Summary

Visualización y análisis de arterias de arco faríngeo utilizando inmunohistoquímica de montaje completo y reconstrucción 3D

Published: March 31, 2020
doi:

Summary

Aquí, describimos un protocolo para visualizar y analizar las arterias del arco faríngeo 3, 4 y 6 de embriones de ratón utilizando inmunofluorescencia de montaje completo, limpieza de tejidos, microscopía confocal y reconstrucción 3D.

Abstract

La formación o remodelación inadecuadas de las arterias del arco faríngeo (PAA) 3, 4 y 6 contribuyen a algunas de las formas más graves de cardiopatía congénita. Para estudiar la formación de PAA, desarrollamos un protocolo utilizando inmunofluorescencia integral junto con la limpieza de tejido de alcohol bencílico/benzilo bencílico (BABB), y microscopía confocal. Esto permite la visualización del endotelio del arco faríngeo a una resolución celular fina, así como la conectividad 3D de la vasculatura. Utilizando software, hemos establecido un protocolo para cuantificar el número de células endoteliales (ECs) en PAA, así como el número de ECs dentro del plexo vascular que rodea a los PAA dentro de los arcos faríngeos 3, 4 y 6. Cuando se aplica a todo el embrión, esta metodología proporciona una visualización integral y un análisis cuantitativo de la vasculatura embrionaria.

Introduction

Durante la embriogénesis del ratón, las arterias del arco faríngeo (PAA) surgen como pares simétricos, bilaterales de arterias que conectan el corazón con las aortas dorsales1. A medida que el embrión se desarrolla, el primer y segundo par de PAA retroceden, mientras que losPAA 3,4y 6 se someten a una serie de eventos de remodelación asimétrica para formar las arterias del arco aórtico2.

Los PAA 3, 4 y 6 se desarrollan a través de vasculogénesis, que es la formación de novo de los vasos sanguíneos3. Los defectos en la formación o remodelación de estas arterias del arco dan lugar a diversos defectos cardíacos congénitos, como los observados en pacientes con Síndrome de DiGeorge4,5. Por lo tanto, comprender los mecanismos que regulan el desarrollo de los PAA puede conducir a una mejor comprensión de la etiología de las enfermedades cardíacas congénitas ( CHD).

Los enfoques actuales para visualizar y analizar el desarrollo de PAA incluyen inmunofluorescencia de secciones tisulares, moldes vasculares, inyección de tinta de la India, microscopía episcópica de alta resolución y/o inmunohistoquímica de montaje completo1,4,5,6,7. Aquí, describimos un protocolo que combina inmunofluorescencia de montaje completo, microscopía confocal y renderizado de imágenes 3D con el fin de recopilar, analizar y cuantificar datos volumétricos, conectividad vascular e identidad celular. Además, detallamos un método para compartimentar y cuantificar el número de CE en cada arco faríngeo como un medio para estudiar la formación del arco faríngeo plexo vascular y su remodelación en los PAA. Si bien este protocolo está diseñado para analizar el desarrollo de PAA, se puede utilizar para analizar otras redes vasculares en desarrollo.

Protocol

El uso y los procedimientos de los animales fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad Rutgers. 1. Preparación de soluciones Preparar 1 L de solución salina tamponada de fosfato con 0.1% Triton-X-100 (PBST) y filtrar esterilizar. Esta solución se puede almacenar a temperatura ambiente (RT) durante al menos un año. Preparar 600 l de tampón de bloqueo que consiste en 10% del suero de burro normal en PBST. Haga que esta so…

Representative Results

El protocolo de inmunofluorescencia de montaje completo presentado aquí produce resultados claros y limpios, permitiendo la reconstrucción 3D del endotelio del arco faríngeo, como se ve en la Figura 1A. Es importante incubar embriones durante una cantidad suficiente de tiempo en cada solución de anticuerpos para asegurar una penetración completa a través de la muestra, así como lavar a fondo los embriones después de la incubación de …

Discussion

La capacidad de visualizar el endotelio en embriones de ratón en 3D ha proporcionado nuevas perspectivas sobre su desarrollo3. Aquí presentamos un protocolo que permite la toma de imágenes 3D de alta resolución de embriones, la visualización de la conectividad vascular y los análisis cuantitativos de la formación de PAA. Este protocolo se puede emplear para ver cómo las alteraciones genéticas o los insultos ambientales afectan el desarrollo de la PAA. El procedimiento descrito aquí utili…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Agradecemos a Brianna Alexander, Caolan O’Donnell y Michael Warkala por la lectura y edición cuidadosa de este manuscrito. Este trabajo fue apoyado por la financiación del Instituto Nacional del Corazón, Pulmón y Sangre del NIH R01 HL103920, R01 HL134935, R21 OD025323-01 a SA; AJR cuenta con el apoyo de NHLBI HL103920-08S1 y la beca T32052283-11 del Instituto Nacional de Artritis y Enfermedades Musculoesqueléticas y de La Piel.

Materials

10x PBS MP Biomedicals PBS10X02
20x water immersion objective Nikon MRD77200
Agarose Bio-Rad Laboratories 1613101
Alexa Fluor 488 anti-goat Invitrogen A-11055
Alexa Fluor 555 anti-mouse Invitrogen A-31570
Analysis Software Imaris 9.2.0
Benzyl Alcohol Sigma-Aldrich 305197
Benzyl Benzoate Sigma-Aldrich 8.18701.0100
Cover Slips VWR 16004-312
DAPI (5 mg/mL stock) Fisher Scientific D3571
Eppendorf Tubes (2.0 mL) Fisher Scientific 05-408-138
Ethanol VWR 89370-084
Falcon tubes (50 mL) Corning 352098
Fast wells Grace Bio Labs 664113
Forceps Roboz RS-5015
Goat anti-VEGFR2 R&D Systems, Inc. AF644
Methanol VWR BDH1135-4LP
Microscope Nikon A1HD25
Mouse anti-ERG Abcam ab214341
Normal Donkey Serum Sigma-Aldrich D9663
Paraformaldehyde Electron Microscopy Sciences 15710
Pasteur pipets Fisher Scientific 13-678-20D
Petri dishes (35 mm) Genesee Scientific 32-103
Petri dishes (60 mm) Genesee Scientific 32-105
Plastic Molds VWR 18000-128
Scapels Exelint International Co. 29552
Triton-X-100 Fisher Scientific BP 151-500

References

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Cite This Article
Ramirez, A., Astrof, S. Visualization and Analysis of Pharyngeal Arch Arteries using Whole-mount Immunohistochemistry and 3D Reconstruction. J. Vis. Exp. (157), e60797, doi:10.3791/60797 (2020).

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