Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

قياس المعلمات االوقائية من إكسوسيتسيس الخلوية في الخلايا micropatterned

Published: September 16, 2020 doi: 10.3791/60801
Automatic Translation
1,2,3, 1,2,3, 4, 1,2,3
1Unité Mixte de Recherche 144 CNRS, Molecular Mechanisms of Intracellular Transport group, Institut Curie, 75005 Paris, France, 2PSL Research University, Paris, France, 3Sorbonne Université, Paris, France, 4INRIA, Université Paris-Sud, PSL

Summary

التصوير الحي للزخات الليفية على الخلايا الصغيرة يسمح لك بالكمية المكانية لهذه العملية. التطبيع مورفولوجيا باستخدام micropatterns هو أداة متميزة للكشف عن القواعد العامة حول التوزيع المكاني للعمليات الخلوية.

Abstract

التصوير الحي للpHluorin الموسومة القابلة للذوبان N-ethylmaleimide الحساسة عامل ملحق البروتين REceptor (V-SNARE) بروتين الغشاء المرتبط Vesicle 7 (VAMP7) عن طريق مجموع المجهر الفلورية الداخلية الانعكاس (TIRFM) هو وسيلة مباشرة لاستكشاف إفراز من المقصورة lysosomal. الاستفادة من ثقافة الخلية على الأسطح micropatterned لتطبيع شكل الخلية، تم استخدام مجموعة متنوعة من الأدوات الإحصائية لإجراء تحليل مكاني للأنماط الإفرازية. باستخدام وظيفة ريبلي K واختبار إحصائي يستند إلى أقرب مسافة الجيران (NND)، أكدنا أن إفراز من lysosomes ليست عملية عشوائية ولكن يظهر التجمع كبيرة. ملاحظة, تحليلنا كشفت أن الأحداث exocytosis هي أيضا مجمعة في المناطق غير الالتصاق, مشيرا إلى أن جزيئات الالتصاق ليست الهياكل الوحيدة التي يمكن أن تحفز بؤر ساخنة إفرازية في غشاء البلازما. ومع ذلك، وجدنا أن التصاق الخلية يعزز التجمع. بالإضافة إلى المناطق اللاصقة وغير اللاصقة المحددة بدقة ، فإن الهندسة الدائرية لهذه الميكوروبات يسمح باستخدام الإحداثيات القطبية ، وتبسيط التحليلات. استخدمنا تقدير كثافة النواة (KDE) ووظيفة التوزيع التراكمية على الإحداثيات القطبية لأحداث الإزدِاد لتحديد المناطق الغنية من الزّب. وفي الخلايا الصغيرة ذات الشكل الحلقي، حدث التجميع عند الحدود بين المناطق اللاصقة وغير اللاصقة. ويوضح تحليلنا كيف يمكن استخدام الأدوات الإحصائية لدراسة التوزيعات المكانية للعمليات البيولوجية المتنوعة.

Introduction

إكسوسيتوزيس هو عملية الخلوية العالمية التي الصمامات في vesicle مع غشاء البلازما وتطلق محتواها. يمكن للفتح إما أن يصهر تماما مع غشاء البلازما (الانصهار الكامل) أو إنشاء المسام الانصهار التي تبقى مفتوحة خلال فترة زمنية محدودة (قبلة وتشغيل)1. على سبيل المثال، يتم إطلاق البروتينات المركبة حديثاً في الوسط خارج الخلية من الفُيْنَسَة التي تأتي من مجمع غولجي. هذا المسار البيولوجي، anterograde هو بدائي، وخاصة في الكائنات الحية متعددة الخلايا، لافراز الببتيدات إشارة (على سبيل المثال، الهرمونات، الناقلات العصبية) ومكونات مصفوفة خارج الخلية (على سبيل المثال، الكولاجين)، وكذلك إلى نقل البروتينات عبر الغشاء إلى غشاء البلازما. بالإضافة إلى ذلك، يمكن أن تحدث إفرازات من إندوسومات مختلفة: 1) إعادة تدوير الغدد الوسومات من أجل إعادة استخدام البروتينات عبر الميمبرين؛ 1) إعادة تدوير الغدد الانسهازومات من أجل إعادة استخدام البروتينات عبر الغشاء؛ 1) إعادة تدوير الغدد الانسهازية من أجل إعادة استخدام البروتينات عبر الغشاء؛ (1) إعادة تدوير الغدد الانسهازية من أجل إعادة استخدام البروتين 2) الهيئات متعددة الأطراف (MVBs) لإطلاق الكوسومات؛ و 3) lysosomes للافراج عن الانزيمات البروتية. وقد تبين إفراز الغدد النابعة لتكون مهمة لthgrowth نيوريت، تشكيل pseudopodia، وإصلاح غشاء البلازما، وإشارات ATP تعتمد2.

لدراسة الزخراب على مستوى الخلية الواحدة، تم استخدام العديد من التقنيات. التصحيح المشبك يسمح للكشف عن أحداث اكسوسيتوزيس واحد مع دقة زمنية عالية في مجموعة واسعة من الخلايا الحية3. ومع ذلك، لا يوفر هذا الأسلوب معلومات حول ترجمة أحداث القذف، ولا من أي المقصورة يحدث. يسمح المجهر الإلكتروني بالتصور المباشر للأحداث واظهارية مع دقة مكانية عالية، وبالاقتران مع علم المناعة يوفر معلومات حول خصوصية المقصورات والجزيئات المعنية. ومن عيوب هذا النهج نقص المعلومات عن ديناميات العملية، فضلا عن عدم قدرتها على إجراء دراسات عالية الإنتاجية. 24- توفر أساليب التحليل المجهري الخفيف مثل التحليل المجهري للانعكاس الداخلي الكلي (TIRFM)، الذي يستغل الحقل المضيء لإلقاء الضوء على الفلوروفور في محيط الغطاء (100 نانومتر)، دقة زمنية ومكانية جيدة لدراسة أحداث القذف. ومع ذلك، هذه الطريقة متوافقة فقط مع الخلايا المتصّقة ولا يمكن تطبيقها إلا على الجزء البطني/السفلي من الخلايا.

لاحظ أن غشاء البلازما يكشف عن عدم تجانس كبير على أساس مجمعات لاصقة موجودة فقط في المناطق المحظورة. هذا التغاير يقيد، على سبيل المثال، امتصاص حروف رابطة مختلفة4. وبالمثل، فقد أفيد مؤخرا أن إفراز مجمع غولجي يتركز في "النقاط الساخنة" في غشاء البلازما5. وعلاوة على ذلك، فمن المعروف أن بعض البضائع تفرز من خلال التركيز التصاق المرتبطة exocytosis6. وهكذا، ينبغي إيلاء اهتمام خاص لمسألة ما إذا كانت الأحداث exocytosis توزع عشوائيا في الفضاء، أو ما إذا كانت تتركز في مناطق محددة من غشاء البلازما. وقد اقترحت العديد من الأدوات الإحصائية على أساس وظيفة سبيلي K لاستكشاف هذه الأسئلة7،8،9. نهجنا يجمع بين هذه الأدوات مع micropatterning للسيطرة على شكل الخلية وغشاء البلازما غير متجانسة. بالإضافة إلى توفير وسيلة للتمييز بين المناطق اللاصقة وغير اللاصقة ، تسمح هذه التقنية أيضًا بالمقارنة عبر الخلايا والظروف المختلفة وتزيد من قوة التحليلات الإحصائية.

