18000-128 | |
| Scapels | Exelint International Co. | 29552 | |
| Triton-X-100 | Fisher Scientific | BP 151-500 |
References
- Hiruma, T., Nakajima, Y., Nakamura, H. Development of pharyngeal arch arteries in early mouse embryo. Journal of Anatomy. 201 (1), 15-29 (2002).
- Hutson, M. R., Kirby, M. L. Model systems for the study of heart development and disease Cardiac neural crest and conotruncal malformations. Seminars in Cell & Developmental Biology. 18 (1), 101-110 (2007).
- Wang, X., et al. Endothelium in the pharyngeal arches 3, 4 and 6 is derived from the second heart field. Developmental Biology. 421 (2), 108-117 (2017).
- Jerome, L. A., Papaioannou, V. E. DiGeorge syndrome phenotype in mice mutant for the T-box gene, Tbx1. Nature Genetics. 27 (3), 286-291 (2001).
- Lindsay, E. A., et al. Tbx1 haploinsufficieny in the DiGeorge syndrome region causes aortic arch defects in mice. Nature. 410 (6824), 97-101 (2001).
- Weninger, W., et al. Visualising the Cardiovascular System of Embryos of Biomedical Model Organisms with High Resolution Episcopic Microscopy (HREM). Journal of Cardiovascular Development and Disease. 5 (4), 58 (2018).
- Phillips, H. M., et al. Pax9 is required for cardiovascular development and interacts with Tbx1 in the pharyngeal endoderm to control 4th pharyngeal arch artery morphogenesis. Development. 146 (18), (2019).
- Vlaeminck-Guillem, V., et al. The Ets family member Erg gene is expressed in mesodermal tissues and neural crests at fundamental steps during mouse embryogenesis. Mechanisms of Development. 91 (1-2), 331-335 (2000).
- Ertürk, A., et al. Three-dimensional imaging of the unsectioned adult spinal cord to assess axon regeneration and glial responses after injury. Nature Medicine. 18 (1), 166-217 (2012).
- Azaripour, A., et al. A survey of clearing techniques for 3D imaging of tissues with special reference to connective tissue. Progress in Histochemistry and Cytochemistry. 51 (2), 9-23 (2016).
- Richardson, D. S., Lichtman, J. W. Clarifying Tissue Clearing. Cell. 162 (2), 246-257 (2015).
- Becker, K., Jährling, N., Saghafi, S., Weiler, R., Dodt, H. U. Chemical Clearing and Dehydration of GFP Expressing Mouse Brains. PLoS One. 7 (3), e33916 (2012).
- Ertürk, A., et al. Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO. Nature Protocols. 7 (11), 1983-1995 (2012).
- Kuwajima, T., et al. ClearT: a detergent- and solvent-free clearing method for neuronal and non-neuronal tissue. Development. 140 (6), 1364-1368 (2013).
