Summary
Her beskriver vi en protokol til at visualisere og analysere svælg bue arterierne 3, 4 og 6 af mus embryoner ved hjælp af hele mount immunfluorescens, væv clearing, konfokal mikroskopi, og 3D rekonstruktion.
Abstract
Forkert dannelse eller remodeling af svælg bue arterier (PAAs) 3, 4 og 6 bidrage til nogle af de mest alvorlige former for medfødt hjertesygdom. For at studere dannelsen af PAA'er udviklede vi en protokol ved hjælp af fuldmonteret immunfluorescens kombineret med benzylalkohol/benzylbenzoat (BABB) vævsclearing og konfokal mikroskopi. Dette giver mulighed for visualisering af svælg bue endotel på en fin cellulær opløsning samt 3D-forbindelse af vaskulaturen. Ved hjælp af software har vi etableret en protokol til kvantificering af antallet af endotelceller (ECs) i PAA'er samt antallet af eCs inden for den vaskulære plexus omkring PAA'erne inden for svælgbuer 3, 4 og 6. Når denne metode anvendes på hele embryonet, giver den en omfattende visualisering og kvantitativ analyse af embryonal vaskulatur.
Introduction
Under mus embryogenese, svælg bue arterier (PAAs) opstår som symmetriske, bi-laterale par arterier, der forbinder hjertet med dorsale aortae1. Som embryoet udvikler sig, den første og andet par PAAs regress, mens 3rd, 4th, og 6th PAAs gennemgå en række asymmetriske remodeling begivenheder til at danne aorta bue arterier2.
PaA'erne 3, 4 og 6 udvikler sig via vaskulogenese, som er de novo-dannelsen af blodkar3. Defekter i dannelsen eller ombygning af disse bue arterier giver anledning til forskellige medfødte hjertefejl, såsom dem, der ses hos patienter med DiGeorge syndrom4,5. Derfor kan forståelse af mekanismer, der regulerer udviklingen af PAA'er, føre til en bedre forståelse af medfødt hjertesygdom (CHD) ætiologi.
Nuværende tilgange til visualisering og analyse paa udvikling omfatter immunfluorescens af væv sektioner, vaskulære kaster, Indien blæk injektion, høj opløsning episkopi, og / eller hele mount immunhistokemi1,4,,5,,6,7. Heri beskriver vi en protokol, der kombinerer helmonteret immunfluorescens, konfokal mikroskopi og 3D-billedgengivelse for at indsamle, analysere og kvantificere volumetriske data, vaskulære konnektivitet og celleidentitet. Yderligere, vi detaljer en metode til at opdele og kvantificere antallet af ECs i hver svælg bue som et middel til at studere dannelsen af svælg arch vaskulære plexus og dens remodeling i PAAs. Mens denne protokol er designet til at analysere PAA udvikling, kan det bruges til at analysere andre udvikle vaskulære netværk.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Anvendelse og anvendelse af dyr blev godkendt af Udvalget for Dyrepleje og Brug af Dyr på Rutgers University.
1. Udarbejdelse af løsninger
- 1 L fosfatbufferet saltvand med 0,1% Triton-X-100 (PBST) fremstilles, og filtersteriliseres. Denne opløsning kan opbevares ved stuetemperatur (RT) i mindst et år.
- 600 μL blokeringsbuffer bestående af 10 % af det normale æselserum i PBST. Gør denne løsning frisk hver gang.
- Der fremstilles 50 ml af følgende methanol (MeOH) fortyndinger i en strømhætte: 25% MeOH i deioniseret vand (dH2O), 50% MeOH i dH2O og 75% MeOH i dH2O. Vortex at blande. Opbevares på RT.
- 50 ml af følgende benzylalkoholbenzosylbenzoatopløsninger (BABB) fremstilles i koniske 50 ml.dk.
- For 100% BABB tilsættes 32 ml benzylbenzoat til 16 ml benzylalkohol (2:1 volumenprocent).
- For 50% BABB tilsættes 16 ml benzylbenzoat og 8 ml benzylalkohol til 24 ml MeOH.
- Dæk koniske rør i aluminiumsfolie for at beskytte mod lys. Disse løsninger kan opbevares på RT i op til et år.
FORSIGTIG: BABB er giftig tandeog ætsende. Det skal håndteres og bortskaffes i henhold til MSDS.
2. Embryo dissektion og fiksering
BEMÆRK: Denne protokol er velegnet til E9.5- og E10.5-museembryoner (han- eller hundyr), der er isoleret fra enhver musestamme. For yngre og ældre embryoner bør inkubationstiden eksperimentelt bestemmes for at maksimere signal-til støjforholdet mellem fluorescenssignal.
- Fyld en 35 mm og en 60 mm Petri skåle med 1x PBS og sted på is, indtil det er nødvendigt.
- Euthanize en gravid mus via CO2 indånding. Udfør cervikal dislokation som et sekundært mål for aktiv dødshjælp.
- Rengør bugområdet af dæmningen med 70% ethanol. Klem maveområdet ved hjælp af pincet og lav et V-lignende snit ved hjælp af kirurgisk saks startende fra bunden af bugvæggen ved midterlinjen; fortsætte med at åbne brysthulen. Løft mavevævet og flyt tarmene til siden for at eksponere livmoderhornene.