هنا نوظف مجموعة متنوعة من الأدوات الإحصائية لدراسة التوزيع المكاني لأحداث القذف من المقصورة الليسوسومية التي رصدها TIRFM التصوير الخلية الحية من VAMP7-pHluorin في شكل رنين micropattern تطبيع hTert-RPE1 الخلايا. وقد تأكد أن إفراز من lysosomes ليست عملية عشوائية8,9 وأن الأحداث exocytosis المعرض التجمع. ملاحظة, وجدنا أن الأحداث exocytosis هي أيضا مجمعة في المناطق غير التصانية, مشيرا إلى أن جزيئات الالتصاق ليست الهياكل الوحيدة التي يمكن أن تحفز النقاط الساخنة الإفرازية في غشاء البلازما. ومع ذلك، فإن التصاق الخلية عزز التجمع. على الدوام، حدد تحليلنا المناطق المخصبة من الزخرفة التي كانت تقع على الحدود بين المناطق اللاصقة وغير الالتصاقية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1- إعداد الخلايا الصغيرة

  1. نقل الخلايا
    1. قبل يوم واحد من عملية الانتـرُف، بذور 2.5 × 106 خلايا hTERT-RPE1 في بئر واحد من 12 بئراً (2 × 2 سم) في 1 مل من المتوسط.
    2. في يوم transfection، وإعداد خليط transfection مع VAMP7-pHluorin plasmid (100 ميكرولتر من العازلة، 0.8 ميكروغرام من الحمض النووي، 3 ميكرولتر من خليط transfection). احتضان لمدة 10 دقيقة.
      ملاحظة: VAMP7 هو lysosomal v-SNARE، تنصهر مع علامة pHluorin لامعة. يتم إخماد مسبار pHluorin بواسطة انخفاض نسبة الوفيات، ولكن أثناء البروتونات القذفية يتم إطلاقها ويبدأ pHluorin تنبعث منها إشارة10،11.
    3. إضافة مزيج transfection إلى الخلايا في وسطها.
    4. تغيير 4 ساعة المتوسطة بعد إضافة مزيج transfection على الخلايا.
    5. استخدم الخلايا لإجراء التجارب خلال 24-48 ساعة التالية.
  2. إعداد micropattern (طريقة التصوير الضوئي)
    1. غسل الأغطية (25 مم من القطر) في الإيثانول والسماح لهم الجافة لمدة 5 دقائق.
    2. تنشيط الأغطية عن طريق الإضاءة تحت الأشعة فوق البنفسجية العميقة لمدة 5 دقائق.
    3. إنشاء غرفة رطبة من خلال الترطيب بدقة منشفة ورقية التي يتم وضع فيلم البارافين. إضافة قطرات (30 ميكرولتر ل22 مم غطاء) من بولي-L-ليسين-الكسب غير المشروع-البولي إيثيلين جلايكول (PLL-g-PEG) (0.1 ملغم / مل، 10 mM HEPES، درجة الHH = 7.4) وأغطية مكان مع السطح المنشط عليها. أغلق الغرفة الرطبة مع غطاء علوي واحتضان لمدة ساعة.
    4. غسل يغطي 2X في برنامج تلفزيوني و 1x في الماء المقطر والسماح لهم الجافة.
    5. غسل الزهة الضوئية الكوارتز بالماء المقطر ومن ثم مع الإيثانول أو البربانول. جفف قناع ضوئي مع تدفق الهواء المصفى.
      ملاحظة: يتم تغليف قناع الكوارتز الضوئي على جانب واحد مع الكروم المضاد للريف الذي يحتوي على ثقوب في شكل ميكروباتين. ويستخدم في هذا البروتوكول قناع ضوئي يحتوي على مصغرة على شكل حلقة من 37 ميكرومتر. عندما يتم لمعان الأشعة فوق البنفسجية العميقة على قناع ضوئي، يمكن أن يمر الضوء فقط من خلال هذه الثقوب12.
    6. يعرض قناع ضوئي (الجانب المغلف بالكروم) للأشعة فوق البنفسجية العميقة لمدة 5 دقائق لتنظيف السطح.
    7. أضف قطرات ماء صغيرة (10 ميكرولتر لأغطية 20 مم) على الجانب المغلف بالكروم من قناع الفوتو. ضع الغطاء مع الجانب PLL-g-PEG المعالج على القطرة وجفف الماء الإضافي. تأكد من عدم وجود فقاعات الهواء بين قناع وأغطية.
      ملاحظة: قوة الشعيرات الدموية للماء سوف تُشل الغطاءات.
    8. تعريض قناع ضوئي للأشعة فوق البنفسجية العميقة لمدة 5 دقائق مع الجانب غير المغلفة بالكروم حتى (يتم إرفاق الأغطية على السطح السفلي).
      ملاحظة: يمكن للضوء أن يمر فقط من خلال الثقوب وتعديل سطح PLL-g-PEG-المعالجة من الأغطية تحت قناع ضوئي.
    9. إزالة الأغطية من قناع ضوئي عن طريق إضافة المياه الزائدة.
      ملاحظة: يجب أن تعويم الأغطية بسرعة إيقاف.
    10. احتضان الأغطية في محلول من بروتينات المصفوفة خارج الخلية (50 ميكروغرام/مل من الليفية، 5 ميكروغرام/مل من الفيبرينوجين الفلوري المخفف في الماء) على فيلم البارافين في غرفة رطبة (كما هو الحال في الخطوة 1.2.3) لـ 1 ح تحت غطاء تدفق لامين لتجنب التلوث.
      ملاحظة: يمكن إيقاف التجربة مؤقتًا عند هذه النقطة عن طريق تخزين الأغطية في PBS عند 4 درجة مئوية.
  3. بذر الخلايا على الأسطح الصغيرة
    1. استخدم حامل غطاء مغناطيسي يناسب حجم الأغطية الصغيرة لتركيب الأغطية. في يوم الاستحواذ، سخني حامل الغطاء إلى 37 درجة مئوية لتجنب الصدمة الحرارية للخلايا خلال الخطوات اللاحقة.
    2. إعداد نمط المتوسطة من خلال المكمل DMEM /F12 المتوسطة مع 20 M هيبس و 2٪ من البنسلين / ستريبتوميسين.
    3. مكان يغطي في حامل مع الجانب micropatterned حتى وإضافة نمط المتوسطة بمجرد أن غطاء هو على قاعدة حامل. إضافة الختم وشل مع الجهاز المغناطيسي. املأ حامل الغطاء بمتوسط النقش وأقفله بالغطاء الزجاجي.
      ملاحظة: كن سريعًا، لعدم السماح لأغطية الأغطية بالجفاف. لا تغسل حامل الغطاء بالإيثانول بين التجارب، لأن الختم قد يحتفظ ببعض الإيثانول، الذي يمكن أن يتفاعل مع PLL-g-PEG ويؤدي إلى إجهاد الخلية. اغسل حامل الغطاء بالماء الصابون فقط. وعلاوة على ذلك، يمكن أن تكون محتضنة في المفصل في نمط المتوسطة في 37 درجة مئوية ل 1 ساعة لتخفيف المنتج المتبقية.
    4. جمع الخلايا المتحولة hTERT-RPE1 عن طريق التربسيني (0.5 مل لواحد 12 لوحة جيدا) وإضافة 1 مل من 10٪ FBS DMEM/F12 المتوسطة.
    5. إضافة 0.5 × 106 transtert- RPE1 الخلايا إلى حامل الغطاء وإعادة غلقه. احتضان لمدة 10 دقيقة في الحاضنة.
    6. اغسل حامل الغطاء 5x مع نمط متوسط لإزالة الخلايا غير المرتبطة وFBS المتبقية عن طريق إضافة متوسطة النمط مع ماصة واحدة وpirating المتوسطة مع ماصة أخرى لخلق تدفق الغسيل. دائماً الاحتفاظ بحجم صغير من نمط المتوسطة في حامل الغطاء لتجنب تجفيف الخلايا على الأغطية micropatterned، الأمر الذي سيؤدي إلى موت الخلية.
    7. احتضان في الحاضنة لمدة 3 ساعة للسماح بتنتشر الخلية الكاملة.

2- الحصول على بيانات الطاردات

  1. تصوير أحداث التناضح
    1. وضع حامل الغطاء تحت TIRM. يجب اكتشاف الإشارة بواسطة كاميرا حساسة تم إعدادها باستخدام أفضل تنسيق تصوير متاح.
      ملاحظة: في هذه التجربة، تم استخدام هدف عدسة 100x وكاميرا EMCCD مع منطقة كشف 512 × 512 بكسل مما أدى إلى حجم بكسل من 160 نانومتر.
    2. البحث عن خلية تعبر عن VAMP7-pHluorin التي تنتشر بشكل كامل(الشكل 1A).
      ملاحظة: الخلايا التي تعبر عن VAMP7 قابلة للتعرف بوضوح، لأنها تظهر إشارة خضراء.
    3. تغيير زاوية الليزر حتى يتم الوصول إلى زاوية TIRF التي تسمح بالتصور من أحداث إكسوسيتوزيت VAMP7-pHluorin. إجراء عملية شراء 5 دقائق في تردد متوافق مع معدل القذف ومقياس الوقت (عادة 3 هرتز، الشكل 1D)باستخدام برنامج المجهر.
      ملاحظة: خلايا hTERT-RPE1 لديها معدل إفرازية lysosomal حوالي 0.3 هرتز على micropatterns. lysosomal exocytosis له مدة نموذجية من 1 s. ويتميز بكثافة الذروة تليها تسوس أسي. وينبغي أن يكون انتشار المسبار واضحا في هذا الوقت (الشكل 1B، C).
    4. لكل خلية، وأيضا إجراء عملية اقتناء micropattern باستخدام برنامج المجهر (الشكل 1A).
  2. اكتساب إحداثيات الإزداز
    1. افتح الفيلم المكتسب مع ImageJ/ FIJI. استخدام الملف | استيراد | تسلسل الصورة. العثور على أحداث التناضح عن طريق العين. يتميز حدث الزخرفة بظهور إشارة ساطعة تنتشر إلى الخارج (الشكل 1).
    2. استخدام أداة نقطة لوضع علامة على مركز الحدث exocytic. استخدام تحليل | قياس لقياس إحداثيات س و ص، وكذلك الإحداثيات الزمنية (رقم الشريحة). تنفيذ هذه القياسات لجميع الأحداث exocytosis من الفيلم.
    3. حفظ النتائج (النتائج | ملف | حفظ باسم). إعداد ملف نصي لكل خلية تحليلية تسمى "نتائج(cell_name).txt" الذي يحتوي على شريحة إحداثيات X و Y إحداثيات لكافة أحداث exocytosis في هذا الترتيب.

      من المفترض أن يبدو الملف النصي كما يلي:
      ID X Y فيريت قطر نصف قطرها
      RPE1_WT_Cell1 167 136 230 115
      RPE1_WT_Cell2 164 160 230 115

      ملاحظة: كن حذراً لاستبدال كافة الفواصل مع نقاط.
    4. قياس مركز وقطر كل خلية باستخدام"أداة البيضاوي". تناسب دائرة مثالية (لا تستخدم البيضاوي) واستخدام "قياس" للحصول على إحداثيات س و ص وقطر فيريت. حفظ هوية كل خلية (معرف) و إحداثيات X و Y قطر فيريت و radius (قطر/2) في ملف نصي يسمى "المعلمة الكروية.txt".

      من المفترض أن يبدو الملف النصي كما يلي:
      ID X Y فيريت قطر نصف قطرها
      RPE1_WT_Cell1 167 136 230 115
      RPE1_WT_Cell2 164 160 230 115

      ملاحظة: كن حذراً لاستبدال كافة الفواصل مع نقاط.
    5. قياس سمك حلقة micropattern (طول التصاق) مع أداة مستقيمة وحفظ معرف الخلية، نصف قطر الخلية (من الملف: "المعلمات الكروية.txt")، وطول التصاق في ملف نصي يسمى "نمط parameter.txt". حساب طول التصاق تطبيع بتقسيم طول التصاق على نصف قطر الخلية.
      ملاحظة: كن حذراً لاستبدال كافة الفواصل بالنقاط.

      يجب أن تبدو الملف كما يلي:
      طول التصاق نصف قطرها خلية ID طول التصاق تطبيع
      RPE1_WT_Cell1 115 34 0.295652174
      RPE1_WT_Cell2 115 35 0.304347826

3. خلية واحدة التحليل المكاني

  1. R حزمة وتركيب
    ملاحظة: حزمة R لهذا التحليل يستفيد من حزمةSpatstat 13 لحساب الكثافة ثنائي الأبعاد (2D) ووظيفة K ريبلي. التعليمات البرمجية مفتوحة المصدر وتستخدم ملفات نصية تم وصفها مسبقاً.
    1. تحميل وتثبيت R من https://www.r-project.org/ (الإصدار 3.5.2 تم استخدامه في هذا التحليل).
    2. تحميل الحزمة (ومجموعة البيانات التجريبية) من: https://github.com/GoudTeam/JoVE-paper
    3. تثبيت الحزمة على R Studio باستخدام "أدوات" باستخدام "تثبيت الحزم". حدد "ملف أرشيف الحزمة (.zip; .tar.gz)" للفئة "تثبيت من:" واختيار ملف الحزمة. اضغط على "تثبيت".
    4. تحميل الحزمة مع وظيفة "مكتبة ("ExocytosisSpatialال" "عن طريق كتابة هذا الأمر في الاستوديو R والضغط على "أدخل".
    5. تشغيل الحزمة مع وظيفة "ESA()" عن طريق كتابة هذا الأمر في استوديو R والضغط على "أدخل".
      ملاحظة: سيتم فتح واجهة مستخدم.
    6. حدد الدليل لمجموعة البيانات (ملفات.txt) ودليل لـ يرسم الإخراج.
      ملاحظة: يمكن تغيير معلمات التحليل (انظر النص أدناه) من خلال واجهة مستخدم.
    7. سيقوم هذا البرنامج النصي تلقائياً بدء تنفيذ التحليل. ويوفر ملفات .pdf من المؤامرات المقابلة وملفات .txt التي تحتوي على نتائج رقمية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

