Her beskriver vi en protokol til at visualisere og analysere svælg bue arterierne 3, 4 og 6 af mus embryoner ved hjælp af hele mount immunfluorescens, væv clearing, konfokal mikroskopi, og 3D rekonstruktion.
Forkert dannelse eller remodeling af svælg bue arterier (PAAs) 3, 4 og 6 bidrage til nogle af de mest alvorlige former for medfødt hjertesygdom. For at studere dannelsen af PAA’er udviklede vi en protokol ved hjælp af fuldmonteret immunfluorescens kombineret med benzylalkohol/benzylbenzoat (BABB) vævsclearing og konfokal mikroskopi. Dette giver mulighed for visualisering af svælg bue endotel på en fin cellulær opløsning samt 3D-forbindelse af vaskulaturen. Ved hjælp af software har vi etableret en protokol til kvantificering af antallet af endotelceller (ECs) i PAA’er samt antallet af eCs inden for den vaskulære plexus omkring PAA’erne inden for svælgbuer 3, 4 og 6. Når denne metode anvendes på hele embryonet, giver den en omfattende visualisering og kvantitativ analyse af embryonal vaskulatur.
Under mus embryogenese, svælg bue arterier (PAAs) opstår som symmetriske, bi-laterale par arterier, der forbinder hjertet med dorsale aortae1. Som embryoet udvikler sig, den første og andet par PAAs regress, mens 3rd, 4th, og 6th PAAs gennemgå en række asymmetriske remodeling begivenheder til at danne aorta bue arterier2.
PaA’erne 3, 4 og 6 udvikler sig via vaskulogenese, som er de novo-dannelsen af blodkar3. Defekter i dannelsen eller ombygning af disse bue arterier giver anledning til forskellige medfødte hjertefejl, såsom dem, der ses hos patienter med DiGeorge syndrom4,5. Derfor kan forståelse af mekanismer, der regulerer udviklingen af PAA’er, føre til en bedre forståelse af medfødt hjertesygdom (CHD) ætiologi.
Nuværende tilgange til visualisering og analyse paa udvikling omfatter immunfluorescens af væv sektioner, vaskulære kaster, Indien blæk injektion, høj opløsning episkopi, og / eller hele mount immunhistokemi1,4,,5,,6,7. Heri beskriver vi en protokol, der kombinerer helmonteret immunfluorescens, konfokal mikroskopi og 3D-billedgengivelse for at indsamle, analysere og kvantificere volumetriske data, vaskulære konnektivitet og celleidentitet. Yderligere, vi detaljer en metode til at opdele og kvantificere antallet af ECs i hver svælg bue som et middel til at studere dannelsen af svælg arch vaskulære plexus og dens remodeling i PAAs. Mens denne protokol er designet til at analysere PAA udvikling, kan det bruges til at analysere andre udvikle vaskulære netværk.
Evnen til at visualisere endotel i museembryoner i 3D har givet ny indsigt i deres udvikling3. Her præsenterer vi en protokol, der giver mulighed for høj opløsning 3D-billeddannelse af embryoner, visualisering af vaskulære tilslutningsmuligheder, og kvantitative analyser af PAA dannelse. Denne protokol kan anvendes til at se, hvordan genetiske ændringer eller miljømæssige fornærmelser indvirkning PAA udvikling. Den procedure, der rapporteres her, anvender antistoffer mod VEGFR2 og ERG til …
The authors have nothing to disclose.
Vi takker Brianna Alexander, Caolan O’Donnell og Michael Warkala for omhyggelig læsning og redigering af dette manuskript. Dette arbejde blev støttet af midler fra National Heart, Lung and Blood Institute af NIH R01 HL103920, R01 HL134935, R21 OD025323-01 til SA; AJR er støttet af NHLBI HL103920-08S1 og National Institute of Arthritis og muskel- og skelet-og hudsygdomme Uddannelse tilskud T32052283-11.
10x PBS | MP Biomedicals | PBS10X02 | |
20x water immersion objective | Nikon | MRD77200 | |
Agarose | Bio-Rad Laboratories | 1613101 | |
Alexa Fluor 488 anti-goat | Invitrogen | A-11055 | |
Alexa Fluor 555 anti-mouse | Invitrogen | A-31570 | |
Analysis Software | Imaris 9.2.0 | ||
Benzyl Alcohol | Sigma-Aldrich | 305197 | |
Benzyl Benzoate | Sigma-Aldrich | 8.18701.0100 | |
Cover Slips | VWR | 16004-312 | |
DAPI (5 mg/mL stock) | Fisher Scientific | D3571 | |
Eppendorf Tubes (2.0 mL) | Fisher Scientific | 05-408-138 | |
Ethanol | VWR | 89370-084 | |
Falcon tubes (50 mL) | Corning | 352098 | |
Fast wells | Grace Bio Labs | 664113 | |
Forceps | Roboz | RS-5015 | |
Goat anti-VEGFR2 | R&D Systems, Inc. | AF644 | |
Methanol | VWR | BDH1135-4LP | |
Microscope | Nikon | A1HD25 | |
Mouse anti-ERG | Abcam | ab214341 | |
Normal Donkey Serum | Sigma-Aldrich | D9663 | |
Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
Pasteur pipets | Fisher Scientific | 13-678-20D | |
Petri dishes (35 mm) | Genesee Scientific | 32-103 | |
Petri dishes (60 mm) | Genesee Scientific | 32-105 | |
Plastic Molds | VWR | 18000-128 | |
Scapels | Exelint International Co. | 29552 | |
Triton-X-100 | Fisher Scientific | BP 151-500 |