- Lav et snit i bunden af vaginal kanalen, og med pincet, trække livmoderen væk fra dæmningen. Lav et ekstra snit på hver æggestok for at frigøre livmoderen. Livmoderen overføres til en af de 60 mm petriskåle, der indeholder kolde 1x PBS.
- Brug lige saks, skær livmodervæggen mellem hvert implantationssted. Pick up en decidua med et glas pipet og overføre til 35 mm petriskål med 1x PBS. Under en dissektion mikroskop, indsætte lige saks i rummet mellem decidua og livmodervæggen. Skær og fjern livmodervæggen.
- Med fine pincet, fjerne decidua og Reichert's membraner fra fosteret ved omhyggeligt at gøre tværgående snit langs vævet og trække vævet væk fra æggeblomme sækken. Fjern æggeblomme sække og fostervandssækken ved forsigtigt at trække vævet væk fra fosteret og foretage nedskæringer på allantois og navlestreng.
BEMÆRK: Æggeblommesække kan bruges til genotastering embryoner. - Hvert embryon overføres med en glaspipet til individuelle 2 ml rør fyldt med 1 ml 1x PBS. Mærk hvert rør med et entydigt id.
- For at fiksere embryoner skal 1x PBS fjernes forsigtigt og tilsættes 4% paraformaldehydopløsning (PFA) i 1x PBS. Inkuber ved 4 °C med let omrøring natten over.
BEMÆRK: 4% PFA-fiksering er egnet til de antistoffer, der er nævnt i denne protokol. Fikseringsprocedurerne bør dog optimeres for yderligere antistoffer.
3. Embryo farvning
BEMÆRK: I dette afsnit gennemtrænges embryoner og farves med primære og sekundære antistoffer. Da PAA-udviklingen skrider hurtigt frem, vil forskelle i embryonale faser i høj grad påvirke analysen nedstrøms. Embryoner skal derfor aldersmatches ved omhyggeligt at tælle somitter for at matche kontrol- og mutantpar forud for yderligere manipulationer.
- For at vaske embryoner skal du forsigtigt fjerne 4% PFA og tilsættes 1x PBS. Vend forsigtigt røret(erne) om flere gange. Placer røret(-erne) højre side op, og lad embryonet/embryonerne synke. Gentag vask 3 gange. Røret(e) anbringes på is.
BEMÆRK: (Valgfrit stoppested) Efter vasken kan embryoner dehydreres i sorterede serier af MeOH i 30 min. pr. fortynding, som i punkt 1.3, og opbevares ved -20 °C i 100% MeOH til senere brug i op til 6 måneder. - For E10.5-embryoner anvendes en glaspipet til at overføre et embryon til en 35 mm petriskål fyldt med kølet 1x PBS. Klem forsigtigt fosteret lige over bagbenet med fine pincet og lav et tværgående snit for at fjerne den bageste halvdel af fosteret. Dette gør det muligt for embryonet at ligge fladt i en sagittal position for trin 4.2. Bring fosteret tilbage i 2 ml røret med frisk 1x PBS.
BEMÆRK: Et kontrol- og mutantembryokan parres og farves med samme antistofopløsning i ét rør til trin 3.3 til 3.8.- Hvis du skærer to embryoner sammen, skæres hovedet af et foster over den første svælgbue ved at klemme med fine pincet for at lave et tværgående snit. Dette vil adskille embryoner af to forskellige genotyper i hvert rør.
- For at permeabilisere fosteret(e), pipet ud 1x PBS fra røret, være omhyggelig med ikke at røre fosteret (r). Der tilsættes 1 ml PBST. Røret anbringes ved 4 °C med let omrøring natten over.
BEMÆRK: (Valgfrit stoppested) Embryoner kan opbevares i PBST-opløsning ved 4 °C i flere dage. - For at forhindre uspecifik binding af antistoffer skal PBST først fjernes fra røret, idet man skal passe på ikke at røre ved fostrene. Der tilsættes 600 μL blokeringsbufferopløsning til fostrene. Embryoet(e) blokeres ved 4 °C med let omrøring natten over.
BEMÆRK: Blokeringsopløsningskal spundet ved topfart på en benchtopcentrifuge umiddelbart før brug for at fjerne snavs. - Brug antistoffer mod VEGFR2 og ERG for at plette og kvantificere eCs. Antistofopløsninger fremstilles i blokeringsbufferen. Anti-VEGFR2 antistof fortyndes 1:200 og ERG antistof fortyndes 1:1000.
BEMÆRK: Antistofopløsninger skal spundet i topfart på en bænkcentrifuge umiddelbart før brug for at fjerne partikler.- For at inkubere embryoner med primære antistoffer skal du fjerne blokerende bufferopløsning fra røret, idet man skal passe på ikke at røre ved fostrene. Der tilsættes 600 μL primær antistofopløsning til hvert rør. Inkuber embryoner ved 4 °C med let omrøring i 4-5 dage.
- For at vaske fostrene af antistofopløsningen skal den primære antistofopløsning først fjernes fra røret. Fostre vaskes hver time med 1 ml PBST ved stuetemperatur (RT) med let omrøring. Embryo(er) vaskes 4-5 gange i løbet af dagen, og inkuber derefter ved 4 °C med let omrøring natten over. Gentag vasker den følgende dag.
- Lav sekundære antistofopløsninger ved at fortynde antigeden Alexa Fluor 488 og antimuseAlexa Fluor 555 1:300 i blokerende buffer. Fortynd lageret DAPI 1:1000 i blokeringsbuffer.
BEMÆRK: Antistofopløsninger skal snurres ved tophastighed på en bænkcentrifuge umiddelbart før brug for at fjerne partikler. Desuden kan andre Alexa Fluor farvestoffer anvendes i stedet for 488 eller 555.- For at inkubere embryoet/embryonet med sekundære antistoffer fjernes PBST fra røret. Der tilsættes 600 μL sekundær antistofopløsning til hvert rør. Inkuber embryoner ved 4 °C med let omrøring i 4-5 dage.
- For at vaske fostrene af antistofopløsningen skal den sekundære antistofopløsning først fjernes fra røret. Embryoet(e) vaskes hver time med 1 ml PBST ved RT med let omrøring. Embryo(er) vaskes 4-5 gange i løbet af dagen, og inkuber derefter ved 4 °C med let omrøring natten over. Gentag vasker den følgende dag.
4. Indlejring af embryoner i agarose
BEMÆRK: I afsnit 4 vil embryoet/embryo'erne blive indlejret i agarose. Denne indlejringsproces tjener to formål: at orientere embryonet korrekt forud for billeddannelse og at hjælpe med at lokalisere embryonet, efter at det er blevet renset i BABB (trin 5.2.2 - 5.3.2).
- Der tilføres 2 g agaroseopløsning til 200 ml dH2O. Mikrobølgeovnen tilkom, indtil alle agarose er opløst.
BEMÆRK: Resterende agarose kan opbevares ved 4 °C og opvarmes til senere brug. - Ved hjælp af en plastik paraffin skimmel og glas pipet, forsigtigt overføre et foster til formen. Fjern forsigtigt PBST fra embryonet. Fostret anbringes i sagittal. Hurtigt, tilføje omkring 0,5 ml varm agarose til formen - lige nok til at dække fosteret og fylde formen. Sørg for, at der ikke omgiver embryonet.
- Placer formen på is og dække med aluminiumsfolie, indtil agarose er størknet.
BEMÆRK: Lad ikke fosteret tørre efter fjernelse af PBST. Agarose-opløsningen skal være varm nok til at forblive flydende, når den tilsættes til fosteret. Tilføj lige nok agarose til at dække fosteret, men ikke for meget, ellers vil det være vanskeligt at billedet. Billeddybden bestemmes delvist af målets arbejdsafstand.
5. Dehydrering og vævsrydning
BEMÆRK: I dette afsnit dehydreres embryoner ved hjælp af methanolserier, hvorefter de cleares i det organiske opløsningsmiddel BABB og monteres mellem to dækslips adskilt af en gummiafstandsstykker. i denne protokol anvendes der fast well gummiafstandsstykker. Fast Well kofangeren har en dobbeltsidet klæbende overflade. Afstandsstykket er nødvendig for at skabe en brønd, hvor fosteret vil blive placeret og holdt mellem to dækslips.
-
Methanol dehydrering
- Mærk nye 2 ml rør, et pr. embryon. Der tilsættes 1 ml 25% MeOH pr. rør.
- Ved hjælp af en ren skalpel, forsigtigt skære agarose omkring fosteret, forlader nok omkring fosteret, så det kan opfanges af pincet. Brug fine pincet til forsigtigt at få fat i agarose med det indlejrede foster og placere den i det mærkede rør med 25% MeOH. Lad ikke pincetrøre fosteret.
- Inkuber embryo(r) på RT med blid omrøring i 1 time i mørke.
- Fjern 25% MeOH fra røret, være omhyggelig med ikke at røre fosteret. Der tilsættes 1 ml 50% MeOH pr. rør. Inkuber på RT med blid omrøring i 1 time i mørke.
- Fjern 50% MeOH fra røret, være omhyggelig med ikke at røre fosteret. Der tilsættes 1 ml 75% MeOH pr. rør. Inkuber på RT med blid omrøring i 1 time i mørke.
- Fjern 75% MeOH fra røret, og pas på ikke at røre ved embryo(erne). Der tilsættes 1 ml 100% MeOH pr. rør. Inkuber på RT med blid omrøring i 1 time i mørke. Gentag 100% MeOH vask to gange.
-
Clearing med BABB
- Fjern 100% MeOH fra røret, være omhyggelig med ikke at røre fosteret. Der tilsættes 1 ml 50% BABB pr. rør. Inkuber på RT med blid omrøring i 1 time i mørke.
- Fjern 50% BABB fra røret, være omhyggelig med ikke at røre fosteret. Der tilsættes 1 ml 100% BABB pr. rør. Inkuber på RT med blid omrøring i 1 time i mørke. Gentag 100% BABB vask to gange.
BEMÆRK: (Valgfrit stoppested) Embryoner kan forblive i 100% BABB i rør i ca. en uge. Længere opbevaring vil få BABB til at opløse plastirørene.
-
Montering af embryoner til billedbehandling
- Anbring en Hurtig Brøndkofanger på en 24 mm x 60 mm #1,5 glasdækselslip ved at afskalle plastlimen af fra den ene side. Sørg for, at der ikke er luftbobler mellem dæksel og kofanger ved at trykke let på plastklæbemidlet oven på gummikofangeren. Mærk dæksedlen efter embryonnummer, genotype og antistoffer, der anvendes til farvning.
BEMÆRK: Enhver afstandsmåler kan placeres mellem dæksellæberne, så længe det er tykt nok til at forhindre knusning eller squishing et foster. Vi bruger Fast Well afstandsstykker på grund af deres tykkelse og bekvemmelighed, som omfatter klæbende overflader på hver side af afstandsstykket for at sikre det til coverslips. - Forsigtigt pipet ud og kassér 100% BABB fra røret. Efter at have visualiseret agarose-indlejret embryo i røret, skal du bruge fine pincet til at afhente agarose og forsigtigt overføre fosteret på coverslip inde i Fast Well - lad ikke pincet at røre fosteret.
- Fjern det andet plastklæbemiddel fra kofangeren, og placer den anden dæksel på toppen. Fjern luftbobler ved forsigtigt at trykke på dækstrækket. Pas på ikke at smadre glasset.
BEMÆRK: Prøverne kan opbevares fladt i en objektglasholder i mørke ved RT i op til et år, hvis forseglingen er stram.
- Anbring en Hurtig Brøndkofanger på en 24 mm x 60 mm #1,5 glasdækselslip ved at afskalle plastlimen af fra den ene side. Sørg for, at der ikke er luftbobler mellem dæksel og kofanger ved at trykke let på plastklæbemidlet oven på gummikofangeren. Mærk dæksedlen efter embryonnummer, genotype og antistoffer, der anvendes til farvning.
6. Indsamling af data
BEMÆRK: I de følgende trin vil endotel af svælg buer 3, 4 og 6 blive afbildet ved hjælp af konfokal mikroskopi.
-
Placering af dias på mikroskopscenen
- Til billedembryoner skal du bruge et konfokalt mikroskop, der er udstyret med en 20x vandnedsænkningsmålsætning, numerisk blænde0,95, arbejdsafstand 0,95 mm og NIS-Elements AR 5.11.01 64-bit software.
- Ved hjælp af bred-felt fluorescens, visuelt lokalisere svælg buer. Centrer feltvisningen omkring4.
- Hvis målets synsfelt ikke fanger hele svælgbueområdet, skal du tage og sy et stort billedepanel med 1% overlapning. For at forhindre flytning af prøven under erhvervelsen af det store billede, forsigtigt sikre dækslet slip samling til scenen ved hjælp af støbning ler.
-
Opsætning af anskaffelsesparametre
- Indstil pinhole-størrelsen til 1,0.
- Under fanen ND Acquisition skal du angive de øverste og nederste grænser for billeddannelse ved hjælp af den grove justering. Angiv Z-trinstørrelse i henhold til softwarespecifikationer. Bestem den tykkelse, der kan afbildes ved at arbejde afstand af målet og klarheden af prøven.
- På grund af tykkelsen af fosteret, justere gevinsten i hele Z-stakken. Indstil laserintensiteten og forstærkningen midt i Z-stakken for hver kanal (405, 488 og 555), og tildel værdier under fanen Z-intensitetskorrektion.
- Rul gennem embryonet, indtil fluorescenssignaler begynder at dukke lysdæmper. Forøg forstærkningen af hver kanal, indtil signalintensiteten ligner det forrige segment. Tildel den nye værdi under fanen Z-intensitetskorrektion. Gentag indtil z-stack er fuldført. Importer indstillingerne tilbage til ND Acquisition.
- Kør scanning ved hjælp af indstillingen Kør Z-korrektion.
7. Analyse ved hjælp af Imaris-softwaren
BEMÆRK: I disse trin, konfokale billeder vil blive analyseret ved hjælp af mikroskopi billedanalyse software, Imaris version 9.2.0. I løbet af denne analyse, vil vi først vælge regioner af interesse, der skal analyseres ved at skabe overflader. Dernæst vil vi bruge funktionen Maske til visuelt at adskille disse områder. Endelig vil vi bruge spotfunktionen til at kvantificere antallet af eDc'er inden for hver interesseregion.
- Afhængigt af den billedbehandlingssoftware, der blev brugt i trin 6, skal du konvertere billeder til .ims ved hjælp af Imaris File Converter.
- Åbn .ims-filerne. Indstil billede til Ortogonal under Kamera/Etiketter | Kameratypepanel.
- Find PA'erne, og orienter billedet til overfladebehandling.
BEMÆRK: Når filerne åbnes første gang, vises de som en 3D-kompilering af alle afbilledet udsnit. I dette trin vil PAA'erne blive placeret ved at gøre 3D-billedet til et 2D-billede. 2D-billedet giver derefter mulighed for, at PA'erne kan være korrekt orienteret til analyse.- Slå Lydstyrkefra under panelet Egenskaber . Klik på Tilføj nyt ortho-udsnitsværktøjunder panelet Egenskaber . Indstil udsnitsretningen til XY-planet. Brug udsnitspositionen til at rulle gennem billedet, indtil du finder PA'erne.
- Hvis PA'erne ikke er parallelle med toppen og bunden af billedet, skal du frit rotere billedet ved hjælp af musemarkøren, så PA'er løber fra venstre mod højre hen over skærmen. Vælg Fri roter under rullemenuen Billedbehandling, og klik på OK.
- Overfladebehandling af 3 rd Pharyngeal Arch (Figur 2A, B - B")
BEMÆRK: I disse trin spores de svælgbuer og PAA'er ved hjælp af Surface-værktøjet til at generere en "overfladeet" interesseregion. Dette vil gøre det muligt for hver region af interesse at være visuelt isoleret fra det omgivende væv. Heri beskriver vi trinene til overfladen og analysere endotel komponenter af 3rd svælg bue. Pharyngeal buer 4 og 6 analyseres på samme måde.- Hvis du vil overfladelægge endotel i hele 3rd svælg bue, skal du klikke på Tilføj ny surface-knappen placeret under panelet Egenskaber. Dobbeltklik på Surface 1, og omdøb den nye overflade til "3rd Pharyngeal Arch".
- Vælg Spring automatisk oprettelse over, rediger manuelt. Indstil Overfladeretningen til YZ-planet (koronal retning). Brug udsnitspositionen til at placere det3 rd svælgbueoverfladeplan, hvor 3rd PAA og Dorsal Aorta forbindes.
- Roter billedet, så det3. Slå Ortho Slicer 1 fra.
- Under lodtrækningen | Kontur | Skal du vælge funktionen Afstandstegningstilstand. Juster parameterindstillinger, hvis det er nødvendigt. Vedligehold ensartede overfladebehandlingsparametre mellem prøver. I dette eksempel er Vertex-afstanden 10 μm.
- Hvis du vil begynde at vise, skal du trykke på Esc og derefter klikke på knappen Tegn. Spor omkredsen af den3 rd svælg bue med musemarkøren. Brug udsnitspositionen til at flytte 10-25 udsnit. Spor omkredsen af svælgbuen. Gentag indtil svælgbuen er fuldt sporet.
- Hvis du vil generere overfladen af det sporede område, skal du vælge knappen Opret overflade i panelet Egenskaber.
- Belægning af 3 rd PAA ( Figur2C- C")
- Til overfladen endotel af 3rd PAA, først slukke den overfladeerede region fra trin 7,4, ved at fravælge 3rd Pharyngeal Arch overflade boks. Klik derefter på knappen Tilføj ny surface igen. Dobbeltklik på Surface 1, og omdøb den nye overflade til "3rd PAA".
- Vælg Spring automatisk oprettelse over, rediger manuelt. Indstil Overfladeretningen til YZ-planet (koronal retning). Brug udsnitspositionen til at placere det 3rd PAA-overfladeplan, hvor 3rd PAA og Dorsal Aorta tilslutter sig, og gentag derefter trin 7.4.
- Maskering af overfladekonstruktioner
BEMÆRK: I de følgende trin vil hvert område af interesse blive maskeret. Maskering gør det muligt for regionen af interesse at være visuelt adskilt fra resten af det afbildede væv og giver mulighed for kvantificering af disse forskellige strukturer af interesse. Nedenfor beskriver vi trinene i Imaris for at visualisere og analysere PAA endotel, samt plexus - de mindre vaskulatur omkring PAA'erne inden for svælg buer. I disse trin maskeres den 3rd PAA-overflade for kun at visualisere og udføre analyser på PAA'erne ved hjælp af spotfunktionen, der er beskrevet i afsnit 7.7.- Vælg Lydstyrke for at visualisere alle maskerede kanaler. Tryk på Esc for at rotere billedet og placere billedet i en XY-position.
- Vælg Maskemarkering for den 3 rd PAAunder fanen Rediger. Vælg DAPI-kanalen, og klik på OK. Gentag for de resterende kanaler.
- Tryk på Ctrl + D på tastaturet for at få vist panelet Displayjusteringer. Vælg hver ny kanal, og omdøb dem for at gøre det klart, hvad hver kanal viser. For eksempel vil dette føre til tre nye kanaler: "3rd PAA DAPI", "3rd PAA ERG" og "3rd PAA VEGFR2".
BEMÆRK: I trin 7.6.4-7.6.7 vil vi skabe kanaler for svælg arch plexus alene. - Hvis du vil visualisere den endotelplexus separat fra PAA, vælger vi først Maskemarkering for den 3rd PAA-overflade. Vælg DAPI-kanalen. Fjern markeringen af Vælg voxels udvendige overflade for at markere Vælg voxels inde i overfladen til knapper, sæt Vælg voxels inde i overfladen til nul. Klik på OK.
- Gentag for de resterende kanaler. Denne handling udelukker det område, der indeholder PAA, fra de nye maskerede kanaler. Omdøb kanaler for at gøre det klart, hvad hver kanal viser. Føre til tre nye kanaler: "Non-PAA DAPI", "Non-PAA ERG" og "Non-PAA VEGFR2".
- Hvis du vil visualisere endotelplexusinden for den 3 rd svælgbue, skal du vælge Maskemarkering under fanen Rediger for den 3rd Pharyngeal Arch-overflade. Vælg ikke-PAA DAPI-kanalen. Klik på OK.
- Gentag for de resterende ikke-PAA-kanaler. Omdøb kanaler for at gøre det klart, hvad hver kanal viser. For eksempel vil dette føre til tre nye kanaler: "Plexus DAPI", "Plexus ERG" og "Plexus VEGFR2".
- Kvantificering af EF-numre
BEMÆRK: Udtrykket af ERG-mærker endotelkerner, hvilket gør det bekvemt at kvantificere EF-tal. I disse trin vil antallet af eCs blive kvantificeret ved hjælp af spotfunktionen til at skabe et punkt for hvert EF, der er markeret med ERG-udtryk i PAA og plexus. I afsnit 7.7 vil der blive genereret pletter for hver ERG-positiv celle i den maskerede PAA, efterfulgt af fravalg af pletter i ERG-positive, VEGFR2-negative celler.- Tryk på Ctrl + D på tastaturet for at få vist panelet Displayjusteringer. Sluk alle kanaler undtagen PAA ERG.
- Klik på knappen Tilføj nye pletter under fanen Egenskaber. Klik på Spots 1 og omdøbe den til "PAA totalantal eCs". Klik på den blå pileknap. Vælg PAA ERG-kanalen for Kildekanal. Den anslåede XY-diameter justeres til 4 μm. Fortsæt til næste panel ved at klikke på den blå pileknap.
- Juster antallet af pletter, der ses ved hjælp af glideskalaen, for at sikre, at hver EF-kerne (markeret med ERG-udtryk) repræsenteres af ét sted. Klik på den grønne dobbeltpilknap.
- Sluk for PAA ERG-kanalen i Displayjusteringen. Tænd for PAA VEGFR2-kanalen for at visualisere PAA endotel.
- For præcist at kvantificere antallet af eCs sikrer vi, at hvert sted udtrykker både EF-markører, ERG og VEGFR2. Det kan du gøre ved at vælge Surface of Object under fanen Rediger | Panelet Tilføj/slet. Tryk Esc på Esc-tasten, og slet pletter, der ikke er VEGFR2-positive, ved at holde skift nede og vælge stedet.
BEMÆRK: I det følgende trin vil der blive genereret pletter for hver ERG-positiv celle i den maskerede plexus, efterfulgt af fravalg af pletter i ERG-positive, VEGFR2-negative celler. - Klik på knappen Tilføj nye pletter under fanen Egenskaber. Vælg Plads 1, og omdøb til "Plexus Total Number of ECs". Klik på den blå pileknap. Vælg Plexus ERG-kanalen under Kildekanal. Den anslåede XY-diameter justeres til 4 μm. Gentag trin 7.7.1 - 7.7.5 for Plexus samlede antal eCs.
- Klik på fanen Statistik for hver staffagefunktion for at bestemme det samlede antal ECs i 3rd PAA og svælg arch plexus.
- Gentag trin 7.7.1 - 7.7.6 for de resterende PAA'er og svælg arch plexus.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den helmonterede immunofluorescensprotokol, der præsenteres her, giver klare og rene resultater, hvilket giver mulighed for 3D-rekonstruktion af svælgsvangendotel, som det ses i figur 1A. Det er vigtigt at inkubere embryoner i tilstrækkelig lang tid i hver antistofopløsning for at sikre fuldstændig gennemtrængning gennem prøven samt grundigt vask af embryoner efter antistofinkubation. I figur 1Bfremstår store, lyse prikker som følge af partikler i enten antistof- eller blokeringsbufferopløsningerne. Vi har konstateret, at centrifugering af hver opløsning før brug og længere perioder med PBST vasker efter hver antistofinkubation løser dette problem.
Figur 2 illustrerer den proces, der anvendes til at fremgå af en svælgbue og en PAA til analyse som beskrevet i protokollens afsnit 7. Ved hjælp af den maskerede funktion, Imaris software tillader dukket regioner, der skal visuelt adskilt og analyseres uafhængigt.
Figur 3 viser individuel maskering af forskellige vaskulære rum i svælgbuerne: PAA (figur 3A, B, C) og plexus ( figur3A', B', C'). Maskering giver mulighed for analyse og kvantificering af EF-numre i hver struktur separat. I figur 3C-C'anvendes spotfunktionen til at kvantificere det samlede antal eCs i både PAA og plexus ved at tildele et enkelt punkt for hver kerne, der udtrykker ERG. Det er vigtigt at bemærke, at den algoritme, der bruges til staffagefunktionen, er designet til at generere en prik for en pixel af en bestemt størrelse. ERG, som bruges her som en markør for EF-kerner, er også udtrykt i neurale crest celler8; neurale crestceller ikke udtrykker VEGFR2. Figur 3D illustrerer et eksempel på et ERG-positivt (grønt), VEGFR2-negativt (lyserødt) sted, der er genereret af Imaris Spot-funktionen. Som følge heraf er det vigtigt at kontrollere, at hver prik repræsenterer et enkelt EF og er mærket med både ERG og VEGFR2.
| Trin | Tid | Temperatur | |
| 1 | PBST Vask/Permeabilization | 24 timer eller O/N | 4 °C |
| 2 | Blokeringsbuffer | 25 timer eller O/N | 4 °C |
| 3 | Primært antistof | 4-5 dage | 4 °C |
| 4 | PBST Vask | 4-5 gange om dagen i 2 dage | RT (eller 4 °C, hvis O/N) |
| 5 | Sekundært antistof | 4-5 dage | 4 °C |
| 6 | PBST Vask | 4-5 gange om dagen i 2 dage | RT (eller 4 °C, hvis O/N) |
| 7 | Integrere | Nielsen | Rt |
| 8 | Methanol Dehydrering og BABB | 1 time pr. trin | Rt |
Tabel 1: Oversigt over hele mount immunfluorescens protokol. O/N - natten over; RT - stuetemperatur.
Figur 1: Sammenligning af rene og snavsede billeder efter fuldmonteringsimmunfluorescens. Sagittal visninger af E10.5 embryo viser brugen af anti-VEGFR2 antistof (hvid) til at visualisere PAA endotel. Embryoner, der er grundigt vasket med PBST post-antistofinkubationer (A), har et højere signal-støj-forhold og giver et renere billede sammenlignet med embryoner, der ikke vaskes grundigt (B). Pile i B viser områder med støj/snavs, der er dukket op i billedet, når et embryon ikke vaskes grundigt, eller antistofopløsningen ikke er centrifugeret. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Belægning af svælgbue (PA) og PAA. En 2D sagittal visning (A) bruges til at identificere placeringen af PAA'erne i det konfokale billede. En koronal ortho pålægsmaskine (A, gul linje) er sted gennem PAAs. Svælgbuen (B) og PAA (C) vises derefter i koronalretningen ved hjælp af værktøjet Distance Drawing i Imaris. Værktøjet Afstandstegning, der er indstillet til 10 μm, bruges til at spore omkredsen af den 3rd svælgbue (B) eller PAA (C). Konturer tegnes hver 10-25 skiver gennem hele buen (B', C'). Konturer kombineres for at generere en 3D-overflade af svælgbuen (B") eller PAA (C"). Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Kvantificering af EF-tal i en PAA og en plexus. 3D rekonstruktioner bruges til at visualisere fartøjets struktur og udtryk for EF-markører i en PAA eller i en EC plexus separat. Paneler A-A ' viser udtrykket af VEGFR2 i PAA (A, gul) og i plexus (A', pink). Panel A" illustrerer en sammenfletning af PAA og plexus VEGFR2-udtrykket. Paneler B-B' viser udtrykket af ERG i PAA (B, rød) og i plexus (B', grøn). Panel B" illustrerer sammenfletningen af PAA og plexus. C-C'. Spotfunktionen i Imaris bruges til at kvantificere antallet af eCs i enten PAA eller plexus. Hver ERG-positiv celle i PAA (C, rød) eller plexus (C', grøn) tildeles et enkelt sted for at markere et enkelt EF. Pilen i C'-D viser et eksempel PÅ EN ERG-positiv, VEGFR2-negativ plet i plexus, der er genereret af Imaris Spot-funktionen. Dette sted er udelukket fra kvantificering. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Evnen til at visualisere endotel i museembryoner i 3D har givet ny indsigt i deres udvikling3. Her præsenterer vi en protokol, der giver mulighed for høj opløsning 3D-billeddannelse af embryoner, visualisering af vaskulære tilslutningsmuligheder, og kvantitative analyser af PAA dannelse. Denne protokol kan anvendes til at se, hvordan genetiske ændringer eller miljømæssige fornærmelser indvirkning PAA udvikling. Den procedure, der rapporteres her, anvender antistoffer mod VEGFR2 og ERG til at visualisere PAA-dannelse og kvantificere EF-nummer. dog, yderligere antistoffer kan bruges til at visualisere og analysere andre aspekter af arch arterie udvikling, såsom neurale crest rekruttering eller glat muskel celle differentiering. Hvis denne procedure skal anvendes på tidligere stadier af embryogenese, er det vigtigt at bemærke, at visse antigener (f.eks. Andre nukleare pletter såsom DAPI eller DRAQ5 eller afstamning mærkning med nukleare-mærkede sporstoffer kan bruges til at kvantificere EF-nummer.
Der er flere kritiske trin i protokollen: at sikre, at 1) embryoner ikke bliver udtørret mellem opløsningsændringer; 2) embryoner vaskes grundigt efter antistofinkubationer; og 3) at embryoner ne er fuldstændig dehydreret med MeOH før vævsrydning med BABB.
Methanolvask før vævsrydning tjener to formål: at eliminere fluorescens på grund af ekspression af fluorescerende proteiner (f.eks. ekspression af EGFP eller tdTomato, der anvendes til afstamningssporing) i fosteret, og at dehydrere vævet. Elimineringen af fluorescens fra fluorescerende proteiner gør det muligt at anvende enhver kombination af fluorophorer til billeddannelse. Antistoffer mod EGFP og TdTomato (kirsebær) kan bruges til at visualisere udtryk for disse fluorescerende proteiner. Alternativt kan MeOH erstattes af tetrahydrofuran for at bevare fluorescensen af fluorescerende proteiner9.
Vi har konstateret, at embryoner, der ikke er blevet ordentligt dehydreret før BABB clearing er vanskelige at billedet på grund af lys spredning. BABB er en hydrofob opløsning, der kræver fuldstændig dehydrering i et organisk opløsningsmiddel for at rydde det uigennemsigtige væv. Komplet rydning sikrer evnen til at opnå billeder på det dybeste mulige niveau i embryonet10,11. I denne protokol brugte vi en 20x vand nedsænkning mål, på grund af sin lange arbejdsafstand og tilgængelighed på tidspunktet for vores eksperimenter. Olienedsænkningsmål er bedre egnet til denne protokol, da BABB og olie har tættere brydningsindeks er end vand og BABB. Men på trods af forskellen i brydningsindeks, vand nedsænkning mål, der anvendes i denne protokol forudsat fremragende billedkvalitet.
Der er nogle få begrænsninger i denne protokol. BABB clearing udnyttet her er giftig og ætsende11,12,13. BABB opløser lim og plast. Hvis prøverne ikke håndteres korrekt under billeddannelse, kan mikroskopobjektivet blive beskadiget af BABB, som kan slippe ud af prøven via revner i dækstrækket eller en brudt forsegling mellem Fast Well kofangeren og dækselstrækket. Rydningsmetoder, der ikke anvender organiske opløsningsmidler, såsom CLARITY, kan anvendes som alternativ10,11,14. CLARITY's brydningsindeks matching løsning har en brydningsindeks svarende til vand, hvilket gør det til en passende clearing metode, hvis du bruger en vand nedsænkning mål. En yderligere begrænsning af denne protokol er, at det kun kan udføres på ikke-levende væv, og dermed forhindre dens anvendelse til levende billeddannelse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Vi takker Brianna Alexander, Caolan O'Donnell og Michael Warkala for omhyggelig læsning og redigering af dette manuskript. Dette arbejde blev støttet af midler fra National Heart, Lung and Blood Institute af NIH R01 HL103920, R01 HL134935, R21 OD025323-01 til SA; AJR er støttet af NHLBI HL103920-08S1 og National Institute of Arthritis og muskel- og skelet-og hudsygdomme Uddannelse tilskud T32052283-11.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10x PBS | MP Biomedicals | PBS10X02 | |
| 20x water immersion objective | Nikon | MRD77200 | |
| Agarose | Bio-Rad Laboratories | 1613101 | |
| Alexa Fluor 488 anti-goat | Invitrogen | A-11055 | |
| Alexa Fluor 555 anti-mouse | Invitrogen | A-31570 | |
| Analysis Software | Imaris 9.2.0 | ||
| Benzyl Alcohol | Sigma-Aldrich | 305197 | |
| Benzyl Benzoate | Sigma-Aldrich | 8.18701.0100 | |
| Cover Slips | VWR | 16004-312 | |
| DAPI (5 mg/mL stock) | Fisher Scientific | D3571 | |
| Eppendorf Tubes (2.0 mL) | Fisher Scientific | 05-408-138 | |
| Ethanol | VWR | 89370-084 | |
| Falcon tubes (50 mL) | Corning | 352098 | |
| Fast wells | Grace Bio Labs | 664113 | |
| Forceps | Roboz | RS-5015 | |
| Goat anti-VEGFR2 | R&D Systems, Inc. | AF644 | |
| Methanol | VWR | BDH1135-4LP | |
| Microscope | Nikon | A1HD25 | |
| Mouse anti-ERG | Abcam | ab214341 | |
| Normal Donkey Serum | Sigma-Aldrich | D9663 | |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| Pasteur pipets | Fisher Scientific | 13-678-20D | |
| Petri dishes (35 mm) | Genesee Scientific | 32-103 | |
| Petri dishes (60 mm) | Genesee Scientific | 32-105 | |
| Plastic Molds | VWR | 18000-128 | |
| Scapels | Exelint International Co. | 29552 | |
| Triton-X-100 | Fisher Scientific | BP 151-500 |
References
- Hiruma, T., Nakajima, Y., Nakamura, H. Development of pharyngeal arch arteries in early mouse embryo. Journal of Anatomy. 201 (1), 15-29 (2002).
- Hutson, M. R., Kirby, M. L. Model systems for the study of heart development and disease Cardiac neural crest and conotruncal malformations. Seminars in Cell & Developmental Biology. 18 (1), 101-110 (2007).
- Wang, X., et al. Endothelium in the pharyngeal arches 3, 4 and 6 is derived from the second heart field. Developmental Biology. 421 (2), 108-117 (2017).
- Jerome, L. A., Papaioannou, V. E. DiGeorge syndrome phenotype in mice mutant for the T-box gene, Tbx1. Nature Genetics. 27 (3), 286-291 (2001).
- Lindsay, E. A., et al. Tbx1 haploinsufficieny in the DiGeorge syndrome region causes aortic arch defects in mice. Nature. 410 (6824), 97-101 (2001).
- Weninger, W., et al. Visualising the Cardiovascular System of Embryos of Biomedical Model Organisms with High Resolution Episcopic Microscopy (HREM). Journal of Cardiovascular Development and Disease. 5 (4), 58 (2018).
- Phillips, H. M., et al. Pax9 is required for cardiovascular development and interacts with Tbx1 in the pharyngeal endoderm to control 4th pharyngeal arch artery morphogenesis. Development. 146 (18), (2019).
- Vlaeminck-Guillem, V., et al. The Ets family member Erg gene is expressed in mesodermal tissues and neural crests at fundamental steps during mouse embryogenesis. Mechanisms of Development. 91 (1-2), 331-335 (2000).
- Ertürk, A., et al. Three-dimensional imaging of the unsectioned adult spinal cord to assess axon regeneration and glial responses after injury. Nature Medicine. 18 (1), 166-217 (2012).
- Azaripour, A., et al. A survey of clearing techniques for 3D imaging of tissues with special reference to connective tissue. Progress in Histochemistry and Cytochemistry. 51 (2), 9-23 (2016).
- Richardson, D. S., Lichtman, J. W.
- Becker, K., Jährling, N., Saghafi, S., Weiler, R., Dodt, H. U. Chemical Clearing and Dehydration of GFP Expressing Mouse Brains. PLoS One. 7 (3), e33916 (2012).
- Ertürk, A., et al. Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO. Nature Protocols. 7 (11), 1983-1995 (2012).
- Kuwajima, T., et al. ClearT: a detergent- and solvent-free clearing method for neuronal and non-neuronal tissue. Development. 140 (6), 1364-1368 (2013).