تم تحليل الخصائص الزقة من أحداث القذف من lysosomes التي تصورها VAMP7-pHluorin10,11 في خلايا hTert-RPE1. خلايا hTert-RPE1 هي خلايا غير مُنقلة تعتمد بشكل جيد على الميكروتيناتينغ وقد استخدمت على نطاق واسع في الدراسات السابقة المستندة إلى ميكروباتترن4،14. VAMP7 هو lysosomal v-SNARE15 التي تم وضع علامة مع pHluorin super ecliptic في ه N-terminus ويقع في تجويف من الليسوسوم. داخل الخلية، تم إخماد مسبار pHluorin من قبل انخفاض نسبة الH من الليسوسوم، ولكن خلال القذف pHluorin بدأت تنبعث منها إشارة لأن زيادة معدل الوفيات بسبب إطلاق البروتون. تم رصد VAMP7-pHluorin من قبل TIRFM التصوير الخلية الحية على شكل حلقة micropatterns (الشكل 1A–B). أظهرت إشارة pHluorin ذروة أثناء الاستئصال العصبي الذي يمثل الإطلاق السريع للبروتونات الليفية متبوعاً بانحلال أسي، وهو ما يمثل الانتشار الثاني للمسبار عند غشاء البلازما(الشكل 1C). hTERT-RPE1 قدمت الخلايا نشاط إفراز lysosomal الهامة مع متوسط معدل إفرازات من 0.28 هرتز(الشكل 1D). ومع ذلك، لوحظ عدم تجانس عالية في معدل الطاردات عبر الخلايا (الانحراف المعياري 0.15 هرتز)، مما يشير إلى أن هناك تباين قوي من خلية إلى خلية في إفرازات من الليسوسومات.

تحليل مكاني وحيد الخلية للتحقيق في ما إذا كان الزّراب من الليسوسومات عشوائيّة
كان من الممكن تصور التوزيع 2D من الزخرف من قبل KDE، كما أجريت سابقا للمقصورة بطانة الرحم14، والتي يمكن أن تكشف عن الاختلافات في الكثافة المحلية (الشكل 2B). وهذا النهج وثيق الصلة بالتصور عن متوسط توزيع مجموعة من الخلايا، ولكنه أقل إفادة في الخلايا المفردة نظرا للعدد المحدود من الأحداث المكتشفة (عشرات مقابل آلاف عديدة تم الحصول عليها من التحليل القائم على السكان) والتباين العالي بين الخلايا. على سبيل المثال، لم يسمح لنا هذا النهج بتقييم ما إذا كان توزيع أحداث القذف قد اتبع سلوكًا كاملًا لـ randomness مكاني (CSR) (أي، يتوافق مع توزيع نقطة موحدة في منطقة مُراقبة لخلية واحدة). نمط النقاط يتبع سلوك المسؤولية الاجتماعية للشركات عندما تكون الفرضيتان التاليتان صحيحتين: 1) موقع كل نقطة مستقل عن موقع النقاط الأخرى؛ 1) موقع كل نقطة مستقل عن موقع النقاط الأخرى؛ 1) موقع كل نقطة مستقلة عن تلك النقاط الأخرى; و 2) إن احتمال العثور على نقطة في منطقة دون إقليمية يعتمد فقط على النسبة بين منطقة هذه المنطقة الفرعية والمنطقة الكلية. وهناك ثلاثة انحرافات محتملة عن المسؤولية الاجتماعية للشركات: 1) التجميع (أي التجميع)؛ (2) تجميع البيانات (مثل التجميع)؛ (2) تجميع البيانات (مثل التجميع)؛ (2) تجميع البيانات (مثل التجميع)؛ (2) تجميع البيانات (1)؛ (3) تجميع البيانات (أي التجميع 2) التشتت (أي، يأمر مع مسافة ثابتة)؛ أو 3) مزيج من التجمع والتشتت (الشكل 2C). تم استخدام وظيفة ريبلي K للإجابة على هذا السؤال كما هو الحال في التحليلات السابقة7،8،9 ( الشكل2D). وظيفة ريبلي K قريبة من πr² (مع d يجري المسافة تطبيع من حدث) في حالة المسؤولية الاجتماعية للشركات، ولكن متفوقة (أدنى الجهاز التنفسي) إلى πr² في حالة التجمع (تشتت الجهاز التنفسي). عن طريق طرح πr² من وظيفة ريبلي K، ينبغي أن يكون منحنى المسؤولية الاجتماعية للشركات النظرية في 0. تم إجراء محاكاة لحالات المسؤولية الاجتماعية للشركات باستخدام نفس عدد النقاط مثل أحداث القذف الملاحظة لتقييم حسن الملاءمة لحالة المسؤولية الاجتماعية للشركات (المغلف الرمادي حول المنحنى النظري). دالة ريبلي K المحولة المطبقة على البيانات التجريبية أظهرت قيمًا إيجابية خارج المغلف ، مما يشير إلى التجميع (الشكل 2D).

للتحقيق في حالة تجميع أحداث القذف كان بسبب التصاق الخلية كما ذكر سابقا6، قمنا بإجراء تحليل مماثل على البيانات من منطقة الخلايا غير التصاقية حصرا في المركز (الشكل 2A، منطقة لاصقة في الرمادي ، منطقة مركز الخلايا غير التصّاق في الأبيض). ملاحظة, وجدنا أن أحداث التناضح في منطقة غير التصيف أيضا مجمعة(الشكل 2E),مشيرا إلى أن جزيئات الالتصاق لم تكن الهياكل الوحيدة التي تسبب في البقع الساخنة إفرازية في أغشية البلازما.

لأن وظيفة ريبلي K هي إحصائية وصفية لا توفر قيمة P ، تم إعداد اختبار إحصائي مقارنة أحداث الزفير الخلوي مع محاكاة المسؤولية الاجتماعية للشركات. تم استخدام أقرب مسافة الجوار NND(i) الأسلوب. يتم تعريف NDD كمسافة أقل قدرها إقليديان بين نقطة i وجميع النقاط الأخرى. تم حساب متوسط NND (i) من جميع الأحداث exocytic من خلية واحدة ومقارنتها مع المسؤولية الاجتماعية للشركات التي تم الحصول عليها مع عدد كبير من المحاكاة مونتي كارلو(الشكل 2F). وجدنا أن متوسط NND من الخلية المفردة التي تم تحليلها في الشكل 2F كان أقل من متوسط التوزيع المحاك لحالة CSR ، مما يشير إلى أقرب الجيران في المتوسط وبالتالي التجمع. في حالة التشتت، كان من المتوقع أن تكون قيمة أعلى بالنسبة إلى NND المتوسط(الشكل 2C). سمحت هذه المقارنة بحساب قيمة P لكل خلية. تمثل قيمة P النسبة المئوية للمحاكاة التي أظهرت NND أكثر تطرفاً (بطريقة ذات وجهين). على وجه الدقة، تم حساب قيمة P غير متحيزة على النحو (ك +1)/(N +1) مع N هو العدد الإجمالي للمحاكاة مونتي كارلو (10،000)، و k عدد هذه المحاكاة التي كانت أكثر تطرفا من measurentالملاحظة 16. تم رسم الرسم البياني لكافة قيم P لمنطقة الخلية الإجمالية (الشكل 2G) ومنطقة الخلية غير التصّاد(الشكل 2I). إذا كان H0: "إكسوسيتسيس هو عملية المسؤولية الاجتماعية للشركات" كان صحيحاً, كان من المتوقع توزيع موحد من قيم P. إذا كان H0 كاذبة، كان من المتوقع ذروة في قيمة P منخفضة. تنفيذ اختبار Kolmogorov-سميرنوف على الرسم البياني قيمة ف، تم الحصول على قيمة P أدنى من 0.001، مما يدل على انحراف كبير من المسؤولية الاجتماعية للشركات في كلتا الحالتين(الشكلين 2G و 2I). وعلاوة على ذلك، يشير معامل تجميع 0.955 لمنطقة الخلية الكلية و1.000 لمنطقة الخلايا غير الالتصاقية إلى أن التناضح الليفي الليسوسيومي كان عملية متفاوتة المسافات مستقلة عن التصاق الخلايا. يمثل معامل التكتل النسبة المئوية للخلايا التي كانت أقرب إلى سلوك المسافات من التشتت. وكانت هذه النتيجة متسقة مع وظيفة كي ريبلي.

لتقييم دور التصاق الخلية في التجمع، قارنا متوسط NND في المنطقة غير الالتصاقية مع أن في المنطقة الشاملة لكل خلية على حدة(الشكل 2H). ولأن متوسط NND كان متناسباً عكسياً مع كثافة السطح، قمنا بطيّل متوسط NND للمنطقة غير الالتصاقية باستخدام الالتجانس. متوسط أكبر بكثير NND من أحداث التناضح في المنطقة غير الالتصاقية وأشار أقل التجمعات (الشكل 2H). وهكذا، على الرغم من إفراز من مجموعات lysosomes في المناطق غير الالتصاق، الالتصاق الخلية يبدو لتعزيز التجمع.

التحليل المكاني لأحداث التناضح العكسي باستخدام الإحداثيات القطبية
سمحت الهندسة الدائرية للميكرباتترن الدائرية باستخدام الإحداثيات القطبية المشتركة ، والتي ابسطت التحليلات ، كما سبق أن وجدت17. ويمكن بالتالي وصف كل حدث من أحداث الزخرفة بواسطة معامل (المسافة من الأصل ، هنا مركز الطائرة السفلية للخلية) وزاوية (وفقًا لمحور تعسفي ثابت). بالإضافة إلى ذلك، يمكن تطبيع المعامل بتقسيمه على نصف قطر الخلية. تم رسم الرسم البياني لأحداث الإزدلاع العكسي وفقاً لم ومعامل الخلية التمثيلية (الشكل 3A). وكشف هذا عن ذروة حول الحدود بين المناطق اللاصقة/غير التصّادية. ولوحظ أيضاً تباين كبير بين الخلايا. ولذلك، نحن تجمع ن = 22 الخلايا للحصول على متوسط توزيع الأحداث exocytosis. ومع ذلك، من أجل إعطاء نفس الوزن الإحصائي لكل خلية، تم اختيار نفس العدد من الأحداث من كل خلية بشكل عشوائي. ولم يغير هذا الاختيار العشوائي الأنماط العامة التي شوهدت. للحصول على متوسط توزيع مستمر للتوزيع الفردي للخلايا الفردية، تم استخدام KDE(الشكل 3B). ومع ذلك، لأن معامل تطبيع بين 0 و 1، كان لا بد من وضع شروط حافة في الاعتبار. تم استخدام نواة بيتا التي تغير شكل بجوار الحواف18. تم حساب نطاق خطأ مع استراتيجية bootstrap. وتمت مقارنة متوسط التوزيع الملحوظ بتوزيع افتراضي للمسؤولية الاجتماعية للشركات أظهر المزيد من الأحداث في معامل أعلى، لأن المنطقة زادت مع معامل أعلى. لأن التكامل من كثافة الاحتمال يجب أن يكون واحداً، توزيع CSR كان 2r (مع هي نصف قطر تطبيع، بدون وحدات). تم حساب نطاق الثقة حول المنحنى النظري باستخدام عدد كبير من محاكاة مونتي كارلو CSR (5000 لكل من). تم رسمالمئين 1 و 99 من توزيع المعامل من هذه المحاكاة. وجدنا أن متوسط توزيع الأحداث exocytosis انحرفت عن واحدة افتراضية في 0.7rكحد أقصى، والذي يتوافق مع بداية المنطقة اللاصقة من الخلية.

وسعينا إلى اختبار ما إذا كان التوزيع الملحوظ للمعيار مختلفا عن التوزيع النظري. لأن متوسط التوزيعات، كما هو الحال في هذه الحالة، لا يمكن اختباره بدقة عن طريق اختبار حسن الملاءمة (مثل Kolmogorov-Smirnov) تم استخدام طريقة بديلة اقترحها بيكو وآخرون. هذه الطريقة تقيس الفرق بين الاختلاف بين السكان والاختلاف داخل مجموعة، وبالتالي يسمح بإجراء اختبار مستقل لكل إحداثيات (أي معامل وزاوية)17. تم استخدام هذا الاختبار لمقارنة بياناتنا ببيانات محاكاة تمثل أحداث اكزوتيسيس المسؤولية الاجتماعية للشركات (نفس عدد الخلايا وأحداث الإزواسيس مثل البيانات الملاحظة) ، ووجد اختلافًا مهمًا إحصائيًا في الاختلافات (p < 0.001 مع اختبار Wilcoxon-Mann-Whitney ، n = 22 خلية) ، مما يشير إلى أن متوسط توزيع الاستئصالات الناشئة لم يكن مسؤولية المسؤولية الاجتماعية. ومع ذلك، عندما تم مقارنة اثنين من المحاكاة المسؤولية الاجتماعية للشركات (مع 5000 محاكاة لكل منهما)، وجدنا أن الرسم البياني قيمة P لم تظهر توزيع موحد، ولكن أظهرت ذروة قرب 1، مما يشير إلى أن هذا الاختبار ربما تفتقر إلى حساسية.

لأن تقدير KDE يعتمد على اختيار غير تافهة من عرض النطاق الترددي نواة وحساسة لآثار حافة، كما تم حساب وظيفة التوزيع التراكمي، الذي يتغلب على المشاكل الكامنة في تقدير KDE(الشكل 3D). هذه الوظيفة معرفة بين 0 و 1 ولا تحتوي على أي معلمات أو تحيزات اعتباطية (على سبيل المثال، تحيزات الحافة). وقد حسبت نطاقات الخطأ والثقة بنفس الطريقة التي تم بها حساب توزيع المعامل. وأكدت وظيفة التوزيع التراكمي أن أحداث الإزلاج لم تتبع توزيع المسؤولية الاجتماعية للشركات ولكن تم التركيز عليها بشكل مفرط في moduli حول 0.7rالحد الأقصى. وهكذا أتاح لنا هذا التحليل تحديد المناطق الخلوية التي حدث فيها التجميع. سؤال مثير للاهتمام أن هذه النتيجة يثير هو ما إذا كان التركيز المفرط في 0.7rالحد الأقصى بسبب وجود مناطق لاصقة / غير التصيف من micropattern على شكل حلقة أو تأثير المناطق الطرفية / الإفراز المركزي من الخلايا.

كما انحرف متوسط توزيع الأحداث exocytosis من حالة المسؤولية الاجتماعية للشركات في المناطق غير الالتصاقية وكذلك لاصقة، وتساءلنا أيضا أين كانت كثافة التناضحات العليا أعلى. تم حساب وكثافات السطح من الزخرفة في مناطق الالتصاق وعدم الالتصاق ومقارنتها. وجدنا أن كثافة السطح كانت أقل في منطقة الالتصاق مما كانت عليه في منطقة عدم الالتصاق من خلال تحليل مقترن(الشكل 3C). ويمكن تفسير ذلك من خلال الانخفاض القوي في الإكسوسيتوزي في محيط الخلية (0.85 – 1rكحد أقصى، الشكل 3B).

Figure 1
الشكل 1- الـ 1 Exocytosis من lysosomes في خلايا hTert-RPE1: (أ)على شكل حلقة micropattern (الأحمر) واللصق hTert-RPE1 خلية المصابين VAMP7-pHluorin (الأخضر) صورة من قبل TIRFM. يظهر السهم حدث التناضح. أشرطة المقياس = 10 ميكرومتر (ب) كيموغراف أحداث الزخراب. الأسهم تظهر أحداث التناضح. شريط مقياس = 2 ميكرومتر، شريط مقياس في الوقت = 5 s. (C) تطبيع كثافة الملف الشخصي من lysosomal exocytosis من 22 الخلايا. كل نقطة هو في المتوسط ما لا يقل عن 1530 أحداث التناضح. يتم تقديم البيانات ± SEM.(د) معدل الطاردات من الخلايا 22. يتم رسم متوسط +/- الانحراف المعياري باللون الأحمر. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2- الانبعاثات 2 من 100 التحليل المكاني لأحداث الزفير الليفي. (أ) مؤامرة مبعثر من أحداث القذف خلال 5 دقائق اقتناء. كل نقطة تمثل حدث واحد من حالات الزخراب. تظهر منطقة لاصقة باللون الرمادي. (B) 2D نواة تقدير الكثافة (كدي) من مؤامرة مبعثر من A. اللون يمثل الكثافة المحلية لأحداث الزخراب. (C) تمثيل تخطيطي لنمط النقاط المحتملة. وتظهر الحالات الأربعة، "العشوائية المكانية الكاملة" (CSR)، والتجمع، والتشتت، والمختلطة، ويتم رسم عدة مسافات قريبة من الجيران (NND) (خطوط متقطعة) لإظهار كيف انخفض متوسط NND في التجمعات وزيادة مع التشتت. (د)تحليل خلية تمثيلية واحدة باستخدام وظيفة ريبلي K. خط أحمر متقطع يساوي "ريبلي K وظيفة - πr²" لأحداث المسؤولية الاجتماعية للشركات ، والمغلف الرمادي يمثل قيمة الخير المقدرة من صالح من مونتي كارلو المحاكاة مع نفس عدد من النقاط كما exocyt الأحداث(N الحدث = 81). الخط الأسود الصلب يساوي "وظيفة ريبلي K - πr²" لأحداث الاكسوسياتس الملاحظة(N event = 81). انحرافه الإيجابي من المنحنى الأحمر من المغلف الرمادي يشير إلى تجميع أحداث الزخرفة. تمت تسوية دالة ك ريبلي لتكون قيمتها القصوى 1. (E) تحليل المنطقة غير التصاقية من نفس الخلية باستخدام وظيفة K ريبلي كما هو الحال في D. يشير الانحراف الإيجابي من المنحنى الأحمر خارج المغلف الرمادي إلى تجميع أحداث القذف في المنطقة غير الالتصاقية. (F) مقارنة متوسط توزيع NND من خلية تمثيلية واحدة (الخط الأحمر) مع KDE من CSR التي تم الحصول عليها من مونت كارلو المحاكاة (منحنى أزرق). تم حساب قيمة P كنسبة مئوية من القيم المحاكاة التي كانت أكثر تطرفاً من القيمة الملاحظة. (G) P قيمة الرسم البياني الذي تم الحصول عليه من اختبار NND كما هو الحال في F لـ n = 26 خلية. الذروة في قيم P منخفضة يعني أن فرضية فارغة "exocytosis يتبع المسؤولية الاجتماعية للشركات" تم رفض مع اختبار Kolmogorov-سميرنوف، مما يشير إلى أن اضحاض ليسوسومومي لم يكن CSR. (H) مربع مؤامرة من متوسط NND من الأحداث exocytosis في المناطق غير الالتصادية (أبيض) والمناطق الخلية الإجمالية (الرمادي). يتم ربط نقطتي البيانات من نفس الخلية بواسطة سطر. وكان متوسط NND أكبر في المنطقة غير التصيفة، p < 0.001 مع اختبار ويلكوكسيون المقترن (ن = 25 خلية)، مما يشير إلى أقل بكثير التجمع في المنطقة غير الالتصاقية. (I) نفس G للمنطقة غير التصّاقية لـ n = 26 خلية. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3- الانبعاثات 100-11 التحليل المكاني للأحداث الإزتلالية الليفية المجمعة: (A) الرسم البياني للأحداث exocytosis من خلية تمثيلية واحدة خلال اكتساب 5 دقائق مع ن = 161 أحداث الزخرفة كدالة من المعامل تطبيع; 0 يمثل مركز الخلية و 1 محيط الخلية. تظهر المنطقة اللاصقة للخلية باللون الرمادي وتتوافق مع معامل من 0.65-1 للخلايا المعروضة. هناك ذروة في بداية منطقة لاصقة حول مودولي بين 0.6 و 0.7. (B) KDE أحداث الداء الطارد كدالة لم ومعامل تطبيع لn = 22 خلايا مع 56 الأحداث في كل خلية؛ 0 يمثل مركز الخلية و 1 محيط الخلية. ويظهر متوسط منطقة لاصقة باللون الرمادي ويتوافق في المتوسط إلى مودولي من 0.61-1. المنحنى الأزرق المتقطع هو المنحنى النظري المتوقع في حالة CSR. ويرافق هذا المنحنى النظري مغلف يمثل المئين 1-99 من المسؤولية الاجتماعية للشركات التي تم الحصول عليها باستخدام محاكاة مونتي كارلو. منحنى KDE من البيانات الملاحظة باللون الأحمر ومصحوب بفرقة خطأ يتم إنشاؤها بواسطة bootstrapping. منطقة لاصقة في الرمادي +/ - SEM.(C)تحليل الاقتران من الكثافات السطحية في مناطق التصاق وعدم الالتصاق. تم حساب كثافة سطح الطاردات كـ عدد الأحداث لكل منطقة طبيعية وفي الثانية. هنا، *p < 0.05 من اختبار t-student المقترن (n = 22 خلية). وقد سبق اختبار الوضع الطبيعي من قبل اختبار شابيرو ويلك. (د)دالة التوزيع التراكمي للبيانات في B (الخط الأحمر) ومن محاكاة المسؤولية الاجتماعية للشركات مونتي كارلو (الخط الأزرق المنقط). تم إنشاء المغلفات كما في B. لاحظ أن الخط الأحمر ينحرف عن المسؤولية الاجتماعية النظرية عند حوالي 0.7rكحد أقصى. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

رصدنا أحداث الزخراب من المقصورة الليسوسومية من قبل TIRFM تصوير الخلايا الحية من VAMP7-pHluorin في خلايا ميكروباتترن على شكل حلقة وأجرى تحليلا إحصائيا دقيقا للبارامترات المكانية لأحداث الزبيب. توظيف وظيفة K ريبلي تحولت واختبار إحصائي على أساس أقرب مسافة الجار، وأكدنا أن إفراز من lysosomes ليست عملية عشوائية8،9. وأظهرت كل من التحليلات الإحصائية بشكل مقنع أن أحداث إكسوسيتوزيه تظهر التجمعات (أرقام 2D و 2G). تطبيق أدوات مماثلة لمنطقة الخلايا غير التصّاد، وجدنا أن أحداث التناضح تُتجمع أيضاً في مناطق غير مُلتَهَزية(الشكلان 2E و 2I). وهكذا، فإن جزيئات الالتصاق التي تم الإبلاغ عنها سابقا للسماح بتجميع6 ليست هي الهياكل الوحيدة التي يمكن أن تحفز النقاط الساخنة في البلازما. ومع ذلك، تعزيز التصاق الخلية التجمع: متوسط أقرب مسافة الجار بين أحداث التناضح كانت أكبر بكثير في المناطق غير التصّاد(الشكل 2H). على نحو متسق، حدد تحليلنا القائم على تقدير كثافة النواة ووظيفة التوزيع التراكمي المناطق المخصبة من الزبيبات التي كانت موجودة على الحدود بين المناطق اللاصقة وغير التصّاد في خلايا ميكروباتين على شكل حلقة. ومن الضروري القيام بمزيد من العمل لتحديد الآليات الجزيئية التي تقوم عليها التكتلات، مثل الالتصاق أو استهداف محدد للليسوسومات في هذه المنطقة. ومن المثير للاهتمام، لاحظنا عدم تجانس عالية في معدل القذف عبر خلايا hTERT-RPE1 (الانحراف المعياري من 0.15 هرتز لمعدل إفرازات متوسط 0.28 هرتز، الشكل 1D)، مما يشير إلى أن إفرازات من lysosomes لها تباين عال بين الخلايا. ولذلك، ينبغي النظر في تحليلات السكان الفرعية في الأعمال المقبلة. سيكون من المثير للاهتمام بشكل خاص التحقيق إذا كان هذا الاختلاف يعكس تنوع المقصورات الليفية ، والاختلافات في الشحنات ، أو الاعتماد على آلات الاكسوسيات.

وتوضح هذه النتائج كيف يمكن استخدام الأدوات الإحصائية لدراسة البارامترات المكانية للعمليات البيولوجية المتنوعة. وعلاوة على ذلك، تسهل الصغات الصغيرة دراسة تأثير التصاق الخلية بطريقة غير متحيزة بمساعدة هندسات مختلفة من نوع micropattern (على سبيل المثال، على شكل حلقة مقابل قرص مُشَكَّش). وعلى وجه الخصوص، فإن استخدام الأشكال المستديرة يسهل التحليلات لأنه يمكن استخدام الإحداثيات القطبية. لأن الأدوات الإحصائية تتطلب كمية معينة من البيانات لتكون ذات معنى، تم استخدام الخلايا مع أكثر من 30 الأحداث لتحليلنا. ومع ذلك، هناك احتمال أن الخلايا مع 30 أو أقل الأحداث ذات معنى. وهكذا، يمكن إجراء خلايا أخذ العينات التي تحتوي على 30 حدثاً أو أقل من أجل الحصول على أحداث كافية للتحليل لتحديد ما إذا كان هذا هو الحال. وبالمثل، من الصعب تقدير عدد الخلايا التي ينبغي تحليلها، خاصة إذا كان هناك تباين قوي بين الخلايا. إحدى الطرق للتحايل على هذا هو عشوائياً تحديد نفس العدد من الأحداث من كل خلية من أجل إعطاء نفس الوزن الإحصائي لكل خلية عند تجميعها. ومع ذلك، نوصي بإجراء تحليلات على أقل من 15 خلية مع الحيطة. وبما أن متوسط توزيع الخلايا المجمعة لا يمكن اختباره بدقة من خلال اختبارات حسن الملاءمة (مثل Kolmogorov-Smirnov) استخدمنا إحصائية اختبار اقترحها بيكو وآخرون تقيس الفرق في الاختلافات بين السكان17. على الرغم من أن هذا الاختبار سمح لنا بإيجاد فرق مهم إحصائياً في الاختلافات في متوسط التوزيعات، فإننا نشك في أن هذا الاختبار له حساسية منخفضة لأن الرسم البياني لقيمة P لم يكن مسطحًا (أي أظهر توزيعًا موحدًا) عند مقارنة محاكاة CSR مختلفة لقيم p قريبة من 1. ولذلك، قد تحتاج هذه الإجراءات الإحصائية إلى تحسين.

عيب واحد في تحليلاتنا هو الكشف اليدوي لأحداث الزّب، الذي يقلل بشكل كبير من سرعة التحليل. غالباً ما ترجع القيود في الكشف التلقائي إلى عدم تجانس قوي في المعلمة الفريدة والبسيطة التي يتم تحليلها (على سبيل المثال، شدة أحداث الزَّرِب الطاردة). يمكن أن تكون الشبكات العصبية قوية محتملة للكشف التلقائي ، لأنه يمكن تدريبها على التعرف على العديد من الميزات.

ويمكن تطبيق التحليل المقدم هنا على العمليات الديناميكية الأخرى التي لوحظت من قبل TIRFM، مثل إفراز من المقصورات الأخرى وتوزيع الغشاء microdomain أو عرض مستضد. ويمكن أيضاً تطبيق تحليلات مماثلة على الخلايا الثابتة من أجل دراسة التوزيع المكاني للبروتينات. ونأمل أن يعزز عملنا الاهتمام المتزايد بتحليل التوزيع المكاني في بيولوجيا الخلايا.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.

Acknowledgments

ونحن نعترف كثيرا تييري غالي (مركز الطب النفسي وعلم الأعصاب، INSERM) لتوفير VAMP7-pHluorin plasmid. نشكر تارن دوونغ على المشورة بشأن التحليل الإحصائي وأعضاء مختبر GOUD لإجراء مناقشات مثمرة. الكتاب الاعتراف كثيرا الخلية والأنسجة التصوير مرفق (PICT - IBiSA @Burg ، PICT - EM @Burg وPICT - IBiSA @Pasteur) ونيكون مركز التصوير ، معهد كوري (باريس) ، عضو في فرنسا الفرنسية الوطنية للبحوث البنية التحتية - BioImaging (ANR10 - INBS - 04). وقد تلقت هـ.ل. الدعم من رابطة ابحاث السرطان (ARC) وتلقت P.M. التمويل من برنامج الاتحاد الأوروبي للبحوث والابتكار في أفق 2020 بموجب اتفاقية منحة Marie Skłodowska-Curie No 666003. وقد تم دعم هذا العمل من خلال منح من INFECT-ERA (ANR-14-IFEC-0002-04)، وSlabex CelTisPhyBio (ANR-10-LBX-0038 ) وريديكس باريس للعلوم ولتريس (ANR-10-IDEX-0001-02 PSL)، وكذلك المركز الوطني لريشيرتشي ساينتفيك ومعهد كوري.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Chamlide Magnetic Chamber Chamlide
DMEM/F12 Gibco 21041-025
Fibrinogen Molecular Probes, Invitrogen F35200
Fibronectin bovine plasma Sigma F1141
HEPES (1M) Gibco 15630-056
hTert RPE1 cell line https://www.atcc.org
ImageJ http://rsbweb.nih.gov/ij/ n/a Authored by W. Rasband, NIH/NIMH
JetPRIME Transfection reagent Polyplus 114-07
Penicilin/Streptomycin Gibco 15140-122
Photomask Delta Mask
PLL-g-PEG solution Surface Solutions PLL(20)-g[3.5]- PEG(2)
R Software https://www.r-project.org/ n/a
Trypsin (TrypLE Express 1X) Gibco 12605-010
UV ozone oven Jelight Company Inc 342-220
VAMP7-pHFluorin plasmid n/a n/a Paper reference :http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Role+of+HRB+in+clathrin-dependent+endocytosis.
J Biol Chem. 2008 Dec 5;283(49):34365-73. doi: 10.1074/jbc.M804587200.
Role of HRB in clathrin-dependent endocytosis.
Chaineau M, Danglot L, Proux-Gillardeaux V, Galli T.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wu, L. -G., Hamid, E., Shin, W., Chiang, H. -C. Exocytosis and endocytosis: modes, functions, and coupling mechanisms. Annual Review of Physiology. 76, 301-331 (2014).
  2. Samie, M. A., Xu, H. Lysosomal exocytosis and lipid storage disorders. Journal of Lipid Research. 55, 995-1009 (2014).
  3. Neher, E., Marty, A. Discrete changes of cell membrane capacitance observed under conditions of enhanced secretion in bovine adrenal chromaffin cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 79, 6712-6716 (1982).
  4. Grossier, J. P., Xouri, G., Goud, B., Schauer, K. Cell adhesion defines the topology of endocytosis and signalling. The EMBO Journal. 33, 35-45 (2014).
  5. Fourriere, L., et al. RAB6 and microtubules restrict protein secretion to focal adhesions. Journal of Cell Biology. 218, 2215-2231 (2019).
  6. Wang, Y., McNiven, M. A. Invasive matrix degradation at focal adhesions occurs via protease recruitment by a FAK-p130Cas complex. Journal of Cell Biology. 196, 375-385 (2012).
  7. Lagache, T., Lang, G., Sauvonnet, N., Olivo-Marin, J. C. Analysis of the spatial organization of molecules with robust statistics. PLoS One. 12, 80914 (2013).
  8. Yuan, T., Lu, J., Zhang, J., Zhang, Y., Chen, L. Spatiotemporal Detection and Analysis of Exocytosis Reveal Fusion "Hotspots" Organized by the Cytoskeleton in Endocrine Cells. Biophysical Journal. 108, 251-260 (2015).
  9. Urbina, F. L., Gomez, S. M., Gupton, S. L. Spatiotemporal organization of exocytosis emerges during neuronal shape change. Journal of Cell Biology. 217, 1113-1128 (2018).
  10. Martinez-Arca, S., Alberts, P., Zahraoui, A., Louvard, D., Galli, T. Role of Tetanus Neurotoxin Insensitive Vesicle-Associated Membrane Protein (Ti-Vamp) in Vesicular Transport Mediating Neurite Outgrowth. Journal of Cell Biology. 149, 889-900 (2000).
  11. Alberts, P., et al. Cdc42 and Actin Control Polarized Expression of TI-VAMP Vesicles to Neuronal Growth Cones and Their Fusion with the Plasma Membrane. Molecular Biology of Cell. 17, 1194-1203 (2006).
  12. Azioune, A., Storch, M., Bornens, M., Théry, M., Piel, M. Simple and rapid process for single cell micro-patterning. Lab on a Chip. 9, 1640-1642 (2009).
  13. Baddeley, A., Rubak, E., Turner, R. Spatial point Patterns: Methodology and Applications with R. , CRC Press. Indianapolis, IN. (2015).
  14. Schauer, K., et al. Probabilistic density maps to study global endomembrane organization. Nature Methods. 7, 560-566 (2010).
  15. Advani, R. J., et al. Seven Novel Mammalian SNARE Proteins Localize to Distinct Membrane Compartments. Journal of Biological Chemistry. 273, 10317-10324 (1998).
  16. North, B. V., Curtis, D., Sham, P. C. A Note on the Calculation of Empirical P Values from Monte Carlo Procedures. American Journal of Human Genetics. 71, 439-441 (2002).
  17. Pecot, T., Zengzhen, L., Boulanger, J., Salamero, J., Kervrann, C. A quantitative approach for analyzing the spatio-temporal distribution of 3D intracellular events in fluorescence microscopy. eLife. 7, 32311 (2018).
  18. Chen, S. X. Beta kernel estimators for density functions. Computational Statistics & Data Analysis. 31, 131-145 (1999).

Tags

علم الأحياء، الإصدار 163، micropattern، ليسوسومات، إكسوسيتسيس، TIRFM، المسؤولية الاجتماعية، VAMP7
قياس المعلمات االوقائية من إكسوسيتسيس الخلوية في الخلايا micropatterned
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Lachuer, H., Mathur, P., Bleakley,… More

Lachuer, H., Mathur, P., Bleakley, K., Schauer, K. Quantifying Spatiotemporal Parameters of Cellular Exocytosis in Micropatterned Cells. J. Vis. Exp. (163), e60801, doi:10.3791/60801 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

PLAYLIST
Celebrating International Day of Women and Girls in Science

Biology
Chemistry
Engineering
Clinical Science

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter