Identifikation af cellereceptorer ved hjælp af genome-skala CRISPR/Cas9 genetiske skærme

Påvisning af celleoverfladeinteraktioner ved hjælp af de i øjeblikket tilgængelige biokemiske tilgange udgør stadig tekniske udfordringer. Denne protokol giver et genetisk alternativ ved hjælp af genomskala celle screening tilgang til at identificere receptor ligand interaktioner på celleoverfladen. I modsætning til de fleste andre eksisterende metoder, denne metode gør ingen antagelser om biologi receptorer.

Det giver mulighed for at identificere de interaktioner medieret af en bred vifte af celleoverflade molekyler. Celleoverflade molekyler er direkte tilgængelige for lægemidler såsom monoklonale antistoffer. Derfor kan identifikation af interaktioner medieret af disse molekyler have vigtige terapeutiske konsekvenser.

Denne metode er generelt gælder for forskere interesseret i at udforske de cellulære signalering og anerkendelse processer er i en bred vifte af biologiske sammenhænge, herunder neurale og immunologiske interaktioner samt vært patogen interaktioner. Protokollen kræver en høj gennemløbscellesorteringsmaskine og næste generations sekventeringsmaskiner. Sørg for, at disse faciliteter er tilgængelige, før protokollen startes.

Begynd med at lave otte serielle fortyndinger af de biotinylede proteinprøver i en 96-brøndplade, der sikrer, at det endelige volumen af hver fortynding er mindst 200 mikroliter, og at der medfølger en tag-only-kontrol. Lav en dobbelt plade af prøverne ved at fjerne 100 mikroliter fra hver brønd og overføre den til en ny 96-brønd plade. Medtag en tag-only protein kontrol, der vil blive brugt som en kontrol sonde i alle bindende essays.

Der tilsættes 100 mikroliter på 0,1 mikrogram pr. milliliter streptavidin-PE til brøndene i en af pladerne og 100 mikroliter fortyndingsbuffer til den anden plades brønde. Pladen inkuberes i 20 minutter ved stuetemperatur. I mellemtiden blokere brønde af streptavidin kodet plade med fortynding buffer i 15 minutter.

Når du har vasket pladen, skal du sørge for, at den er tør. Derefter overføres prøvens samlede volumen fra begge plader til de enkelte brønde i streptavidin-kodet plade, og den inkuberes i en time ved stuetemperatur. Efter inkubationen vaskes pladen tre gange med 200 mikroliter vaskebuffer.

Tilføj 100 mikroliter af mus anti-rotte Cd4d3 +4 IgG Og inkuber pladen i en anden time. Gentag vaskene. Der tilsættes 100 mikroliter af en anti-mus alkalisk fosfatasekonjugat og lad pladen være ved stuetemperatur i en time.

Derefter vaskes brøndene tre gange med vaskebuffer og en gang med fortyndingsbuffer. Forbered p-nitrophenyl phosphat på en milligram pr. milliliter i farvestof ethanolamin buffer og tilsæt 100 mikroliter til hver brønd. Efter 15 minutters inkubation måles absorbansen hver brønd ved 405 nanometer.

Brug den mindste fortynding, hvor der ikke er noget signal på pladen som den rette fortyndingsfaktor til at skabe tetramers. Inkuber streptavidin-PE og passende biotinyleret proteinfortynding i 30 minutter ved stuetemperatur. Derefter opbevares konjugerede proteiner i et lysbeskyttet rør ved fire grader Celsius indtil videre brug.

De koniske rør drejes med de behandlede prøver og kontrolprøverne ved 200 gange G i fem minutter. Fjern supernatant og fryse en af rørene ved minus 20 grader Celsius til senere brug. Pellet i det andet rør i 10 milliliter PBS med 1%BSA og bortsæt 100 mikroliter celler som en negativ kontrol på en 96-brøndplade.

Derefter tilsættes det konjugerede rekombinant protein til cellesuspensionen i det koniske rør og i 96-brøndpladen. Udfør cellefarvning i mindst en time ved fire grader Celsius på en benchtop rotor med blid rotation. Derefter pellet cellerne på 200 gange G i fem minutter og fjern supernatant.

Efter vask af cellerne to gange, re-suspendere dem i fem milliliter PBS. Strain cellerne gennem en 30 mikrometer si for at fjerne celle klynger. Derefter analysere dem med et flow Sodor.

Brug den negative kontrolprøve til at være gate for BFP-positive og PE-negative celler. Sorter derefter prøven og opsaml 500, 000 til 1 million BFP-positive og PE-negative celler i et 1,5 millilitercentrifugeringsrør. Det ømme bur vil afhænge af cellernes binding til proteinet, men normalt indsamles en til 5% af PE negative prøver.

Lad nu de sorterede celler ved centrifugering i 500 gange G i fem minutter, og fjern derefter forsigtigt supernatanten. Pellet kan opbevares ved minus 20 grader Celsius i op til seks måneder. Brug optællingsfunktionen af magi til at kortlægge sekvenser fra den usorterede og sorterede population til referencebiblioteket, hvilket vil give en rå optællingsfil.

Kør testen funktion af magi ved hjælp af rå tæller fra den usorterede kontrol prøve som kontrol og tæller fra den sorterede prøve som behandling. Åbn den genererede genoversigtsfil, og rang kolonnen pauseplacering i stigende rækkefølge. Identificer derefter hits med en falsk opdagelsesrate på mindre end punkt 0,05.

Receptoren er normalt rangeret meget ofte i den første position. Endelig bruge R eller en tilsvarende software til at plotte den robuste ranking algoritme score for positiv udvælgelse. Genomskala knockdown skærme til identifikation af den bindende partner af humane TNFSF9 og P falciparum eller H5 af humane TNFSF9 og P falciparum Rh5 blev udført i henholdsvis NCI-SNU-1 og HEC-293 celler.

Den bindende adfærd rh5 blev påvirket af både heparan sulfat og det kendte receptor BSG mens TN-FRSF-9 ikke mistede binding til sin kendte receptor TN-FSF-9. Ved præinkubation med opløselig heparin. GNA-distributionen i kontrole mutantbiblioteket afslørede, at bibliotekets kompleksitet blev opretholdt under hele eksperimentet.

Skærmenes tekniske kvalitet blev vurderet ved at undersøge fordelingen af observerede foldændringer af G-RNA’s målretning mod et referencesæt af ikke-væsentlige gener sammenlignet med fordelingen for et referencesæt af essentielle gener. Desuden viste tilsætning af pathway-niveau, at forventede væsentlige veje blev identificeret og væsentligt beriget i frafaldspopulationen. Når kontroleksempeltet sammenlignes med det oprindelige plasmidbibliotek.

Den robuste rangalgoritme eller RRA-score giver et mål, som G-RNA’er konsekvent rangeres højere end forventet. På skærmen for TNFRSF9, den øverste hit var TNFSF9, som er en kendt bindende partner. Desuden blev der også identificeret en række gener relateret til TP53-vejen.

I tilfælde af RH5 blev SLC16A1-genet ud over den kendte receptor og det gen, der kræves til fremstilling af sulferede gags, også identificeret. Screeningtilgangen er normalt meget robust, og den direkte interagerende receptor bør være højt rangeret på listen over gener beriget i denne befolkningsrækkefølge. Det er afgørende at validere de hits, der opnås fra skærmen.

Hvis interaktionen er medieret af proteiner, biokemiske tilgange designet til at studere binære Protein Protein interaktioner, for eksempel, kunne anvendes til yderligere validering undersøgelser. På grund af den upartiske genomskala karakter af denne tilgang, forventer vi, at det vil støtte i at udforske de interaktioner medieret af vanskelige at studere cellemolekyler såsom lipider, multipass membran proteiner og glycaner. Det kan også afsløre nye veje, der kræves for receptor handel og biologi.