Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

Identifikation af cellereceptorer ved hjælp af genome-skala CRISPR/Cas9 genetiske skærme

Published: June 6, 2020 doi: 10.3791/60803
Automatic Translation
1,2, 1
1Cell Surface Signalling Laboratory, Wellcome Trust Sanger Institute, 2EMBL-EBI, Wellcome Genome Campus

Summary

Dette manuskript beskriver en genom-skala celle-baseret screening tilgang til at identificere ekstracellulære receptor-ligand interaktioner.

Abstract

Intercellulære kommunikation medieret af direkte interaktioner mellem membran-indlejrede celleoverflade receptorer er afgørende for den normale udvikling og funktion af flercellede organismer. Detektering af disse interaktioner er dog fortsat teknisk udfordrende. Dette manuskript beskriver en systematisk genom-skala CRISPR/Cas9 knockout genetisk screening tilgang, der afslører cellulære veje, der kræves for specifikke celle overflade anerkendelse begivenheder. Denne analyse udnytter rekombinant proteiner produceret i et pattedyr protein ekspression system som ivrig bindende sonder til at identificere interaktion partnere i en celle-baseret genetisk skærm. Denne metode kan anvendes til at identificere de gener, der er nødvendige for celleoverfladeinteraktioner, der påvises ved rekombinant bindingssonder, der svarer til ektodomæner af membraninfæsterede receptorer. Det er vigtigt, i betragtning af genom-skala karakter af denne tilgang, det har også den fordel, at ikke kun identificere den direkte receptor, men også de cellulære komponenter, der er nødvendige for præsentationen af receptoren på celleoverfladen, hvilket giver værdifuld indsigt i biologi receptoren.

Introduction

Ekstracellulære interaktioner af celleoverflade receptor proteiner direkte vigtige biologiske processer såsom væv organisation, vært-patogen anerkendelse, og immun regulering. Undersøgelse af disse interaktioner er af interesse for det bredere biomedicinske samfund, fordi membranreceptorer er handlingsrettede mål for systematisk leverede terapeutiske såsom monoklonale antistoffer. På trods af deres betydning er det teknisk udfordrende at studere disse interaktioner. Dette skyldes hovedsageligt, at membran-indlejrede receptorer er amfipatiske, hvilket gør dem vanskelige at isolere fra biologiske membraner til biokemisk manipulation, og deres interaktioner er karakteriseret ved de svage interaktion tilhørsforhold(KDs i μM-mM rækkevidde)1. Derfor er mange almindeligt anvendte metoder uegnede til at påvise denne klasse af proteininteraktioner1,2.

En række metoder er blevet udviklet til specifikt at undersøge ekstracellulære receptor-ligand interaktioner, der tager deres unikke biokemiske egenskaber i betragtning3. En række af disse tilgange indebærer, at hele ectodomain af en receptor som et opløseligt rekombinant protein i pattedyr eller insektcellebaserede systemer for at sikre, at disse proteiner indeholder posttranslationelle ændringer, der er strukturelt vigtige, såsom glycaner og disulfidbindinger. For at overvinde den lave affinitet bindende, er ectodomains ofte oligomerized at øge deres bindende begærlighed. Avid proteinektodomæner er med succes blevet anvendt som bindende sonder til at identificere interaktionspartnere i direkte rekombinant proteinproteininteraktionsskærme4,5,6,7. Mens bredt vellykket, rekombinant protein-baserede metoder kræver, at ektodomæne af en membran receptor produceres som et opløseligt protein. Det gælder derfor kun generelt for proteiner, der indeholder en sammenhængende ekstracellulær region (f.eks. enkeltpastype I, type II eller GPI-forankret) og er generelt ikke egnet til receptorkomplekser og membranproteiner, der spænder over membranen flere gange.

Ekspressionskloningsteknikker, hvor et bibliotek med supplerende DNO'er (cDA'er) transficeres til celler og testes for en gain-of-binding fænotype er også blevet brugt til at identificere ekstracellulære protein-protein interaktioner8. Tilgængeligheden af store samlinger af klonede og sekvenserede cDNA-ekspressionsplasmider i de senere år har lettet metoder , hvor cellelinjer, der overekspressende cDNAs-kodningscellereceptorer, screenes for binding af rekombinant proteiner for at identificere interaktioner9,10. CDNA-overekspressionsbaserede tilgange giver i modsætning til rekombinant proteinbaserede metoder mulighed for at identificere interaktioner i forbindelse med plasmamembranen. Men succesen med at bruge cDNA udtryk konstruktioner afhænger af cellernes evne til at overudtryke proteinet i korrekt foldet form, men dette kræver ofte cellulære tilbehørsfaktorer såsom transportører, chaperoner og korrekt oligomerer forsamling. Transfecting en enkelt cDNA kan derfor ikke være nok til at opnå celleoverfladeudtryk.

Screeningsteknikker ved hjælp af cDNA-konstruktioner eller rekombinant proteinsonder er ressourcekrævende og kræver store samlinger af cDNA- eller rekombinant proteinbiblioteker. Specielt designet massespektrometri-baserede metoder er blevet brugt for nylig til at identificere ekstracellulære interaktioner, der ikke kræver samling af store biblioteker. Disse teknikker kræver imidlertid kemisk manipulation af celleoverfladen, som kan ændre den biokemiske karakter af de molekyler, der findes på cellernes overflade, og som i øjeblikket kun kan anvendes til interaktioner medieret af glycosylerede proteiner11,12. De fleste af de nuværende tilgængelige metoder også stærkt fokusere på samspillet mellem proteiner, mens stort set ignorerer bidraget fra membranen mikromiljø, herunder molekyler som glykaniner, lipider, og kolesterol.

Den seneste udvikling af højeffektiv bialleleic målretning ved hjælp af CRISPR-baserede tilgange har gjort det muligt genom-skala biblioteker af celler mangler definerede gener i en enkelt pulje, der kan screenes på en systematisk og upartisk måde at identificere cellulære komponenter, der er involveret i forskellige sammenhænge, herunder dissekering af cellesignaler, identifikation af forstyrrelser, der giver resistens over for lægemidler, toksiner og patogener, og bestemmelse af antistoffernesspecificitet 13,,14,15og16. Her beskriver vi en CRISPR-baseret knockoutcellescreeningsanalyse i genomskala, der giver et alternativ til de nuværende biokemiske tilgange til at identificere ekstracellulære receptor-ligandinteraktioner. Denne tilgang til at identificere interaktioner medieret af membran receptorer af genetiske skærme er særligt velegnet til forskere, der har en fokuseret interesse på de enkelte ligander, fordi det undgår behovet for at udarbejde store biblioteker af cDNAs eller rekombinant proteiner.

Denne analyse består af tre hovedtrin: 1) Meget ivrige rekombinant proteinbindingssonder bestående af ekstracellulære områder af en modtagende receptor produceres og anvendes i fluorescensbaserede flowcytometry-baserede bindende analyser; 2) De bindende analyser bruges til at identificere en cellelinje, der udtrykker interaktion partner rekombinant protein sonden; 3) Der produceres en Cas9-ekspresserende version af cellelinjen, der interagerer med det pågældende protein, og der udføres en genome-skala CRISPR/Cas9-baseret knockoutskærm (Figur 1). På denne genetiske skærm anvendes binding af et rekombinant protein til cellelinjer som en målbar fænotype, hvor celler i knockoutbiblioteket, der har mistet evnen til at binde sonden, sorteres ved hjælp af fluorescensbaseret aktiveret cellesortering (FACS) og de gener, der forårsagede tabet af den bindende fænotype, der identificeres ved sekvensering. I princippet identificeres de gener, der kodificerer den receptor, der er ansvarlig for bindingen af den ivrige sonde, og de gener, der kræves til dens celleoverfladedisplay.

Det første trin i denne protokol indebærer produktion af ivrige rekombinant proteinsonder, der repræsenterer ektodomænet for de membranbundne receptorer. Disse receptorer er kendt for ofte at bevare deres ekstracellulære bindingsfunktioner, når deres ektodomæner udtrykkes som et rekombinant opløseligt protein1. For et protein af interesse, opløselige rekombinant proteiner kan produceres i enhver egnet eukaryote protein ekspression system i ethvert format, forudsat at det kan oligomerized for øget bindende avidity, og det indeholder tags, der kan bruges i fluorescens-baserede flow cytometri-baserede bindende analyser (f.eks FLAG-tag, biotin-tag). Detaljerede protokoller for produktion af opløselige ektodomæner af membranreceptorer ved hjælp af HEK293-proteinekspressionssystemet samt forskellige multimerizationsteknikker og proteinudtrykskonstruktioner til produktion af både pentamericproteiner og monomeriske proteiner er tidligere beskrevet1,17. Protokollen her vil beskrive trinene til generering af fluorescerende avid sonder fra monomererede biotinylerede proteiner ved at konjugere dem til streptavidin konjugeret til en fluorochrome (f.eks phycoerythrin, eller PE), som kan anvendes direkte i celle-baserede bindende assays og har den fordel, at der ikke kræver et sekundært antistof til påvisning. Generelle protokoller for udførelse af genomskalaskærme er allerede blevet beskrevet20,21, og protokollen fokuserer således primært på detaljerne i at udføre flowcytometribaserede rekombinant proteinbindingsskærme ved hjælp af CRISPR/Cas9-knockoutscreeningssystemet ved hjælp af Human V1 -biblioteket ("Yusa")18.

Protocol

1. Produktion og rensning af biotinlaterede hans mærkede proteiner

  1. Brug et proteinudfoldelsessystem baseret på pattedyr eller insektceller til at fremstille opløselige rekombinant hans mærkede biotinylerede proteiner (se plasmidkonstruktioner i tabel 1).
    BEMÆRK: En detaljeret protokol for produktion af monomeriske biotin og hans mærkede proteiner ved hjælp af HEK293-celleudfoldelsessystemet er beskrevet af Kerr et al.17. Proteinektodomæner udtrykt ved hjælp af HEK293-ekspressionssystemet udskilles i kulturmediet.
  2. De opløselige proteiner opsamles ved at pelletere cellerne ved centrifugering ved 3.000 x g i 20 min.
  3. Supernatanten filtreres gennem et 0,22 μm-filter, og Ni2+-NTA agaroseperlerne til det filtrerede proteinsupernatant filtreres i et 1:1.000 forhold (dvs. 50 μL 50% agarosegylle i 50 ml supernatant). Inkuber natten over eller mindst 4-5 timer ved 4 °C på en roterende platform.
  4. Polypropylensøjlen vaskes ved at tilsætte 5 ml vaskebuffer til hans rensning. Der henvises til tabel 2 for alle buffersammensætninger.
  5. Hæld hele perle-protein supernatant blandingen i kolonnen. Perler vil akkumulere på basen.
  6. Perlerne vaskes 2x med 15 ml vaskebuffer. For at undgå proteinfortynding skal restvaskebufferen forsigtigt trækkes fra kolonnen med en 5 ml sprøjte og kasseres.
  7. Tilsæt forsigtigt 300-500 μL af hans-rensning eluering buffer direkte til perlerne og inkubere i mindst 1 h. Opsaml eluted protein ved igen omhyggeligt at trække væsken ud ved hjælp af en 1 ml sprøjte. Eliksøgtbufferen udskiftes med den ønskede buffer (f.eks. normalt PBS eller HBS) ved hjælp af afsaltningskolonner. Opbevar alle proteiner ved 4 °C indtil videre brug.

2. Kvantificering og oligomerisering af monomert biotinylt protein

BEMÆRK: For at øge bindingenviditet, oligomerize biotinylerede monomererede proteiner på tetrameric streptavidin-PE før du bruger dem i bindende analyser. Opnå optimale konjugationsforhold for monomeriske proteiner og tetramer streptavidin-PE ved at teste en fortyndingsserie af biotylerede monomerer mod en fast koncentration af streptavidin og ved empirisk at fastsætte den minimale fortynding, hvor der ikke kan påvises overskydende biotinylerede monomerer.

  1. Der fremstilles mindst otte serielle fortyndinger af biotinylerede proteinprøver ved hjælp af en passende fortyndingsbuffer (enten PBS eller HBS med 1 % bovinserumalbumin [BSA]) i en 96 brøndplade. Sørg for, at det endelige volumen af hver fortynding er på mindst 200 μL.
  2. Der fremstilles en duplikatplade af prøverne ved at fjerne 100 μL fra hver brønd og overføre den til en ny 96 brøndplade. Medtag altid et kontrolelement. I dette tilfælde kontrol er tag-only proteiner (dvs. biotinyleret Hans-tagged Cd4 domæne 3 +4 protein). Dette vil blive brugt som en kontrolsonde i alle bindende analyser.
  3. Streptavidin-PE fortyndes til 0,1 μg/ml i fortyndingsbufferen.
  4. På blot en af pladerne tilsættes 100 μL af den fortyndede streptavidin-PE. Den dublerede plade vil tjene som en kontrol. Der tilsættes 100 μL fortyndingsbuffer i kontrolpladen for at udligne volumener.
  5. Inkuber i 20 minutter ved stuetemperatur (RT). I mellemtiden blokeres brøndene på en streptavidin-belagt plade med fortyndingsbufferen i 15 min.
  6. Prøvens samlede volumen overføres fra begge plader til individuelle brønde på de streptavidinbelagte plader og inkuberes i 1 time ved RT.
  7. Pladen vaskes med 200 μL vaskebuffer (dvs. enten PBS eller HBS med 0,1% Tween-20, 2% BSA). Der tilsættes 100 μL 2 μg/ml mus anti-rat Cd4d3+4 IgG (OX68) og inkuberes i 1 time ved RT.
  8. Pladen vaskes 3x med vaskebufferen. Der tilsættes 100 μL antimuse alkalisk fosfatasekonjugate ved 0,2 μg/ml i 1 time ved RT.
  9. Pladen vaskes 3x med vaskebuffer og 1x i fortyndingsbufferen.
  10. Der fremstilles p-nitrophenylephosphat ved 1 mg/ml i diethanolamin buffer. Der tilsættes 100 μL i hver brønd og inkuberes i 15 min.
  11. Tag absorbansaflæsninger ved 405 nm. Brug den mindste fortynding, hvor der ikke er noget signal på pladen, som den relevante fortyndingsfaktor til at skabe tetramer (figur 2).
  12. Der fremstilles en 10x tetramerfarvningsopløsning til alle prøver og kontroller ved at inkubere 4 μg/ml streptavidin-PE og den relevante biotylerede proteinfortynding i 30 min ved RT. Opbevar konjugerede proteiner i et lysbeskyttet rør ved 4 °C indtil viderebrug.

3. Flow cytometry-baserede celle bindende analyser

  1. For klæbende celler fjernes dyrkningsmedierne og 1x vaskes med PBS uden divalent kationer. Tilføj derefter celleaftagningsløsninger (f.eks. Lad cellerne løsne sig i 5-10 min. Bank forsigtigt på kolben for at frigøre cellerne.
    BEMÆRK: Undgå at bruge trypsin-baserede produkter, da de kan kløve celleoverfladeproteiner.
  2. Saml fritliggende celler i et rør. For celler, der vokser i suspension (f.eks.
  3. Pelletceller ved 200 x g i 5 min. Fjern supernatanten, og opslæmm pellet'en i vaskebufferen (dvs.
  4. Cellerne tælles med et hemocytometer, og koncentrationen justeres til 2,5 x 105-1 x10 6 celler/ml. Aliquot 100 μL tilberedt celleblanding på en 96 brønd U- eller V-bundplade. Pladen drejes i 5 minutter ved 400 x g. Fjern supernatanten med en flerkanalspipette.
  5. Der tilsættes 100 μL normaliseret fluorescerende mærket meget ivrigproteinsonder og kontroller i de tidligere fremstillede plader med celler og inkuberes i 1 time ved 4 °C. Efter binding i 1 time drejes pladen med 400 x g i 5 min.
  6. Fjern supernatanten, og tilsæt 200 μL vaskebuffer (dvs. PBS/1% BSA). Bland godt ved pipettering op og ned.
  7. Træd cellerne ved centrifugering ved 400 x g i 5 min. Gentag vasketrinnet 1x. Efter to vasker, helt fjerne supernatant og resuspend celle pellet i 100 μL PBS.
  8. Analyser cellerne efter flowcytometri. Brug den gulgrønne laser (dvs. 561 nm) til at detektere PE-fluorescens.
    1. Først analysere de celler, der er blevet plettet med kontrol sonden. Baseret på fordelingen af PE fluorescens, tegne en port til bindende befolkning, således at højst 1% af kontrolcellen falder i denne port.
    2. Analysér prøven, og bestem den del af celler, der falder i bindingsporten.
      BEMÆRK: Cellelinjer, der viser en højere bindingspopulation, ønskes til genetiske skærme, da de har et højere signal-støj-forhold. Ideelt set over 80% af cellerne bør falde inden for denne port.

4. Bestemmelse af bindende bidrag fra varme labile epitoper og heparan sulfat sidechains

BEMÆRK: Aktiviteten af mange proteiner er varme labile, så tab af bindende aktivitet efter varmebehandling er opmuntrende. Det tilrådes at bestemme bidraget fra negativt ladede glycosaminoglycaner, hovedsagelig heparansulfat (HS), ved at mægle binding af de rekombinant proteiner. Dette skyldes, at bindingen af HS i den cellebindingsanalyse, der er beskrevet her, kan være additiv snarere end codependent på andre receptorer19. Det betyder, at den observerede binding kan medieres fuldstændigt af HS sidekæder af celleoverfladeproteoglycaner og ikke af en specifik receptor. Binding til HS på celleoverfladen er ikke nødvendigvis uspecifik, men snarere en egenskab ved et protein, som er nyttigt at vide, før du udfører en fuld genetisk skærm.

  1. Forbered varmebehandlede proteinprøver til brug i bindende analyser.
    1. Det normaliserede, men ikkekonjugerede monomejeprotein opvarmes ved 80 °C i 10 min.
    2. Konjuger det varmebehandlede protein til streptavidin-PE under forudsætning af det samme konjugationsforhold som dets ubehandlede modstykke som bestemt af ELISA (se afsnit 2).
  2. Forbered heparin-blokerede proteinprøver.
    1. Der fremstilles otte 1:3 fortyndinger af opløselig heparin i PBS med en startkoncentration på 2 mg/ml og et endeligt volumen på 100 μL.
    2. 100 μL fremstillede bindingssonder inkuberes i heparinfortyndingerne i mindst 30 min.
  3. Der anvendes varmebehandlet protein og hele 200 μL heparin/proteinblanding i de bindingsanalyser, der er beskrevet i afsnit 3. Repræsentative resultater er vist i figur 3A,B.

5. Valg af cellelinjer stikker udtryk Cas9

BEMÆRK: Før den cellelinje, der binder den pågældende sonde, kan anvendes i CRISPR-screening, skal den først konstrueres til at udtrykke Cas9-nukleasen og en meget aktiv klon udvalgt19.

  1. Brug følgende generelle lentivirusproduktionsprotokol til fremstilling af lentivirus ved hjælp af lentiviral konstruktionen til Cas9-udtryk (se tabel 1).
    1. Kultur HEK293-FT celler i DMEM/10% FBS medier ved 37 °C og 5% CO2. Frø HEK293-FT celler 1 dag før transfection, så de er ~ 80% sammenløb på dagen for transfektion.
      BEMÆRK: HEK293FT celler er løst klæbende; Når de anvendes til fremstilling af lentivirus, skal de derfor overvejes at plettere dem på dyrkningskolber, der er belagt med 0,1 % (w/v) gelatine for at øge overholdelsen.
    2. Udfør transfekture i morgen. Der tilsættes overførselsvektor, emballageblanding og transfekturereagens i forvarmede transfektik kompatible medier (f.eks. Bland ved at vende røret 10-15x. Inkuber i 5 min ved RT. Se tabel 3 for nøjagtige mængder.
    3. Tilsættes transfekturereagens som foreslået af producenten. Bland ved hurtig vortexing. Inkubere i 30 min på RT.
    4. Meget omhyggeligt aspirere det brugte medium. Tilføj transfekture kompatible medier til plade.
    5. Tilsættes transinfektion reagens / DNA komplekser dropwise på siden af pladen og langsomt spredes gennem pladen ved hvirvlende meget forsigtigt.
    6. Inkuber ved 37 °C i 3-5 timer og erstattes med D10 medium. Inkubere natten over.
    7. Næste dag om morgenen, erstatte mediet med frisk D10 medium. Inkubere natten over.
    8. Næste dag sent på eftermiddagen, indsamle den virale supernatant. Filter med et 0,45 μm filter med lav proteinbinding. Eventuelt tilføje frisk D10 medium, inkubere natten over og huske supernatant den næste dag.
    9. Virussupernatanter er stabile ved 4 °C i kun nogle få dage. Opbevares ved -80 °C til langtidsopbevaring.
      BEMÆRK: For at fremsuge et stærkt koncentreret lentiviralt præparat, som kan være ønskeligt ved transduktion af letfordærverceller, kan supernatanter også koncentreres ved centrifugering ved 6.000 x g natten over ved 4 °C. Marker den gennemsigtige virale pellet med en ethanol-resistent pen og kassér supernatanten. Opslæmm pellet i 1/100th af det oprindelige volumen for en 100x stigning i koncentrationen.
  2. Transduce cellerne med lentivirus.
    1. Plade 1 x 106 celler pr brønd i en 6 brøndplade med 3 ml passende dyrkningsmedier. Nogle celler er lettere transduced end andre. For let at transduce celler (f.eks HEK celler), direkte tilføje lentivirus til cellerne. For at kunne transduceceller, kan det være nødvendigt at følge en spinokuleringsprotokol som beskrevet nedenfor.
      1. Aliquot 2 ml 2-5 x 106 celler/ml i et 15 ml konisk rør.
      2. Lentivirus tilsættes sammen med 8 μg/ml hexadimethrinbromid og inkuberes ved RT i 30 min.
      3. Centrifuge i 100 min ved 800 x g ved 32 °C. Derefter opslæmmet cellerne i de samme medier og tilføje celle suspension i passende dyrkning kolber med passende medier.
    2. Der må i mindst 24 timer tillad transduktioner i mindst 24 timer.
    3. Efter yderligere 24 timer, ændre medierne til en, der er suppleret med de relevante antibiotika. Cas9 konstruktionen indeholder en blasticidin modstand kassette til udvælgelse.
      BEMÆRK: Mængden af blasticidin skal optimeres for hver cellelinje ved at udføre en dosisresponsdræbningskurve. En blasticidinkoncentration mellem 2,5-50 μg/ml skal dræbe de fleste ikke-overførte cellelinjer inden for 10 dage efter transduktion.
  3. Udfør markeringen, indtil alle celler i kontrolpladen (dvs. ikke-overførte celler, der er blevet behandlet med samme koncentration af markeringsantibiotikum), aflives.

6. Valg af høje Cas9-aktivitet kloner

BEMÆRK: Polyclonal Cas9 kan bruges til at udføre genetiske skærme; Men at vælge en klon med høj Cas9 aktivitet forbedrerscreeningresultaterne 18.

  1. Brug begrænsende fortynding eller enkeltcellesortering individuelle blasticidinresistente celler i brønde af tre 96 brøndplader, der indeholder dyrkningsmedier suppleret med blasticidin. Kloner vil begynde at dukke op mellem 2-4 uger. Vælg 10-20 kloner og udvide i 6 godt plader.
  2. Ans analyser klonerne for Cas9-aktiviteten ved hjælp af det hurtige at vurdere GFP-BFP-system (grønt fluorescerende protein-blå fluorescerende protein), som anvender et eksogent gen knockout-system, hvor cellerne transuceres enten med en konstruktion, der udtrykker GFP med en gRNA-målretning af GFP eller et tomt gRNA som kontrol18.
    1. Bestil reporter plasmider: GFP-BFP plasmid, Control-BFP plasmid (Tabel 1).
    2. Der fremstilles lentivirus til både GFP-BFP plasmid og Control-BFP plasmid ved hjælp af den lentivirusproduktionsprotokol, der er beskrevet i punkt 5.1.
    3. Transduce hver Cas9-ekspresserende cellelinjeklon med lentivirus, der kodning af GFP-BFP-systemet og Control-BFP separat. Følg protokollen i punkt 5.2.
    4. Efter 3 dages transduktion skal GFP-BFP-fluorescensen for hver klon undersøges ved hjælp af flowcytometri. Brug 488 nm laser og 405 nm laser til at registrere henholdsvis GFP og BFP.
    5. Kvantificer Cas9-aktiviteten i hver klon ved kun at undersøge forholdet mellem BFP og GFP-BFP-dobbelt positive celler. Høj aktivitet Cas9 celler bør ideelt set have >95% GFP knockout effektivitet (Figur 4).

7. Generation af genom-dækkende CRISPR-Cas9 screening knockout bibliotek

  1. For genom-dækkende screening ved hjælp af Human V1 bibliotek18, bestil genom-dækkende bibliotek (se tabel 1) og forberede plasmid biblioteket fra bakteriel stab ved hjælp af protokollen under "Protokoller for Bibliotek Replikation" i producentens manual.
  2. Brug det genomdækkende biblioteksplasmidpræparat til at fremstille et lentiviralt bibliotek, der kodler gRNA'er til målrettet forstyrrelse af menneskelige gener ved hjælp af lentivirusproduktionsprotokollen beskrevet i afsnit 5.1.
    BEMÆRK: En god praksis er at producere et enkelt parti lentiviral forberedelse, der er optimeret til transduktion for at forbedre eksperimentelle konsistens.
  3. Brug transduktionsprotokollen i punkt 5.2 til at udføre små testtransdutioner for at bestemme den nødvendige mængde virus for hver cellelinje for at opnå 30% transduktion. Brug flowcytometri til at vurdere BFP-fluorescens som en proxy for transduktionseffektivitet.
  4. At transduce HEK293 celler, skal du blot tilføje den forudbestemte lentiviral forberedelse til 30-50 x 106 celler dyrkes i normal vækst medier for ~ 4 h. Fjern derefter mediet med lentivirus, og udskift det med friske vækstmedier.
  5. For andre cellelinjer anvendes spinomuleringsprotokollen i punkt 5.2.1, men i større målestok, således at i alt 30-50 x10 6 celler transledes. Til dette, aliquot 2 ml 5 x 106 celler / ml i en 15 ml konisk rør og fortsætte som angivet.
  6. For klæbende cellelinjer skal trans inducerede celler markeres ved at tilføje puromycin 24 timer efter transduktion.
    BEMÆRK: Optimer puromycinkoncentrationerne ved at udføre en dosisresponsdræbningskurve. Normalt koncentrationer mellem 1-10 μg/ml bør dræbe ikke-overførte celler inden for 3-5 dage. Undgå at bruge højere koncentrationer af puromycin, da dette kan øge chancerne for at vælge celler, der er blevet transduced af mere end onesingle guide RNA (sgRNA).
  7. For suspensionsceller høstes trans inducerede (dvs. BFP-positive) celler 3 dage efter overtransuktionen ved hjælp af en cellesortering og generere biblioteker, der indeholder mindst 10 x 106 celler. Når det er valgt ved hjælp af BFP, vokse cellerne i medier suppleret med passende mængde puromycin.
    BEMÆRK: Undgå kun markeringer med puromycin til suspensionscellelinjer, da det er vanskeligt at fjerne døde celler og snavs fra suspensionscellekulturer, der kan forstyrre cellesortering.
  8. Kultur mutant bibliotek i 9-16 dage eftertransduktion med regelmæssig passage hver 2-3 dage.

8. Genetisk screening for celleoverfladebinding

  1. Pellet den mutante celle bibliotek på 200 x g i 5 min og resuspend cellerne i PBS.
  2. Opdel cellerne i to 15 ml koniske rør med mindst 50 x 106 celler i hvert rør.
  3. Drej et konisk rør ved 200 x g i 5 min, fjern supernatanten, og fastfrysning af cellepillen ved -20 °C. Dette er kontrolpopulationen og vil blive behandlet senere.
  4. Opslæmm pellet i det andet rør i 10 ml PBS/1% BSA. Der afsættes 100 μL celler som en negativ kontrol på en 96 brøndplade.
  5. Der tilsættes det relevante prækonkommele rekombinant protein til cellesuspensionen i det koniske rør og de negative kontrolproteiner til 96 brøndpladen.
  6. Cellefarvning i mindst 1 time ved 4 °C udføres på en rotor på en bordplade med forsigtig rotation (6 omdr./min.).
  7. Pellet cellerne ved 200 x g i 5 min, fjern supernatanten. Udfør to vasketrin, derefter resuspend cellerne i 5 ml PBS.
  8. Strain cellerne om en 30 μm celle si til at fjerne celle klynger. Analysér ved hjælp af en flowsortering.
  9. Brug den negative kontrolprøve til at gate for BFP+/PE-celler.
  10. Sorter eksemplet, og opsaml BFP+/PE-cellerne. Sorteringsportene vil afhænge af cellernes binding til proteinet, men er normalt 1-5% af PE-de negative prøver indsamles. Et eksempel på en sorteringsport findes i supplerende figur 1.
  11. Saml 500.000-1.000.000 celler fra den valgte port. I betragtning af det lave antal celler, overveje at indsamle prøverne i en 1,5 ml centrifugeringsrør for at minimere tab.
  12. Pellet de sorterede celler ved centrifugering ved 500 x g i 5 min. Fjern forsigtigt supernatanten og kassér. Pellet'en kan opbevares ved -20 °C i op til 6 måneder.

9. Genomisk DNA-ekstraktion og første PCR til gRNA-berigelse

  1. Udtræk genomisk DNA fra høj kompleksitet kontrol befolkning.
    1. Hvis kontrolpopulationen blev frosset ved -20 °C, skal det koniske rør tegnes, og PBS tilsættes. Hold på is for at tø pellet.
    2. Brug et kommercielt kit (se Tabel over Materialer) ved hjælp af producentens anbefalinger til at udtrække genomisk DNA fra 50 x 106 celler. DNA-koncentrationen justeres til 1 mg/ml.
    3. For hver prøve sættes der en masterblanding til PCR svarende til 72 μg DNA. Aliquot 50 μL pr brønd i 36 brønde af en 96 godt PCR plade. De nødvendige primersekvenser er anført i tabel 4. Brug vejledningen i tabel 5 og 6.
    4. 5 μL af PCR'en fra 6-12 repræsentative prøver på en 2% (w/v) agarosegel. Et enkelt klart bånd på ~ 250 bp skal overholdes. Hvis båndene er svage, skal du gentage PCR'en i yderligere 2-3 cyklusser.
    5. Brug en multikanalpipette til at indsamle 5 μL PCR-produkter fra hver brønd (i alt 180 μL) og samle dem i et reservoir med 900 μL bindingsbufferfra et kommercielt kit (se Tabel over materialer ).
    6. Rengør PCR-produkterne ved hjælp af et kommercielt PCR-rensningssæt. Eluter DNA i 50 μL elueringsbuffer fra et kommercielt kit (se Materialetabel )og mål DNA-koncentrationen.
  2. Prøver, der er blevet sorteret med henblik på tab af bindende fænotype, vil sandsynligvis ikke bestå af et stort antal uafhængige kloner. Det er derfor ikke nødvendigt at udføre PCR med 72 μg DNA. Isoler DNA'et ved hjælp af et passende handelssæt (se Tabel over Materialer). Opsæt 3-4 PCR-reaktioner ved hjælp af den protokol, der er beskrevet før (punkt 9.1.3) med 100 ng/μL DNA. Hvis det sorterede celletal er mindre end 100.000 bruge cellelysater i stedet for genomiske DNA-præparater.
    1. Aliquot ca 10.000 celler / godt i en 96 godt PCR plade.
    2. Pellet cellerne i pladen og forsigtigt fjerne det meste af supernatanten. Pellet vil ikke være synlig.
    3. Der tilsættes 25 μL vand i hver brønd, og prøverne opvarmes ved 95 °C i 10 min.
    4. Der tilsættes 5 μL 2 mg/ml frisk fortyndet proteinase K til hver brønd i 1 time og inkuberes ved 56 °C. Derefter opvarmes prøven i 10 min ved 95 °C for at inaktivere proteinase K.
    5. Brug 10 μL cellelylatblanding pr. PCR-reaktion. Lysater skal anvendes inden for 24 timer.

10. Anden runde af PCR for indeksbarkodning og sekvensering

  1. Produkterne fortyndes fra første runde PCR til 40 pg/μL.
  2. Opret én PCR pr. prøve (brug vejledningen i tabel 7 og 8). Brugen af en high-fidelity polymerase er vigtigt at minimere fejl indført af polymerase under sgRNA forstærkning.
  3. 5 μL PCR-produkter fortolkes på en 2% (w/v) agarosegel. Der skal observeres et enkelt klart bånd på ~330 bps.
  4. Opvider PCR-produkter ved hjælp af paramagnetiske perler ved at tilsætte 31,5 μL (0,7 x samlet volumen) af resuspenderede perler til PCR-produkterne, blande godt og inkubere i 5 min ved RT.
  5. Anbring røret på et magnetisk stativ i 3 min. Perlerne skal fanges på siden af pladen, og opløsningen skal være klar. Fjern og kassér forsigtigt supernatanten.
  6. Der tilsættes 150 μl frisklavet ethanol på røret. Inkuber i 30 s, og derefter forsigtigt fjerne og kassere supernatanten.
  7. Trin 13.6, denne gang med 180 μL. Lufttørre perlerne i 5 min.
  8. Tag røret ud af magneten. Eluter DNA-mål fra perler til 35 μL steril EB buffer. Inkuber i 3 min, og sæt derefter røret tilbage i den magnetiske rack i 3 min.
  9. Overfør ca. 30 μL af supernatanten, der indeholder de eluterede PCR-produkter, til et rent rør.
  10. Sekvenser prøverne på en næste generations sekvensplatform. For HumanV1 gRNA-biblioteket skal du bruge den brugerdefinerede primer, der er anført i tabel 4, til sekvens 19 bp.

11. Bioinformatikanalyse til identifikation af receptoren og de dermed forbundne veje

  1. Kortfør sekvenser fra sorteret og usorteret population til referencebiblioteket ved hjælp af tællefunktionen i MAGeCK. Funktionen giver en rå optællingsfil (supplerende tabel 1).
    BEMÆRK: Detaljerede instruktioner om installation af MAGeCK og brugen af forskellige funktioner i MAGeCK er beskrevet i en tidligere offentliggjort protokol af Wang et al.20.
  2. Kontroller den tekniske standard for det kontrolbibliotek, der bruges på skærmen.
    1. Median normalisere de rå tæller og bruge ggplot2 pakke i R21 eller tilsvarende software til at plotte en empirisk kumulative densitet funktion plot af tællinger i plasmid og kontrol usorterede prøver (Figur 5A).
    2. Testfunktionen -test af MAGeCK anvendes ved hjælp af optællinger fra plasmidpopulationen som "kontrol" og tællingerne fra usorterede kontrolprøver som "testprøven". Funktionen er vil give et gen sammenfattende fil (Supplerende tabel 1).
    3. Åbn genresuméfilen, og tegn fordelingen af log-fold-ændringer (neg|lfc kolonne) for tidligere kategoriserede væsentlige og uvæsentlige gener22 (Figur 5B).
    4. Vælg væsentligt forarmede gener (neg|fdr < 0.05), og udfør vejberigelsesanalyse ved hjælp af beriger23-pakken eller tilsvarende vejberigelsespakker i R (figur 5C).
  3. Kør -testfunktionen for MAGeCK med standardindstillingen. Brug råtællinger fra usorterede kontrolprøve som "kontrol" og tæller fra sorteret prøve som "behandling", når analysen udføres.
  4. Åbn den genoversigtsfil, der er genereret af MAGeCK, og rangord kolonnen pos|rank i stigende rækkefølge. Brug FDR (pos|fdr-kolonne) < 0,05 som cutoff til identifikation af hits. Receptoren er normalt rangeret højt, ofte i den første position.
  5. Plot RRA-scorerne (Robust-Ranking-Algorithm) for positiv udvælgelse (pos|score) i R eller en tilsvarende software (Figur 5D).
  6. Vælg genhitsene, og udfør pathway enrichment analysis ved hjælp af berigerpakken eller tilsvarende vejberigelsespakker i R for at identificere de berigede veje.

Representative Results

Sekventeringsdata fra to repræsentative genomskala-knockoutskærme til identifikation af bindepartneren for humane TNFSF9- og P. falciparum RH5, der udføres i henholdsvis NCI-SNU-1- og HEK293-celler, findes (Supplerende tabel 1). Den bindende adfærd RH5 blev påvirket af både heparan sulfat og dens kendte receptor BSG24 (Figur 3C), mens TNFRSF9 specifikt bundet til sin kendte receptor TNFSF9 og ikke miste bindende ved præinubering med opløselig heparin. Protein 3 i figur 3B repræsenterer TNFRSF9.

For begge cellelinjer forefindes også fordelingen af gRNA'er i kontrolmutantbiblioteket efter 3 dage (9, 14 og 16 dage efter overtranstur), (supplerende tabel 1). GRNA-fordelingen viste, at bibliotekets kompleksitet blev opretholdt under hele forsøget (figur 5A). Den genetiske skærm til identifikation af liganderen for TNFSF9 blev udført på dag 14 eftertransducering, mens det for RH5 blev udført dag 9 eftertransduktion. Skærmenenes tekniske kvalitet blev vurderet ved at undersøge fordelingen af observerede fold-ændringer af gRNA'er rettet mod et referenceseferencesæt af ikkevæsentige gener sammenlignet med fordelingen af referencesæt af væsentlige gener22 (figur 5B). Desuden viste berigningen på vejniveau også, at de forventede væsentlige veje blev identificeret og væsentligt beriget i "frafaldspopulationen", når kontrolprøven sammenlignes med det oprindelige plasmidbibliotek. Et eksempel med dag 14 NCI-SNU-1 prøve er afbildet i figur 5C.

Fordelingen af gRNA'erne i kontrol- og sorteringspopulationen ved hjælp af -testfunktionen af MAGeCK (se supplerende tabel 1 for genresuméoutputtet fra MAGeCK) blev anvendt til at identificere receptoren fra fænotypiske skærme. Den modificerede RRA-score, der er rapporteret af MAGeCK i genanalysen, afbildes i forhold til de gener, der er rangeret efter p-værdier. RRA-scoren i MAGeCK giver et mål, hvor gRNA'er rangeres konsekvent højere end forventet. På skærmen for TNFRSF9, var det øverste hit TNFSF9, som er en kendt bindende partner tnfrsf9 (figur 5D). Desuden blev en række gener relateret til TP53-vejen også identificeret. Med hensyn til RH5 blev der ud over den kendte receptor (BSG) og det gen, der kræves til fremstilling af de sulferede GAGs (SLC35B2), også identificeret et yderligere gen (SLC16A1) (figur 5E). SLC16A1 er en chaperone, der kræves til handel med BSG til overfladen afcellerne 25. Tilsammen viser disse resultater skærmens evne til at identificere direkte interagerende receptorer og de cellulære komponenter, der kræves for at få denne receptor udtrykt på cellernes overflade i en funktionel form.

Figure 1
Figur 1: Oversigt over den genetiske screeningstilgang til identifikation af cellere overfladereceptorer. Denne analyse består af tre store trin: For det første udtrykkes rekombinante proteiner, der repræsenterer ektodomænet for cellereceptorer, i en cellelinje, der kan tilføje strukturelt kritiske posttranslationelle ændringer såsom HEK293-celler. Monomeriske proteinektodomæner er oligomeret ved at konjugere til streptavidin-PE for at øge deres bindende begærlighed. For det andet anvendes disse ivrige sonder i cellulære bindingsanalyser, hvor lys farvning på cellelinjerne indikeret ved et fremtrædende skift i PE fluorescens (i grøn) sammenlignet med et negativt kontrolprotein (i sort) viser tilstedeværelsen af en celleoverfladebindingspartner. For det tredje udvælges receptorpositive Cas9-ekspressive cellelinjer, og der udføres genomskalascreening ved hjælp af gRNA'er, der er rettet mod langt størstedelen af proteinkodningsgener. Mens der genereres mutant biblioteker, er det almindeligt at bruge 30% transduktion effektivitet, som er baseret på Poisson fordeling sandsynlighed, der sikrer hver celle modtager en enkelt gRNA, således at den resulterende fænotype tilskrives en bestemt knockout. BFP-mærket udtrykt af de trans inducerede celler bruges til at markere celler, der indeholder gRNAs ved hjælp af FACS. Fænotypiske skærme udføres mellem 9-16 dage eftertransduktionen. På skærmens dag er den samlede mutantcellepopulation opdelt i to. Den ene halvdel holdes som kontrolpopulation, og den anden halvdel vælges til rekombinant proteinbinding. Cellerne fra det mutante bibliotek, som ikke længere er i stand til at binde det rekombinant protein, sorteres ved hjælp af FACS, og berigelsen af gRNA'er i den sorterede versus kontrolpopulation anvendes til at identificere gener, der kræves til celleoverfladebinding af den mærkede ivrige sonde. Trin i protokollen, der kræver lang tid, er angivet. Dette tal er blevet ændret fra Sharma et al.19. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: Bestemmelse af forholdet mellem biotinyleret protein og streptavidin-PE ved hjælp af en ELISA-baseret metode. Et eksempel på streptavidin-PE konjugationsstrategi, der anvendes til at generere en ivrig sonde fra et biotinyleret monomejeprotein. En fortyndingsserie af biotinlaterede monomerer blev inkuberet mod en fast koncentration af streptavidin. Den mindste fortynding, hvor der ikke kan påvises overskydende biotinylerede monomerer, blev bestemt af ELISA. ELISA blev udført med eller uden at præinkubere en række proteinfortyndinger med 10 ng streptavidin-PE. Ved tilstedeværelse af streptavidin-PE blev den mindste fortynding, hvor der ikke blev identificeret noget signal (cirkelsort), og den mængde protein, der kræves til mætning, beregnet til at generere en 10x stamopløsning med 4 μg/ml streptavidin-PE. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: Repræsentativ binding af proteiner til cellelinjer. (A) Proteinbinding til cellelinjer havde en klar stigning i cellerelateret fluorescens sammenlignet med kontrolprøven. Varmebehandling (80 °C i 10 min) af rekombinant protein ophævet alle binding tilbage til en negativ kontrol, hvilket viser, at bindende adfærd var afhængig af korrekt foldet protein. (B) Forskellige klasser af protein bindende adfærd til celleoverflader; afhængighed af GAG'er. Fra venstre mod højre kan proteinerne klassificeres i tre typer: Proteintype 1 adsorberer kun adsorberer til HS. Disse proteiner mister deres binding efter forbøjelse med heparinkoncentrationer over 0,2 mg/ml. Protein type 2 binder sig til HS ud over en specifik receptor. Disse proteiner mister delvis binding i preblocking eksperimenter. Proteintype 3 binder ikke HS. Disse proteiner mister ikke binding i forhold til forældrenes linjer. (C) Et eksempel på et protein (dvs. Målretning af enten receptoren (dvs. BSG) eller enzymer, der kræves til HS-syntese (f.eks. Transduced polyklonale linjer kan bruges i sådanne eksperimenter til at etablere bindende adfærd. Dette tal er blevet ændret fra Sharma et al.19. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: Valg af klonale cellelinjer med høj Cas9-aktivitet. Genomredigeringseffektiviteten af både polyklonale og klonede linjer af NCI-SNU-1-cellelinjer blev vurderet ved hjælp af GFP-BFP-reportersystemet, hvor cellelinjer blev transuceret med virus med en gRNA-målretningsplasmid, der var kodet GFP eller uden (dvs. "tom"). Der afbildes et skema. Flowcytometri blev anvendt til at teste både BFP- og GFP-udtrykket efter transduktion og sammenlignet med ikke-inficeret kontrol. GFP-udtryk blev brugt som proxy for Cas9-aktivitet, mens BFP-udtryk markerede trans inducerede celler. Profilen for ikke-inficerede og tomme inficerede celler lignede hinanden for alle kloner. Repræsentative profiler er afbildet i venstre panel. Alle fem kloner af NCI-SNU-1 cellelinjen viste et højere tab af GFP sammenlignet med polyklonallinjen (højre panel), med klon 4, der viste den højeste effektivitet med den laveste ildfaste population. Dette tal er blevet ændret fra Sharma et al.19. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5: Repræsentative resultater fra genetiske skærme til identifikation af celleoverfladebindingspartnerne. (A) Kumulative fordelingsfunktionsvisceller, der sammenligner gRNA-tætheden i plasmidbiblioteket med mutantbibliotekerne i HEK-293-E- og NCI-SNU-1-celler på dag 9, 14 og 16 dage efter overtransmuktionen. For et givet tal rapporterer den kumulative tæthedsfunktion den procentdel af datapunkter, der lå under denne grænse. Den lille forskydning af den mutante cellepopulation sammenlignet med den oprindelige plasmidpopulation repræsenterer udtyndingen i en delmængde af gRNA'er sammenlignet med plasmidbiblioteket. (B) Fordeling af log-fold ændringer i gener, der tidligere er kategoriseret som værende væsentlige (rød) eller uvæsentlige (sort) i HEK293 og NCI-SNU-1 cellelinjer. Fordelingen af fold-ændringer for uvæsentlige gener centreret på ~ 0, mens det for væsentlige gener flyttet til venstre mod negative fold ændringer. (C) Signifikant berigede veje i gener udtømt i NCI-SNU-1 mutant kontrolpopulation 14 dage efter overtransuktionen. Forventede kendte cellefor væsentlige veje blev identificeret. (D) Robust Rank Algorithm (RRA)-score for gener, der blev beriget i de sorterede celler, der havde mistet evnen til at binde TNFRSF9 sonden. Gener blev rangeret i henhold til RRA-score. Den kendte interaktionspartner TNFSF9 og gener relateret til TP53-vejen (mærket med rødt) blev identificeret på skærmen. (E) Rangbestilte RRA-scorer for gener identificeret ved gRNA-berigelsesanalyse, der kræves til RH5-binding til HEK293-celler (venstre panel). SLC35B2 og SLC16A1 blev identificeret inden for en FDR-grænse (False-Discovery-Rate) på 5 %. Yderligere to gener i HS-biosyntesevejen (dvs. EXTL3 og NDST1)blev identificeret inden for FDR på 25 %. Skematisk, der viser den generelle GAG biosyntesevej med de relevante gener kortlagt til de tilsvarende trin (panel 2). Gener, der er nødvendige for forpligtelsen til chondroitinsulfatbiogenese (dvs. CSGALNACT1/2),blev ikke identificeret på skærmen. Dette tal er blevet ændret fra Sharma et al.19. Klik her for at se en større version af dette tal.

Plasmid navn Plasmid (Plasmid) # Bruge
Protein udtryk konstruktion: CD200RCD4d3 +4-bio-linker-hans Addgene: 36153 Produktion af rekombinant protein med CD4d3+4, biotin og 6-hans tags.
pMD2.G Addgene: 12259 VSV-G kuvert udtrykker plasmid; produktion af lentivirus
psPAX2 delte et 2.-28. Addgene: 12260 Lentiviral emballage plasmid, produktion af lentivirus
Cas9-konstruktion: pKLV2-EF1a-Cas9Bsd-W Addgene: 68343 Produktion af konstituerende udtryk Cas9 linje
gRNA-udtrykskonstruktion: pKLV2-U6gRNA5(BbsI)-PGKpuro2ABFP-W Addgene: 67974 CRISPR gRNA-ekspresseve med forbedrede stillads- og puro/BFP-markører
Human Forbedret Genom-dækkende Knockout CRISPR Bibliotek Addgene: 67989 Et gRNA-bibliotek mod 18.010 menneskelige gener, designet til brug i lentivirus.
GFP-BFP-konstruktion: pKLV2-U6gRNA5(gGFP)-PGKBFP2AGFP-W Addgene: 67980 Cas9 aktivitet reporter med BFP og GFP.
Tom konstruktion: pKLV2-U6gRNA5(tom)-PGKBFP2AGFP-W Addgene: 67979 Cas9 aktivitet reporter (kontrol) med BFP og GFP.

Tabel 1: Plasmider, der anvendes i denne fremgangsmåde.

Buffernavn Komponenter
HBS (10X) 1,5 M NaCl og 200 mM HEPES i MiliQ vand, justeres til pH 7,4
PBS (10X) 80 g NaCl, 2 g KCl, 14,4 g Na2HPO4 og 2,4 g KH2PO4 i MiliQ vand, juster til pH 7,4
Natriumphosphatbuffer (80mM lager) 7,1 g Na2HPO4.2H2O, 5,55 g NaH2PO4,juster til pH 7,4
Hans rensning bindende buffer 20 mM natriumfosfatbuffer, 0,5 M NaCl og 20 mM Imidazol, juster til pH 7,4
Hans renselse eluering buffer 20 mM natriumfosfatbuffer, 0,5 M NaCl og 400 mM Imidazol, juster til pH 7,4
Diethanolamin buffer 10% diethanolamin og 0,5 mM MgCl2 i MiliQ vand, justeres til pH 9,2:
kr. DMEM, 1% penicillin-streptomycin (100 enheder/ml) og 10% varmeinaktiveret FBS

Tabel 2: Buffere, der kræves til denne undersøgelse.

Komponenter 10 cm fad 6-brønds plade
293FT celler 70-80% sammenløb 70-80% sammenløb
Transfekturekompatibelt medie (Opti-MEM) (trin 5.1.2) 3 ml 500 μL
Transfekturekompatibelt medie (Opti-MEM) (trin 5.1.4) 5 ml 2 ml
Lentiviral overførselsvektor 3 μg 0,5 μg
psPax2 (se tabel 1) 7,4 μg 1,2 μg
pMD2.G (se tabel 1) 1,6 μg 0,25 μg
PLUS reagens 12 μL 2 μL
Lipofectamin LTX 36 μL 6 μL
D10 (trin 7.1.7) 5 ml 1,5 ml
D10 (trin 7.1.8 og 7.1.10) 8 ml 2 ml

Tabel 3: Mængder og mængder af reagenser til lentivirusemballageblanding.

Tabel 4: Primersekvenser til forstærkning af gRNA og NGS. Klik her for at se denne fil (Højreklik for at downloade).

Reagens Volumen pr. reaktion Master mix (x38)
Q5 Hot Start High-Fidelity 2x 25 μL 950 μL
Primer (L1/U1) blanding (10 μM hver) 1 μL 38 μL
Genomisk DNA (1 mg/ml) 2 μL 72 μL
H2O 22 μL 1100 μL
Samlede 50 μL 1900 μL

Tabel 5: PCR til forstærkning af gRNA'er fra prøver med høj kompleksitet.

Cyklusnummer Denature Udglødning Udvidelse
1 98 °C, 30'erne
2-24 98 °C, 10'erne 61 °C, 15 år 72 °C, 20'erne
25 72 °C, 2 min.

Tabel 6: PCR-betingelser for den første PCR.

Reagens Volumen pr. reaktion
KAPA HiFi HotStart ReadyMix 25 μL
Primer (PE1.0/index primer) mix (5 μM hver) 2 μL
Første PCR-produkt (40 pg/μL) 5 μL
H2O 18 μL
Samlede 50 μL

Tabel 7: PCR for indeksmærkning af sgRNA'er fra genetiske skærme.

Cyklusnummer Denature Udglødning Udvidelse
1 98 °C, 30'erne
2-15 98 °C, 10'erne 66 °C, 15 år 72 °C, 20'erne
16 72 °C, 5 min.

Tabel 8: PCR-betingelser for anden PCR.

Supplementary Figure 1
Supplerende figur S1: En vejledning til tegning af porte til sortering af den ikke-bindende population. (A) En ideel proteinkandidat til screening bør have en klar forskydning af den bindende befolkning i forhold til kontrolpopulationen, og bindingen bør bevares på celler, der mangler maskiner til HS-biosyntese. Et heparinblokeringseksperiment kan anvendes i stedet for test på SLC35B2 målrettede cellelinjer. (B) Celler, der mangler overfladefarvning fra proteinektodomænet, men som udtrykker BFP-fluorescens fra lentiviral transduktion, blev indsamlet. De viste celler er fra en skærm til identifikation af receptor for GABBR222. Dette tal er blevet ændret fra Sharma et al.19. Klik her for at se en større version af dette tal.

Supplementary Figure 2
Supplerende figur S2: Celleoverflade glycoprotein transskriptionomics baseret PCA plot ved hjælp af RNA-seq data fra over 1.000 kræft cellelinjer. Cellelinjer fra Cell Model Passport27 blev grupperet ved hjælp af K-betyder klyngedannelse i henhold til FPKM værdier på ~ 1.500 celleoverflade glycoproteiner. Repræsentative cellelinjer fra hver klynge er mærket. Klynge 5 bestod udelukkende af hematopoietiske cellelinjer (se supplerende tabel 2). Klik her for at se en større version af dette tal.

Supplementary Figure 3
Supplerende figur S3: Væsentlighedsscorer for KEGG-anmærkningsproteineksport og N-forbundne glycosylationsgener fra projektscores. Justerede Bayes-væsentlige score for ~ 330 cellelinjer (kolonner, ikke mærket) er afbildet for gener af protein eksport og N-forbundet glycosylation vej (X-akse). Scores højere end 0 repræsenterer betydelig udtynding i den mutante population sammenlignet med det oprindelige plasmidbibliotek. Generne kan opdeles i tre forskellige klynger, der repræsenterer forskellige niveauer af væsentlighed i cellelinjerne. Denne klyngedannelse kan bruges til at bestemme sorteringsdagen. Hvis skærmen udføres på et sent tidspunkt (dag 16), er det muligt, at gener, der vides at være væsentlige for celler (klynge 1 og 3), ikke vil blive identificeret. Klik her for at se en større version af dette tal.

Supplerende tabel 1: Rå tælle filer til og MAGeCK software genereret gene_summary filer relateret til de repræsentative genetiske skærme. Klik her for at se denne fil (Højreklik for at downloade).

Supplerende tabel 2: Gruppering af cellelinjer i overensstemmelse med ekspressionen af cellereceptorer. Klik her for at se denne fil (Højreklik for at downloade).

Discussion

En CRISPR-baseret screeningstrategi til identifikation af gener, der kodning cellulære komponenter, der er involveret i cellulære anerkendelse er beskrevet. En lignende tilgang ved hjælp af CRISPR aktivering giver også et genetisk alternativ til at identificere direkte interagerende receptorer af rekombinant proteiner uden behov for at generere store proteinbiblioteker26. Men en stor fordel ved denne tilgang er, at det gælder for interaktioner medieret af overflade molekyler indbygget vises på cellen og ikke afhænger af overekspression af receptorer, som kan påvirke bindende begærlighed af receptoren. I modsætning til andre metoder, derfor denne teknik giver ingen antagelser om den biokemiske karakter eller cellebiologi af receptorer og giver mulighed for at studere interaktioner medieret af proteiner, der normalt er vanskelige at studere ved hjælp af biokemiske tilgange, såsom meget store proteiner, eller dem, der krydser membranen flere gange eller danne komplekser med andre proteiner, og andre molekyler end proteiner såsom glycaner, gliplycoids, og fosfolipider. I betragtning af metodens genomskala har denne tilgang også den fordel, at den ikke kun identificerer receptoren, men også yderligere cellulære komponenter, der er nødvendige for den bindende begivenhed, hvilket giver indsigt i receptorens cellebiologi.

En af de vigtigste begrænsninger ved denne metode, når du bruger den til at identificere receptoren af et forældreløst protein, er det oprindelige krav om først at identificere en cellelinje, der binder sig til proteinet. Dette er ikke altid let og identificere en celle linje, der viser en bindende fænotype, der også er eftergivende til genetiske skærme kan være den tidsbegrænsende skridt for at implementere denne analyse. Nogle cellelinjer har tendens til at binde sig til flere proteiner end andre. Dette er især relevant for proteiner, der binder HS, fordi disse proteiner har tendens til at binde sig til enhver cellelinje, der viser HS sidekæder, uanset den oprindelige bindingskontekst. Derudover har vi observeret, at opregulering af syndekaner (dvs. proteoglycaner, der indeholder HS) i cellelinjer fører til øget binding af HS-bindende proteiner26. Dette kan være en faktor, der skal tages i betragtning, når du vælger cellelinjen til screening. Men også vigtigt at bemærke er, at tilsætningsstoffet binding af HS ikke forstyrrer bindingen til en bestemt receptor. Det betyder, at hvis bindingen overholdes, er det muligt, at det er medieret udelukkende af HS, fordi den binding, der er medieret af HS i denne analyse, er additiv snarere end codependent19. I et sådant scenario, heparin blokering beskrevet kan identificere en sådan adfærd uden at have behov for at udføre en fuld genetisk skærm.

En nyttig ressource til at vælge cellelinjer er Cell Model Passport, som indeholder genomforskning, transskriptioner og oplysninger om kulturtilstand for ~1.000 kræftcellelinjer27. Afhængigt af den biologiske kontekst kan celler vælges baseret på deres udtryksprofiler. For at hjælpe med udvælgelsen af cellelinjer grupperede vi ~1.000 cellelinjer i cellemodelpas i henhold til udtrykket ~1.500 præannoterede humane celleoverfladeglykoproteiner28 (Supplerende figur 2; klyngeoplysninger for hver cellelinje sammen med vækstbetingelser findes i supplerende tabel 2). Når du tester bindingen af et protein med ukendt funktion, er det nyttigt at vælge et panel af repræsentative cellelinjer fra hver klynge for at øge chancen for at dække en bred vifte af receptorer. Givet et valg, anbefales det at vælge cellelinjer, der er nemme at kultur og let at transduce. Da disse cellelinjer vil blive anvendt i genom-skala screening, er det at foretrække, at de kan dyrkes let i store mængder og er eftergivende over for lentiviral transduktion, fordi det er den mest almindeligt tilgængelige metode til levering af sgRNA for CRISPR-baseret genetisk screening i de senere trin.

Generelt udføres fænotypevalgene i en enkelt slags. Dette bestemmes dog af lysstyrken af den farvede cellepopulation sammenlignet med kontrollen. Iterative valgrunder kan vedtages for scenarier, hvor signal-støj-forholdet for den ønskede fænotype er lavt, eller når formålet med skærmen er at identificere mutanter, der har stærke fænotyper. Når du bruger en iterativ udvælgelsesmetode for FACS-baserede skærme, er det vigtigt at overveje, at sorteringsprocessen kan forårsage celledød, hovedsagelig på grund af sorteringsmaskinens store kraft. Således vil ikke alle indsamlede celler være repræsenteret i den næste runde af sortering.

Bibliotekskompleksitet er en meget vigtig faktor i udførelsen af vellykkede genetiske skærme, især for negative udvælgelsesskærme, fordi omfanget af udtynding i disse kun kan bestemmes ved at sammenligne resultater med det, der var til stede i startbiblioteket. For negative markeringsskærme er det almindeligt at vedligeholde biblioteker med en kompleksitet på 500-1.000 x. Positive valgskærme er dog mere robuste over for biblioteksstørrelser, fordi der på sådanne skærme kun forventes et lille antal mutanter at blive udvalgt til en bestemt fænotype. Derfor kan bibliotekets størrelse på den positive markeringsskærm, der er beskrevet her, reduceres til 50-100x kompleksitet uden at gå på kompromis med skærmens kvalitet. Hertil kommer, at i disse skærme er det også muligt at bruge et kontrolbibliotek for en given cellelinje på en given dag som en "generel kontrol" for alle prøver sorteret på dagen for den givne cellelinje. Dette vil reducere antallet af kontrolbiblioteker, der skal produceres og sekvenseres.

En anden vigtig overvejelse for at bruge denne tilgang er begrænsningerne ved tab af funktionsskærme i forbindelse med identifikation af gener, der er afgørende for in vitro cellevækst. Timingen af skærmene er afgørende i denne henseende, da jo længere mutantcellerne holdes i kultur, jo større er sandsynligheden for, at celler med mutationer i essentielle gener bliver ikke-levedygtige og ikke længere er repræsenteret i det mutante bibliotek. De seneste genetiske skærme, der er udført som en del af Project Score-initiativet i over 300 cellelinjer, viser, at flere gener i KEGG-annoteret proteinsekretion og N-glycosylationsvejen ofte identificeres som værende væsentlige for en række cellelinjer (supplerende figur 3)29. Dette kan tages i betragtning ved udformningen af skærme, hvis virkningen af gener, der er nødvendige for spredning og levedygtighed, skal undersøges i forbindelse med cellegenkendelsesprocessen. I dette tilfælde vil det generelt være hensigtsmæssigt at udføre skærme på et tidligt tidspunkt (f.eks. dag 9 efter overtransmuktionen). Men hvis tilgangen bruges til at identificere nogle få mål med stærke størrelseseffekter i stedet for generelle cellulære veje, kan det være hensigtsmæssigt at udføre skærme på et senere tidspunkt (f.eks. dag 15-16 eftertransduktion).

Resultaterne af screeningen er meget robuste. i otte rekombinant protein bindende skærme udført i fortiden, cellen overflade receptor var den øverste hit i hvert tilfælde19. Når man anvender denne metode til at identificere interaktionspartneren, bør man derfor forvente, at receptoren og de faktorer, der bidrager til dens præsentation på overfladen, identificeres med en høj statistisk tillid. Når skærmen er udført, og et hit er valideret ved hjælp af en enkelt gRNA knockout, yderligere opfølgninger kan udføres ved hjælp af eksisterende biokemiske metoder såsom AVEXIS4 og direkte mættet binding af renset proteiner ved hjælp af overflade plasmon resonans. Den her beskrevne fremgangsmåde gælder for alle proteiner, for hvilke det er muligt at generere en opløselig rekombinant bindingssonde.

Sammenfattende er dette en genom-skala CRISPR knockout tilgang til at identificere interaktioner medieret af celleoverflade proteiner. Denne metode kan generelt anvendes til at identificere celleveje, der kræves til cellere overfladegenkendelse i en lang række forskellige biologiske sammenhænge, herunder mellem en organismes egne celler (f.eks. neural og immunologisk genkendelse) samt mellem værtsceller og patogenproteiner. Denne metode giver et genetisk alternativ til biokemiske tilgange designet til receptor identifikation, og fordi det ikke kræver nogen forudgående antagelser om den biokemiske karakter eller cellebiologi af receptorer det har et stort potentiale for at gøre helt uventede opdagelser.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Dette arbejde blev støttet af Wellcome Trust-tilskudsnummeret 206194 tildelt GJW. Vi takker Cytometry Core facilitet: Bee Ling Ng, Jennifer Graham, Sam Thompson, og Christopher Hall for hjælp med FACS.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Anti-mouse alkaline phosphatase Sigma A4656
Blasticidin Chem-Cruz SC-204655
Blood & Cell Culture DNA Maxi Kit Qiagen 13362
BSA Sigma A9647-100G
Diethanolamine Sigma 398179
DMEM Gibco 31966-021
Dneasy Blood and Tissue kit Qiagen 69504
DynaMag-96 Side Magnet Invitrogen 12331D
HEK293T packaging cells ATCC CRL-3216
Heparin Sigma H4784-1G
KAPA HiFi HotStart ReadyMix Kapa KK2602
Lipofectamine LTX with PLUS reagent Invitrogen 15338100
MoFlo XDP cell sorter BD
Ni2+-NTA agarose beads Jena Bioscience AC-501-25
OPTI-MEM Life Technologies 31985-070
OX-68 antibody AbD Serotec MCA1022R
p-nitrophenyl phosphate Sigma 1040-506
PD-10 desalting columns GE healthcare 17085101
Polybrene Millipore TR-1003-G
Polypropylene tubes with 5 mL bed volume Qiagen 34964
Proteinase K, recombinant, PCR Grade Roche 3115879001
Puromycin Gibco A11138-03
Q5 Hot Start High-Fidelity 2× Master Mix NEB M0494L
QIAquick PCR purification kit Qiagen 28104
SCFA filter Nalgene 190-2545
Sony Cell sorter Sony
SPRI beads (Agencourt AMPure XP beads) Beckman A63881
Streptavidin-coated microtitre plates Nalgene 734-1284
Streptavidin-PE Biolegend 405204

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wright, G. J. Signal initiation in biological systems: the properties and detection of transient extracellular protein interactions. Molecular bioSystems. 5 (12), 1405-1412 (2009).
  2. van der Merwe, P. A., Barclay, A. N. Transient intercellular adhesion: the importance of weak protein-protein interactions. Trends in Biochemical Sciences. 19 (9), 354-358 (1994).
  3. Wood, L., Wright, G. J. Approaches to identify extracellular receptor-ligand interactions. Current Opinion in Structural Biology. 56, 28-36 (2019).
  4. Bushell, K. M., Söllner, C., Schuster-Boeckler, B., Bateman, A., Wright, G. J. Large-scale screening for novel low-affinity extracellular protein interactions. Genome Research. 18 (4), 622-630 (2008).
  5. Visser, J. J., et al. An extracellular biochemical screen reveals that FLRTs and Unc5s mediate neuronal subtype recognition in the retina. eLife. 4, e08149 (2015).
  6. Özkan, E., et al. An extracellular interactome of immunoglobulin and LRR proteins reveals receptor-ligand networks. Cell. 154 (1), 228-239 (2013).
  7. Martinez-Martin, N., et al. An Unbiased Screen for Human Cytomegalovirus Identifies Neuropilin-2 as a Central Viral Receptor. Cell. 174 (5), 1158-1171 (2018).
  8. Bianchi, E., Doe, B., Goulding, D., Wright, G. J. Juno is the egg Izumo receptor and is essential for mammalian fertilization. Nature. 508 (7497), 483-487 (2014).
  9. Mullican, S. E., et al. GFRAL is the receptor for GDF15 and the ligand promotes weight loss in mice and nonhuman primates. Nature Medicine. 23 (10), 1150-1157 (2017).
  10. Turner, L., et al. Severe malaria is associated with parasite binding to endothelial protein C receptor. Nature. 498 (7455), 502-505 (2013).
  11. Frei, A. P., et al. Direct identification of ligand-receptor interactions on living cells and tissues. Nature Biotechnology. 30 (10), 997-1001 (2012).
  12. Sobotzki, N., et al. HATRIC-based identification of receptors for orphan ligands. Nature Communications. 9 (1), 1519 (2018).
  13. Sharma, S., Petsalaki, E. Application of CRISPR-Cas9 Based Genome-Wide Screening Approaches to Study Cellular Signalling Mechanisms. International Journal of Molecular Sciences. 19 (4), (2018).
  14. Gebre, M., Nomburg, J. L., Gewurz, B. E. CRISPR-Cas9 Genetic Analysis of Virus-Host Interactions. Viruses. 10 (2), (2018).
  15. Zotova, A., Zotov, I., Filatov, A., Mazurov, D. Determining antigen specificity of a monoclonal antibody using genome-scale CRISPR-Cas9 knockout library. Journal of Immunological Methods. 439, 8-14 (2016).
  16. Puschnik, A. S., Majzoub, K., Ooi, Y. S., Carette, J. E. A CRISPR toolbox to study virus-host interactions. Nature Reviews. Microbiology. 15 (6), 351-364 (2017).
  17. Kerr, J. S., Wright, G. J. Avidity-based extracellular interaction screening (AVEXIS) for the scalable detection of low-affinity extracellular receptor-ligand interactions. Journal of Visualized Experiments. (61), e3881 (2012).
  18. Tzelepis, K., et al. A CRISPR Dropout Screen Identifies Genetic Vulnerabilities and Therapeutic Targets in Acute Myeloid Leukemia. Cell Reports. 17 (4), 1193-1205 (2016).
  19. Sharma, S., Bartholdson, S. J., Couch, A. C. M., Yusa, K., Wright, G. J. Genome-scale identification of cellular pathways required for cell surface recognition. Genome Research. 28 (9), 1372-1382 (2018).
  20. Wang, B., et al. Integrative analysis of pooled CRISPR genetic screens using MAGeCKFlute. Nature Protocols. 14 (3), 756-780 (2019).
  21. R Core team. A language and environment for statistical computing. , http://www.R-project.org (2013).
  22. Hart, T., et al. Evaluation and Design of Genome-Wide CRISPR/SpCas9 Knockout Screens. G3. 7 (8), 2719-2727 (2017).
  23. Kuleshov, M. V., et al. Enrichr: a comprehensive gene set enrichment analysis web server 2016 update. Nucleic Acids Research. 44 (W1), W90-W97 (2016).
  24. Crosnier, C., et al. Basigin is a receptor essential for erythrocyte invasion by Plasmodium falciparum. Nature. 480 (7378), 534-537 (2011).
  25. Kirk, P., et al. CD147 is tightly associated with lactate transporters MCT1 and MCT4 and facilitates their cell surface expression. The EMBO Journal. 19 (15), 3896-3904 (2000).
  26. Chong, Z. S., Ohnishi, S., Yusa, K., Wright, G. J. Pooled extracellular receptor-ligand interaction screening using CRISPR activation. Genome Biology. 19 (1), 205 (2018).
  27. van der Meer, D., et al. Cell Model Passports-a hub for clinical, genetic and functional datasets of preclinical cancer models. Nucleic Acids Research. 47 (D1), D923-D929 (2019).
  28. Bausch-Fluck, D., et al. A mass spectrometric-derived cell surface protein atlas. PloS One. 10 (3), e0121314 (2015).
  29. Behan, F. M., et al. Prioritization of cancer therapeutic targets using CRISPR-Cas9 screens. Nature. 568 (7753), 511-516 (2019).

Tags

Genetik CRISPR/Cas9 rekombinant proteiner celleadhæsion celleoverfladereceptor genom-skala screening ekstracellulære protein interaktioner
Identifikation af cellereceptorer ved hjælp af genome-skala CRISPR/Cas9 genetiske skærme
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Sharma, S., Wright, G. J. Cell… More

Sharma, S., Wright, G. J. Cell Surface Receptor Identification Using Genome-Scale CRISPR/Cas9 Genetic Screens. J. Vis. Exp. (160), e60803, doi:10.3791/60803 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter