Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

التكيف المغناطيسي للحمولة اللاحقة في أنسجة القلب المهندسة

Published: May 5, 2020 doi: 10.3791/60811
Automatic Translation
*1,2, *1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2
1Institute of Experimental Pharmacology and Toxicology, University Medical Center Hamburg-Eppendorf, 2DZHK (German Centre for Cardiovascular Research)
* These authors contributed equally

Summary

يوفر هذا البروتوكول طرقًا تفصيلية تصف تصنيع وتنفيذ منصة ضبط ما بعد التحميل المستندة إلى المغناطيسية لأنسجة القلب المهندسة.

Abstract

ومن المعروف بعد الحمل لدفع تطور كل من الحالات الفسيولوجية والقلبية المرضية. وعلى هذا النحو، فإن دراسة نتائج الدول التي تم تغييرها بعد التحميل يمكن أن تسفر عن رؤى مهمة حول الآليات التي تتحكم في هذه العمليات الحرجة. ومع ذلك، هناك حاجة حاليا ً إلى تقنية تجريبية لضبط الحمل اللاحقة بدقة في أنسجة القلب مع مرور الوقت. هنا ، يتم وصف تقنية مغناطيسية حديثة التطوير لتحقيق هذه السيطرة في أنسجة القلب المهندسة (EHTs). من أجل إنتاج EHTs تستجيب مغناطيسيا (MR-EHTs)، يتم تركيب الأنسجة على وظائف سيليكون جوفاء، وبعضها يحتوي على مغناطيس دائم صغير. مجموعة ثانية من المغناطيس الدائم هو الصحافة تناسب في لوحة الاكريليك بحيث يتم توجيهها مع نفس القطبية ومحوري الانحياز مع المغناطيس آخر. لضبط ما بعد الحمل، يتم ترجمة هذه اللوحة من المغناطيس نحو (أعلى بعد الحمل) أو بعيدا (أقل بعد الحمل) من المغناطيس آخر باستخدام مرحلة بيزوكهربائية مزودة الترميز. برنامج التحكم في الحركة المستخدمة لضبط تحديد المواقع المرحلة يسمح لتطوير أنظمة الحمل بعد المعرفة من قبل المستخدم في حين أن الترميز يضمن أن المرحلة يصحح لأي تناقضات في موقعها. يصف هذا العمل تصنيع ومعايرة وتنفيذ هذا النظام لتمكين تطوير منصات مماثلة في مختبرات أخرى في جميع أنحاء العالم. يتم تضمين النتائج التمثيلية من تجربتين منفصلتين لتجسيد مجموعة الدراسات المختلفة التي يمكن إجراؤها باستخدام هذا النظام.

Introduction

بعد التحميل هو الحمل الانقباضي على البطين بعد أن بدأت في إخراج الدم1. أثناء تطور القلب ، فإن الحمل التالي المناسب له أهمية حاسمة لنضوج عضلة القلب2. في مرحلة البلوغ، يمكن أن يؤدي انخفاض مستويات الحمل العقبي البطيني (على سبيل المثال، في المرضى طريح الفراش الذين يعانون من إصابة الحبل الشوكي عالية المستوى3 أو في حالات خاصة جدا مثل رحلة الفضاء4)إلى انخفاض في القلب. على العكس من ذلك، يمكن أن يؤدي ارتفاع الحمل اللاحقة إلى تضخم القلب5. في حين أن تضخم القلب في الرياضيين التحمل أو النساء الحوامل يعتبر مفيدًا وفسيولوجياً ، فإن تضخم الدم المرتبط بارتفاع ضغط الدم الشرياني على المدى الطويل أو تضيق الصمام الأبهري الشديد ضار لأنه يهيئ واحدًا لعدم انتظام ضربات القلب وفشل القلب6. على الرغم من أن معدل الوفيات لمدة 5 سنوات لمرضى قصور القلب قد انخفض من حوالي 70٪ في 1980s6 إلى 40-50٪7 في الوقت الحاضر، لا تزال هناك حاجة كبيرة لخيارات العلاج العلاجية الجديدة لهذه الحالة السائدة للغاية (حاليا 2.2٪ من السكان في العالم الغربي)8.

من أجل التحقيق في الآليات الجزيئية للتضخم القلبي المرضي واختبار الاستراتيجيات الوقائية أو العلاجية لعلاج هذا المرض ، في الجسم الحي نماذج من الحمل اللاحقة تمتطويرها 9،10،11،12. في حين أن هذه النماذج قد قدمت رؤى مفيدة في آثار الحمل اللاحقة على أداء البطين، فإنها لا تسمح للسيطرة الدقيقة على حجم ما بعد الحمل. بدلا من ذلك, في المختبر دراسات ما بعد الحمل الذي أجريت على قلوب مكوس واستعدادات العضلات تسمح للسيطرة الدقيقة على تحميل الأنسجة, ولكن هذه النماذج ليست مواتية للدراسات الطولية13,,14,,15.

للتغلب على هذه القضايا، وضعنا نموذجا في المختبر من ارتفاع بعد الحمل في أنسجة القلب المهندسة (EHTs)16،17. هذا النموذج هو تنسيق الثقافة 3 الأبعاد لخلايا قلب الفئران جزءا لا يتجزأ من مصفوفة الفيبرين علقت بين وظائف سيليكون مجوفة مرنة. هذه الأنسجة فاز تلقائيا (ضد مقاومة وظائف السيليكون) وأداء العمل auxotonic. لقد قمنا بزيادة الحمل اللاحقة المطبقة على EHTs بعامل 12 في التجارب السابقة عن طريق إدخال الأقواس المعدنية الجامدة في وظائف السيليكون الجوفاء لمدة أسبوع واحد. أدى هذا إلى العديد من التغييرات ، وهي سمة من سمات تضخم القلب المرضي18،19،20: تضخم عضلة القلب ، النضوب الجزئي ، انخفاض في قوة العقد ، ضعف استرخاء الأنسجة ، إعادة تنشيط برنامج جين الجنين ، تحول استقلابي من أكسدة الأحماض الدهنية إلى الجليكوز اللاهوائي ، وزيادة في التليف. على الرغم من أن هذا الإجراء قد استخدمت بنجاح في العديد من الدراسات17،21،22، لديها بعض العيوب. هناك دولتان فقط، منخفضة أو عالية جداً (12 مرة) بعد الحمل، ويتطلب الإجراء التعامل اليدوي مع EHTs، مما يحد من مرونته الزمنية ويشكل خطر التلوث.

في الآونة الأخيرة، ليونارد وآخرون استخدام تقنية مماثلة لتعديل الحمل اللاحقة في EHTs المستزرعة على وظائف السيليكون23. تم وضع أقواس ذات أطوال مختلفة حول الجزء الخارجي من المشاركات لتقييد حركة الانحناء الخاصة بها. أفاد مؤلفو هذه الدراسة أن زيادة فريدة من صغيرة إلى متوسطة في تطوير القوة المعززة ونضوج EHTs المشتقة من iPS البشري ، في حين أن الأحمال الأعلى أدت إلى حالة مرضية. ومع ذلك ، على غرار نظامنا الخاص ، تسمح هذه التقنية فقط بزيادات مفردة في الحمل اللاحقة ، والتي يملي هاوية حجمها طول الأقواس. على هذا النحو ، لا يمكن إجراء تعديلات دقيقة في الحمل اللاحقة ، والتعديلات في التحميل اللاحقة بمرور الوقت ، وأنظمة التحميل الدقيقة مع هذه التقنيات.

هنا، ونحن نقدم بروتوكول لنظام التي يمكن استخدامها لتعديل ما بعد المقاومة، أي بعد حمولة من EHTs مغناطيسيا24. تسهل هذه المنصة ضبط الحمل اللاحقة ، وتمكن أنظمة التحميل اللاحقة المعرفة من قبل المستخدم ، وتضمن عقم EHT.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. إعداد منصة ضبط ما بعد التحميل

ملاحظة: الخطوات التي ينطوي عليها هذا الجزء من البروتوكول ليست حساسة للوقت.

  1. تصنيع رفوف السيليكون المتجاوبة مغناطيسيا
    ملاحظة:     هذه الرفوف بمثابة منصة الثقافة لEHTs. يتم تعليق كل EHT بين اثنين من وظائف السيليكون، والتي تضفي بعد الحمل على الأنسجة. ترتبط درجة التحميل اللاحقة مباشرة بصلابة هذه الوظائف. لتمكين ضبط ما بعد التحميل المغناطيسي ، يجب أن تكون بعض المشاركات مستجيبة مغناطيسيًا.
    1. الحصول على 24-بئر لوحة رفوف متوافقة من وظائف السيليكون (الأبعاد الواردةفي الشكل التكميلي 1 ). تم إنتاج الرفوف المستخدمة في هذه الدراسة من قبل مورد سلع السيليكون التجارية وفقًا لهذه الأبعاد باستخدام السيليكون مع صلابة الشاطئ من 40.
    2. تحديد قطبية مغناطيس آخر (على سبيل المثال، د = 0.5 ملم، ح = 2.0 ملم؛ انظر جدول المواد)عن طريق وضعها على مغناطيس دائم أكبر.
    3. الحفاظ على قطبية ثابتة، وتليين المغناطيس بالماء وإدراجها، واحدا في وقت واحد، في المشاركات أبعد من رفوف السيليكون.
      ملاحظة: إذا حاولت إدراج أكثر من مغناطيس واحد في وقت واحد ، فإن المقاومة الإضافية تجعل من الصعب دفع المغناطيس إلى الجزء السفلي من المنشور.
    4. استخدام قطعة حادة من أسلاك الأسنان الفولاذ المقاوم للصدأ (د - 0.4 ملم، انظر جدول المواد)لدفعها بعناية إلى الجزء السفلي من تجويف آخر أجوف. يمكنك تكديس ما يصل إلى خمسة مغناطيسات في كل مشاركة.
    5. استخدام (مستديرة الأنف) كماشة لثني أسلاك الأسنان الفولاذ المقاوم للصدأ (د = 0.4 ملم، انظر جدول المواد)في الأقواس 11.25 ملم واسعة و 15 ملم طويلة. استخدام قواطع الأسلاك لقطع الأقواس وملف لتنعيم سطح القطع. لضمان تحقيق الأبعاد الصحيحة ، يمكن للمرء استخدام رقصة عصامي للمساعدة في الانحناء الأسلاك.
      ملاحظة: ويمكن أيضا أن يتحقق شل ما بعد من قبل الأقواس المصنوعة من مواد أخرى، طالما أنها غير المغناطيسي ة وجامدة.
    6. تليين الأقواس بالماء وإدراجها في رف السيليكون، وتحديد الثانية والثالثة إلى أبعد وظيفة في هذه العملية (انظر الشكل 1 لإعداد رف سيليكون كاملة).
      ملاحظة: اختياريا، من أجل تكييف صلابة خط الأساس من وظائف التحكم لتتناسب مع تلك من الوظائف تستجيب مغناطيسيا، يمكن إدراج شظايا من قضيب جولة الستايرين (انظر جدول المواد)في الوظائف الفارغة (تلك التي لا يوجد لها دعامة أو مغناطيس).
    7. دع الرفوف تقف لمدة 1-2 أيام للسماح لأي ماء متبقي بالجفاف.
    8. عندما تكون المشاركات جافة ، فقم بختم الثقوب في الجزء العلوي من مشاركات السيليكون المجوفة التي تحتوي على المغناطيس باستخدام قطرة من الغراء السيليكون.
  2. جهاز ضبط التحميل التالي
    ملاحظة:     كما يتم نقل المغناطيس في جهاز ضبط ما بعد الحمل نحو أو بعيدا عن تلك الموجودة في وظائف السيليكون، والقوى المغناطيسية جذابة زيادة أو نقصان وفقا لذلك، مما أدى إلى تغيير صلابة وظائف السيليكون. وتتحقق هذه الحركة باستخدام مرحلة بيزوكهربائية. نظرًا للطبيعة النموذجية لجهاز ضبط الحمل التالي ، لن يتم توفير إرشادات تفصيلية خطوة بخطوة حول كيفية تكراره. بدلاً من ذلك، يتم تفصيل الإرشادات المعممة لإنشاء جهاز ضبط ما بعد التحميل مماثلة هنا.
    1. الحصول على محرك خطي كهربائي كهربائي كهربائي للغاية لتمكين الترجمة الرأسية للوحة المغناطيس نحو وبعيد عن EHTs (انظر جدول المواد).
      ملاحظة: ويقترح بشدة أن يكون هذا المحرك مزودة الترميز الخطي لتصحيح لتحديد المواقع المرحلة.
    2. وضع مجموعة من المغناطيس الدائم داخل حامل غير المغناطيسي بحيث يتم محاذاة محوري مع المغناطيس آخر عندما وضعت مباشرة تحتها. هنا ، كانت مغناطيسات أسطوانية كبيرة (د = 13 مم ، ح = 14 مم ؛ انظر جدول المواد)صالحة للضغط داخل لوحة بلاستيكية أكريليك ("لوحة المغناطيس").
    3. إرفاق حامل المغناطيس إلى المرحلة بيزوكهربائية باستخدام مادة غير المغناطيسية. ويمكن تحقيق ذلك باستخدام قطعة على شكل حرف L من الألومنيوم (انظر الشكل 2).
    4. إنشاء إطار يمكن أن يضم مكونات جهاز ضبط التحميل اللاحقة. كحد أدنى، يجب أن يكون لهذا الهيكل موقع لتركيب المرحلة الكهروضوئية عمودياً، فضلاً عن إطار جامد لوضع لوحة 24 بئراً.
      ملاحظة: ويقترح أن يكون موقع هذا الجبل قابلاً للتعديل في المستوى الأفقي من أجل السماح بإجراء تعديلات في المحاذاة المحورية بين مجموعتي المغناطيس. تم استخدام نظام محركات الأقراص الميكانيكية لتحقيق هذه القدرة على المناورة في النظام المعروض(الشكل 3). تم تصميم جهاز ضبط ما بعد التحميل الموصوف هنا ليكون متوافقًا مع نظام تحليل عقد EHT (انظر جدول المواد). وعلى هذا النحو، اقتصرت أبعاده على 29 سم في العرض، و 29 سم في العمق، و 16 سم في الارتفاع لتناسب داخل هذا النظام.
    5. لتمكين التحليل المرئي للأنسجة، قم بتثبيت مصدر ضوء داخل جهاز ضبط التحميل التالي. هنا ، تم استخدام مجموعة من المصابيح(الشكل 4)لإلقاء الضوء على EHTs من الأسفل(الشكل 5).
  3. معايرة نظام ضبط ما بعد التحميل
    ملاحظه:    من أجل زيادة بالضبط EHT بعد التحميل إلى القيمة المطلوبة، والعلاقة بين تباعد المغناطيس وصلابة ما بعد الناتجة سوف تحتاج إلى تحديد.
    1. قياس أقرب(ددقيقة)وأبعد(دماكس)تباعد المغناطيس ممكن في الإعداد الخاص بك. هذه المسافات سوف تملي الحد الأقصى والحد الأدنى من الأحمال اللاحقة التي يمكن تحقيقها.
      ملاحظة: الجزء السفلي من لوحة الثقافة سوف تمنع الاتصال المباشر بين لوحة المغناطيس والوظائف سيليكون تستجيب مغناطيسيا.
    2. إنتاج مجموعة من الأوزان غير المغناطيسية وتركيبها على سلسلة لتكون بمثابة اختبار الأحمال.
    3. تحديد أوزان أحمال الاختبار باستخدام مقياس رفيع وتسميتها وفقًا لهذا الوزن. هنا، تم استخدام ستة أوزان مختلفة الزجاج الاكريليك تتراوح بين 30 ملغ إلى 200 ملغ.
      ملاحظة: حدد الأوزان التي هي ثقيلة بما يكفي لثني آخر، ولكن ليست ثقيلة بحيث أنها ثني آخر أكثر من بضعة ملليمترات. يضمن استخدام عدد أكبر من أحمال الاختبار أن المعايرة أكثر دقة ولكنها ستكون أيضًا أكثر استهلاكًا للوقت.
    4. قم بتركيب أحد رفوف السيليكون رأسيًا (باستخدام مواد غير مغناطيسية) ، بحيث يتم توجيه مشاركات السيليكون المستجيبة مغناطيسيًا أفقيًا.
    5. قم بتركيب أحد مغناطيسات اللوحة ("مغناطيس المعايرة") على مرحلة خطية سفر أفقيًا بحيث يتم محاذاتها بشكل محوري مع المنشور المستجيب مغناطيسيًا.
    6. ضع مغناطيس المعايرة مسافة محددة من منشور السيليكون المستجيب مغناطيسيًا باستخدام المرحلة الأفقية (ويفضل أن يبدأ من مسافة تساوي الحد الأقصى لتباعد المغناطيس الذي يمكن تحقيقه بواسطة جهاز ضبط الحمل اللاحق).
    7. ضع كاميرا (على سبيل المثال، انظر جدول المواد)إلى جانب هذا الإعداد من أجل أن تكون قادرة على تسجيل انحراف المنشور بصريًا تحت تأثير أحمال الاختبار.
      ملاحظة: ويقترح أن المستخدم استخدام كاميرا مع دقة لا تقل عن 2 ميغابكسل لضمان التحديد الدقيق للانحراف آخر.
    8. التقاط صورة للمشاركة في غياب أي أوزان لاستخدامها كمرجع لموقف الوظيفة "المحايدة".
    9. دون تغيير منظور الكاميرا ، نعلق واحدة من الأحمال إلى نهاية آخر السيليكون والتقاط صورة للآخر الانحناء تحت تأثير الوزن.
    10. كرر هذا القياس لجميع الأوزان.
    11. تحديد بصريا انحراف وظيفة السيليكون الناجمة عن قوة الجاذبية من كل وزن.
    12. رسم بياني لانحراف منشور السيليكون(x، على المحور س) مقابل قوة الجاذبية لكل وزن اختبار(ملغ، على المحور ص). وينبغي أن يسفر ذلك عن علاقة خطية بين القوة والانحراف.
      ملاحظة: إذا كانت البيانات غير خطية، قد يشير ذلك إلى أن المنشور خارج نطاقانحرافه الخطي، أي أن الأوزان المستخدمة كانت ثقيلة للغاية.
    13. رسم دالة انحدار خطية تمر عبر (0,0) والبيانات المكتسبة (انظر الشكل 6A للحصول على أمثلة). ميل هذه الوظيفة(ملغ = KX)هو صلابة ك من وظيفة السيليكون تستجيب مغناطيسيا في تباعد المغناطيس اختبارها.
    14. كرر هذه الخطوات في عدة تباعد بين دماكس وددقيقة. هنا ، تم تحليل انحرافات في تسعة مواقع مغناطيس مختلفة تتراوح بين ~ 31 ملم إلى ~ 5 ملم.
    15. تحديد صلابة قاعدة وظيفة سيليكون تستجيب مغناطيسيا في غياب مغناطيس المعايرة باستخدام نفس التقنية.
    16. حدد أيضًا صلابة منشور تحكم متنقل غير مستجيب مغناطيسيًا باستخدام نفس التقنية.
    17. رسم قيم k الناتجة ضد مسافات المغناطيس المعنية. هذا يجب أن تسفر عن علاقة الأسية السلبية.
    18. رسم دالة انحدار من خلال هذه القيم. على سبيل المثال، استخدم الملاءمة غير الخطية | وظيفة الاضمحلال من مرحلة واحدة في برنامج التحليل (انظر جدول المواد). تصف وظيفة الانحدار هذه العلاقة بين تباعد المغناطيس والتحميل التالي (انظر الشكل 6B على سبيل المثال).

2. EHT جيل والثقافة

ملاحظة: وقد وصفت EHT الجيل والثقافة بقدر كبير من التفصيل في مادة أخرى25. ولذلك، فإننا لن نغطي هذه الجوانب إلا بإيجاز في بروتوكولنا. يرجى تنفيذ الخطوات التالية في ظل ظروف عقيمة، والالتزام بممارسات ثقافة الخلايا الجيدة.

  1. EHT جيل
    1. اغمر رفوف السيليكون التي تم إعدادها مسبقًا في حاوية مليئة بالإيثانول بنسبة 70٪ لمدة 20 دقيقة على الأقل.
      تنبيه: لا autoclave وظائف السيليكون بعد الحمل قابل للتعديل لتعقيمها كما يمكن أن تضر درجات الحرارة العالية المغناطيس الدائم.
    2. جلب هذه الحاوية في مجلس الوزراء السلامة البيولوجية، وشطف رفوف 2x مع الماء المعقم، والسماح لهم الهواء الجاف.
      ملاحظة: وللحد من احتمال حدوث تلوث، ينبغي أن تتم هذه العملية في نفس خزانة السلامة البيولوجية التي ستستخدم فيما بعد لإلقاء الألغام البرية.
    3. الحصول على (والذوبان إذا لزم الأمر) خلايا البطين قلب الفئران الوليدية أو hiPSC (الخلايا الجذعية المستحثة البشرية متعددة القدرات) المشتقة من القلب (المتاحة تجاريا أيضا) وإعداد مزيج إعادة تشكيل EHT وفقا للجدول 1.
    4. Pipet 1.5 مل من محلول agarose الدافئ 2٪ في أقصى اليسار 4 آبار من لوحة الثقافة 24 بئرا وإدراج فورا فاصل البولي تترافلوروإيثيلين (PTFE) (انظر جدول المواد)في محلول agarose السائل.
    5. كرر الخطوة السابقة للآبار المتبقية 20 داخل لوحة الثقافة.
    6. بعد السماح لagarose لترسيخ ~ 10 دقيقة، وإزالة بعناية الفواصل PTFE.
      ملاحظة: الاغاروز يتحول العكر عندما يكون قد توطد.
    7. إدراج وظائف رفوف السيليكون الحساسة مغناطيسيا في فراغات agarose التي تنتجها الفواصل PTFE.
    8. Pipet 100 μL من مزيج إعادة تشكيل في 3 μL aliquot من 100 mU / L حل thrombin. مابيت صعودا وهبوطا مرتين لخلط ونقل الخليط بسرعة في الفراغ داخل قالب agarose الأولى على لوحة الثقافة.
    9. كرر الخطوة السابقة للقوالب الـ 23 المتبقية ، باستخدام تلميح pipet جديد لكل EHT.
      ملاحظة: مزيج بلطف الدستور مزيج كل 6-8 EHTs من أجل منع الترسيب الخلايا.
    10. تخزين لوحة 24 بئر في حاضنة (37 درجة مئوية، 7٪ CO2،40٪ O2)لمدة 90 دقيقة. في غضون ذلك، قم بإعداد وسيط EHT من خلال استكمال وسيط النسر المعدل في دولبككو (DMEM) مع مصل حصان 10٪، 1٪ من البنسلين/ العقديات، 10 ميكروغرام/مل الأنسولين و33 ميكروغرام/مل aprotinin.
    11. إضافة 500 ميكرولتر من المتوسط EHT الحارة إلى كل بئر.
    12. تخزين لوحة 24 بئر في حاضنة (37 درجة مئوية، 7٪ CO2،40٪ O2)لمدة 30 دقيقة. خلال هذا الوقت، قم بإعداد لوحة 24 بئر ثانية مع 1.5 مل من متوسط EHT في كل بئر ووضعها في الحاضنة.
    13. قم بإزالة رفوف السيليكون الحساسة للمغناطيس بعناية مع EHTs المدلى بها حديثًا عليها من قوالب agarose ونقلها إلى اللوحة الثانية ذات الـ 24 بئرًا.
  2. ثقافة EHT
    ملاحظة:     بعد صب الأنسجة، تغيير المتوسطة ثلاث مرات في الأسبوع: في أيام الاثنين والأربعاء والجمعة.
    1. للحصول على تغيير متوسط، pipet 1.5 مل من متوسط EHT الطازجة لكل بئر في لوحة ثقافة جديدة 24 بئر ووضع هذه اللوحة داخل الحاضنة في 37 درجة مئوية، 7٪ CO2،و 40٪ O2 لمدة 30 دقيقة على الأقل.
    2. نقل رفوف السيليكون من لوحة 24 جيدا القديمة إلى لوحة جديدة تحت غطاء ثقافة الخلية.
    3. تخزين لوحات EHT مغلقة في حاضنة في 37 درجة مئوية، 7٪ CO2،و 40٪ O2.

3. بعد اختبار تعديل التحميل

ملاحظة: الخطوات البروتوكولية التالية خاصة بالمحرك الكهربائي بيزوكهربائي ومنصة تحليل العقد البصري المدرجة في جدول المواد.

  1. إعداد جهاز ضبط التحميل التالي للتجارب
    1. لقياس آثار التلاعب بعد التحميل على عقد EHT، قم بفصل وإزالة نظام الإضاءة من المقصورة الأعمق لمنصة تحليل العقد البصري وأدخل جهاز ضبط الحمل اللاحقة بما في ذلك مصدر الضوء.
    2. تثبيت برنامج التحكم في الحركة المرحلة (انظر جدول المواد)على الكمبيوتر الذي سيتم استخدامه لتشغيل جهاز ضبط ما بعد التحميل.
    3. قم بتوصيل محرك المرحلة الكهروضوئية بوحدة تحكم الحركة (انظر جدول المواد)،ووحدة تحكم الحركة بالكمبيوتر. تأكد من أن وحدة تحكم الحركة متصلة أيضًا بمصدر طاقة.
      ملاحظة: هناك مصباحان على وجه وحدة تحكم الحركة. عند الاتصال بالطاقة، تومض الأضواء باللون الأحمر لبضع ثوانٍ. أثناء التشغيل، يبقى الضوء العلوي أخضر بينما يجب أن يتحول الضوء السفلي إلى اللون الأحمر فقط في حالة حدوث خطأ.
    4. ضع لوحة ثقافة فارغة 24 بئرًا على حامل اللوحة في الجزء العلوي من جهاز ضبط الحمل التالي.
    5. قم بمحاذاة لوحة الثقافة الفارغة بصريًا مع لوحة المغناطيس أدناه باستخدام نظام محرك الأقراص الميكانيكي XY المرفق بالجبل.
  2. تشغيل جهاز ضبط ما بعد التحميل
    1. بدء تشغيل برنامج منصة وحدة تحكم الحركة.
    2. قم بتوصيل البرنامج بمحرك مرحلة بيزو عن طريق تحديد المنفذ المعين كمنفذ مرحلة أثناء تثبيت برنامج التحكم في الحركة ثم انقر فوق زر المنفذ المفتوح.
      ملاحظة: بعد إكمال هذه الخطوة، يجب تعيين المنفذ كـ "مفتوح" ويظهر في مربع أخضر.
    3. انتقل إلى لوحة النظام. حدد الحلقة المفتوحة في القائمة المنسدلة الحلقة.
    4. نقل لوحة المغناطيس يدويا إلى أعلى موقف لها، أي أقرب مغناطيس ممكن تباعد ددقيقة. لوحة المغناطيس يجب أن تجعل الاتصال مع جبل لوحة الثقافة.
    5. اذهب إلى لوحة الحركة. انقر فوق الزر صفر لإعادة تعيين الموضع الحالي لمرحلة بيزو إلى 0 مم.
    6. نقل لوحة المغناطيس يدويا إلى أدنى موقف ممكن. دوِّن موضع الترميز (المشار إليه في لوحة الحركة بواسطة Enc)لتحديد نطاق الحركة لمحرك المرحلة البيزوكهربائية.
    7. تعيين حدود السفر في لوحة النظام إلى القيم ضمن نطاق الحركة المحددة في الخطوة السابقة. وهذا يمنع لوحة المغناطيس من الاصطدام لوحة الثقافة أو الجزء السفلي من جهاز ضبط ما بعد التحميل.
    8. مرة أخرى، حرك لوحة المغناطيس إلى أعلى موضع لها وانقر على زر الصفر.
    9. انتقل إلى لوحة النظام وتغيير وضع حلقة التغذية المرتدة إلى حلقة مغلقة. يضمن القيام بذلك أن المرحلة سيتم تصحيح أية أخطاء في تحديد المواقع.
    10. انقر فوق الزر حفظ في مربع حفظ المعلمات لتخزين هذه الإعدادات في النظام.
    11. ضع لوحة ثقافية 24 بئرًا تحتوي على EHTs على رفوف السيليكون المستجيبة مغناطيسيًا على جبل لوحة الثقافة.
    12. لحساب تباعد المغناطيس اللازم لتحقيق الحمل التالي المطلوب، حل وظيفة الانحدار غير الخطي من الخطوة 1.3.19 لمعلمة تباعد المغناطيس د. على سبيل المثال، إذا Equation 1 كانت المعادلة هي: ، d كونها تباعد المغناطيس (في مم) اللازمة لتحقيق k بعد التحميل المطلوب في mN / مم ، فإن تباعد المغناطيس من 12.12 ملم سيكون من الضروري تحقيق حمولة لاحقة من 5 ملون / مم.
    13. طرح ددقيقة من تباعد المغناطيس المحسوب د. والنتيجة هي المسافة لوحة المغناطيس للسفر من موقفها صفر لتحقيق ما بعد المطلوب.
    14. اكتب هذه القيمة في حقل إدخال الموضع المستهدف 1 في لوحة الحركة وانقر فوق الانتقال لضبط التحميل التالي لEHTs إلى القيمة المحسوبة.
  3. اختياري: برمجة المرحلة لنظام ما بعد التحميل الفاصل الزمني
    ملاحظة:     يصف المقطع السابق كيفية برمجة المرحلة للانتقال إليها والبقاء في موضع واحد. ومع ذلك، فمن الممكن أيضاً سلسلة أوامر مختلفة معاً في برنامج لتحقيق تسلسل تنفيذها تلقائياً من الاقتراحات، والتي قد تتكرر على حلقة مستمرة. للحصول على تعليمات أكثر تفصيلاً فيما يتعلق ببرنامج منصة وحدة تحكم الحركة ، راجع دليل التشغيل المقدم من الشركة المصنعة للمرحلة.
    1. بعد إعداد جهاز ضبط التحميل التالي كما هو موضح في المقطع السابق، افتح لوحة الأوامر. اكتب الأمر 1PGM1 واضغط على إدخال لبدء تسجيل برنامج.
    2. لإنشاء برنامج ، على سبيل المثال ، سيسبب المرحلة الكهروضوئية لنقل 30 مم من موضع الصفر (بعيدًا عن EHTs) والعودة بعد 40 s ، أدخل سلسلة الأوامر التالية: 1MVA30 → 1WST → 1WTM4000 → 1MVA0 → 1WST
    3. استخدم الأمر 1END لاختتام تسجيل برنامج وحفظه.
    4. استخدم الأمر 1EXC1 لتنفيذ البرنامج المسجل.
    5. للحفاظ على تشغيل البرنامج على حلقة مستمرة، أدخل 1PGL1، متبوعاً الأمر 1EXC1.
    6. لإنهاء برنامج حلقات، أدخل الأمر 1EST.
      ملاحظة: يحتوي الجدول 2 على بعض الأوامر المفيدة لتجارب تعديل التحميل اللاحقة. يمكن العثور على قائمة كاملة من الأوامر المتاحة لهذا النظام في الدليل المرجعي لنظام التحكم في الحركة وحدات.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

المغناطيس آخر صلابة القياس الكمي
تم تركيب منشور سيليكون سريع الاستجابة مغناطيسيًا أفقيًا في وضع ثابت ، وتم وضع مغناطيس معايرة محاذي بشكل محوري على عدة مسافات محددة ("تباعد المغناطيس") من هذا المنشور. تم تعليق أحمال الاختبار ذات الوزن المعروف من نهاية منشور السيليكون ، مما تسبب في الانحناء. تم قياس هذا الانحراف بشكل بصري. لوحظت علاقة خطية بين قوة الجاذبية من الحمل الاختبار وانحراف ما بعد الناتجة في جميع المسافات المغناطيس(الشكل 6A). اتبعت قيم التصلب المستمدة من هذه العلاقات الخطية اتجاهًا أسيًا سلبيًا مع زيادة تباعد المغناطيس(الشكل 6B).

زيادة التحميل التالي stepwise
تم استزراع EHTs التحكم والاستجابة المغناطيسية (MR-EHTs) المنتجة من قلوب الفئران في غياب الحمل المغناطيسي بعد (0.6 مل/مم لأنسجة التحكم و 0.91 مل/مم لMR-EHTs) حتى تم التوصل إلى هضبة في قوة العقد. في هذا اليوم (24 يوما بعد صب EHT) ، MR-EHTs والسيطرة EHTs كان لها قوى متوسط مماثل (0.29 mN مقابل 0.22 mN). وخلال الأسبوع التالي، زاد الحمولة اللاحقة التي مورست على أجهزة MR-EHTs تدريجياً من 0.91 إلى 6.85 ملون/مم، في حين ظل الحمل التالي للتحكم EHTs ثابتاً. زاد متوسط قوة العقد مع زيادة الحمولة اللاحقة حتى 0.95 mN ، مما يمثل زيادة في القوة بمقدار 3 أضعاف مقارنة بمتوسط القيمة (0.29 mN) المقيسة للتحكم EHTs(الشكل 7A). من ناحية أخرى، انخفض انحراف ما بعد مقارنة مع الأنسجة السيطرة. في اليوم الأخير من الثقافة ، كان متوسط الانحراف الذي تم قياسه لMR-EHTs 0.11 مم فقط مقارنة مع 0.48 مم للتحكم EHTs(الشكل 7B). منذ اليوم 27 فصاعداً، كان معدل إنتاج القوة ومعدل اضمحلال القوة أعلى في MR-EHTs منه في EHTs السيطرة في حين لم يكن هناك سوى زيادة عابرة في العمل على مدى الأيام 25-28(الشكل التكميلي 2).

نظام الفاصل الزمني بعد التحميل
تم استزراع EHTs الجرذان على وظائف السيليكون المستجيبة مغناطيسيًا (MR-EHTs) في حمولة ضئيلة من 0.91 mN/mm حتى تم الوصول إلى هضبة في قوة العقد. من هذا اليوم (17 يوما بعد صب EHT) فصاعدا، MR-EHTs خضع نظام بعد التحميل لمدة 7 أيام التي عرضت EHTs لدورات من الأحمال اللاحقة بالتناوب بين 0.91 و 6.85 مل /مم(الشكل 8A). تم الاحتفاظ بالحمولة اللاحقة من EHTs التحكم ثابت عند 0.60 مل/مم على مدى كامل مدة الثقافة. بعد هذا التدخل، ارتفع متوسط القوى لMR-EHTs بنسبة 12.0٪ مقارنة باليوم 17، في حين أن تلك التي تقاس للسيطرة EHTs فقط بنسبة 1.5٪ على نفس الإطار الزمني(الشكل 8B). غير أن هذه الاختلافات لم تكن ذات دلالة إحصائية. وعلاوة على ذلك، لم يتم قياس أي اختلافات كبيرة في معدل إنتاج القوة، ومعدل اضمحلال القوة، والعمل المتعاقد(الشكل التكميلي 3). وهذا يعني أن نظام التحميل التالي المحدد لم يكن وسيلة فعالة لزيادة انكماش EHT.

Figure 1
الشكل 1: تجميع رفوف السيليكون تستجيب مغناطيسيا. (أ)عرض متعامدة و(B)عرض مقطعي لرفوف سيليكون مُجمّعة بشكل مغناطيسي تحتوي على خمسة مغناطيسات. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: لوحة المغناطيس. صورة للوحة المغناطيس وقوس المرفق. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: نظام القيادة الميكانيكية. صورة فوتوغرافية تظهر نظام محركات الأقراص الميكانيكية المستخدمة لضبط الموضع الأفقي لللوحة 24-جيدا فيما يتعلق لوحة المغناطيس. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 4
الشكل 4: لوحة LED. صورة للوحة LED المستخدمة لإلقاء الضوء على EHTs لتحليل العقد البصري. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 5
الشكل 5: تم تجميعها بالكامل بعد تحميل ضبط الجهاز. صورة لجهاز ضبط الحمولة اللاحقة المجمع بالكامل بما في ذلك لوحة LED. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 6
الشكل 6: التحديد البصري لصلابة ما بعد. (أ)تم تقييم انحراف وظيفة سيليكون تستجيب مغناطيسيا في وجود مغناطيس المعايرة الخارجية وتحت تأثير خمسة أوزان اختبار في تسعة تباعد المغناطيس المحدد (خمسة يظهر على سبيل المثال). (ب)العلاقة المحددة بين تباعد المغناطيس وتصلب آخر. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 7
الشكل 7: استجابة العقد من EHTs إلى زيادة تدريجية في الحمل اللاحقة. قياسات التعاقد من EHTs التحكم (الخط الأسود) وEHTs المستزرعة على الوظائف المتجاوبة مغناطيسيا (MR-EHTs؛ الخط الأزرق) على مدى فترة الثقافة من 31 يوما. (أ)كان لدى MR-EHTs قوات انكماش ية متوسطة أعلى قليلاً من السيطرة على EHTs في ظل ظروف خط الأساس. من اليوم 25 على، ومع ذلك، تم تضخيم هذا الفرق مع زيادة التحميل اللاحقة. (ب)كان انحراف آخر مماثلة بين المجموعتين حتى اليوم 27. في الماضي بعد تحميل القيم من 3.5 mN / مم ، وانحراف آخر لMR - EHTs انخفض بشكل كبير. هنا ، ن = 10 MR - EHTs و n = 10 تم تحليل EHTs التحكم عن طريق تركيب نموذج مختلط (REML = الحد الأقصى من احتمال) واختبار المقارنة المتعددة في Sidak. تمثل أشرطة الخطأ في الرسوم البيانية الخطأ القياسي للمتوسط، ** p < 0.01، *** p < 0.001. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 8
الشكل 8: استجابة العقد من EHTs إلى بروتوكول فترة بعد التحميل. لوحظ السلوك العقدي لEHTs تستجيب مغناطيسيا تحت تأثير نظام متقلب من الحمل اللاحقة. (أ)نظام الحمل اللاحقة، الذي بدأ في اليوم 17 (d17)، تعرض MR-EHTs إلى 40 ق فترات من الحد الأدنى من الحمل بعد (0.91 م/ مم) تليها 40 ق فترات من الحمل الأقصى (6.85 مل/ ملم) لمدة 7 أيام. (ب)أظهرت MR-EHTs (القضبان الزرقاء) اتجاهاً نحو زيادة القوات خلال بروتوكول الفاصل الزمني بعد التحميل، في حين ظلت القوى التي تم قياسها للسيطرة EHTs (القضبان السوداء) دون تغيير نسبي. بالنسبة لهذه التجارب، تم تحليل n = 10 EHTs لكل مجموعة وتمت مقارنة هذه البيانات إحصائياً باستخدام اختبار المقارنة متعدد الأبعاد ANOVA وSidak. تمثل أشرطة الخطأ في الرسوم البيانية الخطأ القياسي للمتوسط. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

1 الجرذ EHT 24 جرذ EHTs (+10%) 1 hiPSC-CM EHT 24 hiPSC-CM EHTs (+10%) مكون
5 × 105 1.3 × 107 1 × 106 2.6 × 107 الخلايا (إما خلايا البطين القلبية الوليدية أو خلايا القلب المشتقة من hiPSC)
5.57 ميكرولتر 147 ميكرولتر 5.57 ميكرولتر 147 ميكرولتر 2x DMEM: 20٪ مصل الحصان المعطل للحرارة، 20٪ 10x DMEM، 2٪ البنسلين / العقديات، 58٪ أكوا ad iniectabilia
2.53 ميكرولتر 66.8 ميكرولتر 2.53 ميكرولتر 66.8 ميكرولتر الفيبرينوجين: 200 ملغ/مل فيبرينوجين حل في 0.9% NaCl
- - 0.1 ميكرولتر 2.64 ميكرولتر Y-27632
الإعلان 100 ميكرولتر الإعلان 2640 ميكرولتر الإعلان 100 ميكرولتر الإعلان 2640 ميكرولتر EHT-صب المتوسطة: 88% DMEM, 10% الحرارة تعطيل مصل العجل الجنين, 1% البنسلين / العقديات, 1% L-الجلوتامين

الجدول 1: مزيج إعادة تشكيل لتوليد EHTs.

اسم الأمر بناء الجمله وصف
نقل مطلق 1MVA [x] المرحلة يتحرك لوضع [x] في مم
تعيين السرعة 1VEL[x] سرعة حركة المرحلة تعيين إلى [x] في مم / سنة
التوقف في حالات الطوارئ 1EST توقف أي حركة
انتظر التوقف 1WST فقط أثناء تسجيل البرنامج؛ ينتظر إكمال أمر الحركة السابق قبل تنفيذ الأمر التالي
انتظر الفترة الزمنية 1WTM [x] فقط أثناء تسجيل البرنامج؛ ينتظر الفترة الزمنية [x] في ms
تسجيل برنامج Beginn 1PGM[x] بدء تسجيل البرنامج في الفتحة [x]; ملاحظة: الفتحة [x] يجب أن تكون مجانية
إنهاء تسجيل البرنامج 1END إنهاء تسجيل البرنامج وحفظ البرنامج
مسح البرنامج 1ERA[x] مسح البرنامج المحفوظة في فتحة [x]
تنفيذ البرنامج 1EXC [x] تنفيذ البرنامج المحفوظة في فتحة [x]
برنامج حلقة 1PGL[x] [x]=1 وضع حلقة البرنامج ON [x]=0 وضع حلقة البرنامج إيقاف التشغيل
قراءة الأخطاء ومسحها 1ERR؟ طلب تقرير خطأ

الجدول 2: أوامر مفيدة لتجارب ضبط ما بعد التحميل.

الشكل التكميلي 1: أبعاد رفوف السيليكون. (أ)عرض أعلى،(B)عرض الجانب المقطعي، و(C)عرض آخر مفصل لرفوف السيليكون المستخدمة لهذه الدراسات. يرجى الضغط هنا لتحميل هذا الرقم.

الشكل التكميلي 2: معلمات انكماش إضافية لزيادة الحمل بعد التحميل. قياسات التعاقد من EHTs التحكم (الخط الأسود) وEHTs المستزرعة على الوظائف المتجاوبة مغناطيسيا (MR-EHTs؛ الخط الأزرق) على مدى فترة الثقافة من 31 يوما. (أ)كان معدل إنتاج القوة من التحكم في EHTs أعلى بكثير من معدل إنتاج القوة من اليوم 27 فصاعداً. (ب)كان معدل اضمحلال القوة أيضاً أكبر بكثير في MR-EHTs منه في السيطرة من اليوم 27 فصاعداً. (C)في حين أن العمل التعاقدي الذي يقاس بالتحكم EHTs زاد تدريجياً خلال فترة الثقافة بأكملها، فإن عمل العقد الذي أنتجته MR-EHTs بلغ ذروته في اليوم 26 وانخفض بعد ذلك إلى مستويات أقل من السيطرة. ومع ذلك، لم يكن العمل في MR-EHTs أعلى بكثير من ذلك في السيطرة على EHTs. هنا ، ن = 10 MR - EHTs و n = 10 تم تحليل EHTs التحكم عن طريق تركيب نموذج مختلط (REML = الحد الأقصى من احتمال) واختبار المقارنة المتعددة في Sidak. تمثل أشرطة الخطأ في الرسوم البيانية الخطأ القياسي للمتوسط، * p < 0.05، *** p < 0.001. يرجى الضغط هنا لتحميل هذا الرقم.

الشكل التكميلي 3: معلمات انكماش إضافية لبروتوكول الفترة اللاحقة للحمولة. لوحظ السلوك العقدي للEHTs تستجيب مغناطيسيا (MR-EHTs) تحت تأثير نظام متقلب من الحمل اللاحقة. (أ)خلال فترة بروتوكول ما بعد التحميل، أظهر MR EHTs (أشرطة زرقاء) في البداية اتجاهانحو ارتفاع معدلات إنتاج القوة مقارنة بالسيطرة EHTs (القضبان السوداء)، ولكن هذه الاختلافات لم تكن كبيرة وتضاءلت قرب نهاية التجربة. (ب)كانت معدلات اضمحلال القوة المقيسة بالمواد المضادة للبيانات والمواد EHTs الخاضعة للتحكم متشابهة إحصائياً طوال فترة بروتوكول ما بعد التحميل. (C)زاد عمل العقد الذي تم قياسه لMR-EHTs خلال الأيام الأولى من بروتوكول الفاصل الزمني بعد التحميل ولكنه انخفض في اليوم الأخير. ولم يتغير عمل العقد الذي يقاس بالتحكم في المواد EHTs بشكل ملحوظ خلال هذه الفترة الزمنية. لم يكن العمل في MR-EHTs أعلى بكثير من العمل في التحكم في EHTs. لهذه التجارب، ن = 10 EHTs لكل مجموعة تم تحليلها من قبل 2-way ANOVA وSidak اختبار المقارنة متعددة. تمثل أشرطة الخطأ في الرسوم البيانية الخطأ القياسي للمتوسط. يرجى الضغط هنا لتحميل هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

يصف البروتوكول المبين هنا تقنية جديدة لتغيير الحمل اللاحقة مغناطيسيًا في أنسجة القلب المهندسة. تعتمد هذه التقنية على استخدام مرحلة بيزوكهربائية لترجمة لوحة من المغناطيس القوي نحو وبعيدا ً عن رفوف السيليكون المستجيبة مغناطيسياً. كلما اقتربت مجموعتين من المغناطيس ، كلما كانت الحمولة اللاحقة التي يعاني منها EHTs مثقفة عليها.

هناك العديد من الخطوات التي تعتبر حاسمة لنجاح إنتاج واستخدام هذا النظام. في حين تلفيق رفوف السيليكون تستجيب مغناطيسيا، من المهم للغاية لضمان أن يتم توجيه جميع المغناطيس داخل المشاركات مع نفس القطبية. إذا تم وضع مغناطيس في الاتجاه العكسي ، فإنه سيعمل على إضعاف بدلا ً من زيادة قوة المجال المغناطيسي. وبالمثل ، ينبغي أن تتطابق هذه القطبية مع كل المغناطيس داخل لوحة المغناطيس ، وإلا فإن مجموعتي المغناطيس صد ، بدلا من جذب بعضها البعض. بالإضافة إلى ذلك ، حيثما كان ذلك ممكنا ، والامتناع عن استخدام المواد المغناطيسية في بناء جهاز ضبط ما بعد الحمل ، لأنها يمكن أن تتداخل مع المجال المغناطيسي. ويقترح الألومنيوم كمادة البناء الأولية لهذا السبب. وبالمثل، إذا كان استخدام مرحلة كهربائية بيزوكهربائية غير تلك المذكورة في جدول المواد،تأكد من أنها مقاومة للمجالات المغناطيسية وظروف ثقافة الخلايا القياسية (على سبيل المثال، 37 درجة مئوية، والرطوبة 100٪، وارتفاع CO2 و O2-تركيزات). وأخيرا، نضع في اعتبارنا أن معظم المراحل الخطية البيزوكهربائية من المفترض أن تكون محمولة أفقيا، لأنها تميل إلى أن يكون لها قدرة تحميل منخفضة. على هذا النحو ، إذا كان وزن لوحة المغناطيس يتجاوز هذه القدرة على الحمل ، يجب استخدام ثقل موازن لتفريغ المحرك.

على الرغم من أفضل الممارسات ، فمن الصعب جدا للحفاظ على سطح الترميز البكر. عند حدوث ذلك، ستتوقف المرحلة عن التحرك قبل الوصول إلى الموضع المستهدف عند التشغيل في وضع الحلقة المغلقة. سوف فلاش LED وحدة تحكم الحركة الحمراء، بالإضافة إلى ذلك سوف يعرض برنامج وحدة تحكم الحركة رسالة "لا مشفرة الكشف عن" الخطأ. لعلاج هذا، يجب على المستخدم تنظيف سطح الترميز مع قطعة خالية من الوبر من القماش غارقة في الكحول isopropyl والسماح لها الهواء الجاف.

يوضح هذا البروتوكول الخطوات التي اتخذها مختبرنا لإنتاج وتنفيذ هذا النظام. غير أنه يمكن تحقيق العديد من هذه الخطوات بوسائل مختلفة. على سبيل المثال ، يمكن للمرء استخدام محول القوة ، بدلا من الوسائل البصرية ، لتأكيد العلاقة بين تباعد المغناطيس وتصلب آخر. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن تصميم المشاركات المخصصة وتصنيعها مع المغناطيس والأقواس المضمنة. ومع ذلك، وجدنا أن تحديد المواقع الدقيق لهذه الكائنات أسهل لإنجاز يدوياً. لضبط مجموعة من الأحمال اللاحقة التي ينطبق عليها هذا النظام ، يمكن تصنيع هذه الوظائف مع تصلب القاعدية المختلفة أو مع عدد مختلف من المغناطيس. على الرغم من ذلك ، فإن استخدام مغناطيسات كثيرة جدًا ستعيق الانحناء بعد. بدلا من ذلك، يمكن أيضا أن يتحقق ذلك عن طريق ضبط حجم وقوة المغناطيس داخل لوحة المغناطيس. أكبر وأقوى المغناطيس سوف تسفر عن زيادة الأحمال اللاحقة.

هناك العديد من القيود على هذا الأسلوب التي يمكن تحسينها في الإصدارات المستقبلية من هذا النظام. وهي، مجموعة من الأحمال اللاحقة المطبقة محدودة ماديا من قبل الحد الأقصى والحد الأدنى من التباعد بين المغناطيس آخر ومغناطيس لوحة. من الناحية المثالية ، فإن الوظائف المستخدمة لهذا النظام تضع الأنسجة أقرب إلى قاعدة طبق زراعة الأنسجة قدر الإمكان ، دون السماح مباشرة للأنسجة بلمس الجزء السفلي من اللوحة. ومع ذلك ، فإن الوظائف المستخدمة في هذه الدراسات تم إجراؤها تجاريًا قبل تطوير هذا النظام ، لذلك لم يتم تحسين أطوال الوظائف لهذا النظام. وبالمثل، بما أن نظام تحليل العقد EHT قد تم بناؤه قبل هذا النظام، فإنه لم يكن مصمماً للسماح بإقامة الأسلاك الكهربائية في أو خارج مساحة القياس. وعلى هذا النحو، أدى وجود هذه الحبال إلى فجوة هوائية صغيرة، مما سمح للغازات بالتسرب ببطء من الغرفة الداخلية. ويمكن تحسين ذلك عن طريق تعديل معدلات تدفق الغاز وفقا لذلك. ومع ذلك ، من الناحية المثالية ، فإن تجسيد هذا النظام في المستقبل قد عزل نقاط الخروج والدخول لهذه الحبال. إذا رغب المرء في إجراء هذه التجارب في غياب نظام تحليل عقد EHT ، يمكن بدلاً من ذلك وضع منصة ضبط الحمل اللاحقة داخل حاضنة. على الرغم من أن النظام في مجمله سوف يصلح فقط داخل حاضنة قياسية إذا تمت إزالة واحد أو أكثر من الرفوف، مما يجعل هذه المساحة غير متوفرة لأغراض زراعة الخلايا أو الأنسجة الأخرى. لمراقبة بصريا الأنسجة في أي بيئة، وسوف تكون هناك ضرورة للأضواء. تم العثور على أضواء LED المستخدمة لهذا النظام لإعطاء قبالة كمية كبيرة من الحرارة. إذا تركت لفترات طويلة، يمكن أن هذه الحرارة يحتمل أن تلحق الضرر الأنسجة. على هذا النحو ، لهذه الدراسات ، تم استخدام الأضواء فقط لفترات قصيرة أثناء تقييم انقباض الأنسجة. ومع ذلك ، إذا كان المرء يرغب في مراقبة الأنسجة باستمرار ، فإن نظام الإضاءة يجب أن يكون الأمثل لهذه الأغراض.

وقد درس سابقا بعد التحميل في نماذج EHT16,23. ومع ذلك ، قدمت هذه الأعمال التقنيات التي كانت قادرة فقط على تحقيق زيادة ثابتة فريدة في الحمل. وبدلاً من ذلك، أظهر هذا العمل كيف يمكن استخدام منصة تعتمد على المغناطيسية لضبط وتنظيم التحميل التالي في EHTs مؤقتًا. تم استخدام نتائج مجموعتين منفصلتين من التجارب لتجسيد مجموعة واسعة من أنظمة الحمل اللاحقة التي يمكن تطبيقها على EHTs باستخدام هذا الجهاز. وتشمل التطبيقات المستقبلية المقصودة لهذا النظام دراسات عن تأثير نظام الحمل التالي المطبق (الجرعة والمدة) على كل من نضوج الأنسجة وإعادة عرض المرضية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

تي وMNH هما المؤسسان المشاركان لشركة EHT Technologies GmbH. جميع المؤلفين الآخرين ليس لديهم ما يكشفون عنه.

Acknowledgments

المؤلفين أشكر جوتا ستارباتي لدعمها في العمل ثقافة الأنسجة، أكسل كيرشيف للتصوير الفوتوغرافي، أليس كازاغراند سيسوونتو لأعمال التحرير، وشكر خاص لبولنت Aksehirlioglu للدعم التقني في تطوير هذا الجهاز. بدعم B.B. من قبل DZHK (المركز الألماني لأبحاث القلب والأوعية الدموية) منحة الباحث، M.L.R. من قبل منحة العالم في مرحلة ما بعد الدكتوراه منحة وويتيكر وM.N.H. من أموال من DZHK.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cylindrical plate magnets HKCM 9962-55184 h = 14 mm, d = 13 mm
Cylindrical post magnets HKCM 9962-63571 h = 2 mm, d = 0.5 mm
Dental wire Ormco 266-1316 d = 0.016 inches (0.406 mm)
GraphPad GraphPad Software, La Jolla, California, USA version 6.00 for Windows
Motion control software for piezo motor Micronix USA free download on manufacturer homepage
Motion controller for piezo motor Micronix USA MMC-100-01000
Optical contractility analysis platform EHT technologies A0001
Piezoelectric linear motor Micronix USA PPS-20-15206 fitted with linear optical encoder, incubator-environment compatible
Styrene Rod Plastruct MR-15 d = 0.015 inches (0.381 mm)
USB camera Reichelt Elektronik REFLECTA 66142

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Zipes, D. P., Libby, P., Bonow, R. O., Mann, D. L., Tomaselli, G. F. Braunwald's Heart Disease: A Textbook of Cardiovascular Medicine. 11th edn. , Elsevier. (2018).
  2. McCain, M. L., Yuan, H., Pasqualini, F. S., Campbell, P. H., Parker, K. K. Matrix elasticity regulates the optimal cardiac myocyte shape for contractility. American Journal of Physiology- Heart and Circulatory Physiology. 306 (11), 1525-1539 (2014).
  3. de Groot, P. C., van Dijk, A., Dijk, E., Hopman, M. T. Preserved cardiac function after chronic spinal cord injury. Archives of Physical Medicine and Rehabilitation. 87 (9), 1195-1200 (2006).
  4. Perhonen, M. A., et al. Cardiac atrophy after bed rest and spaceflight. Journal of Applied Physiology. 91 (2), 645-653 (2001).
  5. Levy, D., Larson, M. G., Vasan, R. S., Kannel, W. B., Ho, K. K. The progression from hypertension to congestive heart failure. Journal of the American Medical Association. 275 (20), 1557-1562 (1996).
  6. Levy, D., et al. Long-term trends in the incidence of and survival with heart failure. The New England Journal of Medicine. 347 (18), 1397-1402 (2002).
  7. Maggioni, A. P., et al. EURObservational Research Programme: regional differences and 1-year follow-up results of the Heart Failure Pilot Survey (ESC-HF Pilot). European Journal of Heart Failure. 15 (7), 808-817 (2013).
  8. Mozaffarian, D., et al. Heart disease and stroke statistics--2015 update: a report from the American Heart Association. Circulation. 131 (4), 29 (2015).
  9. Klautz, R. J., Teitel, D. F., Steendijk, P., van Bel, F., Baan, J. Interaction between afterload and contractility in the newborn heart: evidence of homeometric autoregulation in the intact circulation. Journal of the American College of Cardiology. 25 (6), 1428-1435 (1995).
  10. Liedtke, A. J., Pasternac, A., Sonnenblick, E. H., Gorlin, R. Changes in canine ventricular dimensions with acute changes in preload and afterload. The American Journal of Physiology. 223 (4), 820-827 (1972).
  11. Toischer, K., et al. Differential cardiac remodeling in preload versus afterload. Circulation. 122 (10), 993-1003 (2010).
  12. Zhang, H., et al. Cellular Hypertrophy and Increased Susceptibility to Spontaneous Calcium-Release of Rat Left Atrial Myocytes Due to Elevated Afterload. PloS one. 10 (12), 0144309 (2015).
  13. Hori, M., et al. Loading sequence is a major determinant of afterload-dependent relaxation in intact canine heart. The American Journal of Physiology. 249, 4 Pt 2 747-754 (1985).
  14. Schotola, H., et al. The contractile adaption to preload depends on the amount of afterload. ESC Heart Failure. 4 (4), 468-478 (2017).
  15. Sonnenblick, E. H., Downing, S. E. Afterload as a primary determinat of ventricular performance. The American Journal of Physiology. 204, 604-610 (1963).
  16. Hirt, M. N., et al. Increased afterload induces pathological cardiac hypertrophy: a new in vitro model. Basic Research in Cardiology. 107 (6), 307 (2012).
  17. Hirt, M. N., et al. Deciphering the microRNA signature of pathological cardiac hypertrophy by engineered heart tissue- and sequencing-technology. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 81, 1-9 (2015).
  18. Dorn, G. W. The fuzzy logic of physiological cardiac hypertrophy. Hypertension. 49 (5), 962-970 (2007).
  19. Hill, J. A., Olson, E. N. Cardiac plasticity. The New England Journal of Medicine. 358 (13), 1370-1380 (2008).
  20. Maillet, M., van Berlo, J. H., Molkentin, J. D. Molecular basis of physiological heart growth: fundamental concepts and new players. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 14 (1), 38-48 (2013).
  21. Stenzig, J., et al. DNA methylation in an engineered heart tissue model of cardiac hypertrophy: common signatures and effects of DNA methylation inhibitors. Basic Research in Cardiology. 111 (1), 9 (2016).
  22. Werner, T. R., Kunze, A. C., Stenzig, J., Eschenhagen, T., Hirt, M. N. Blockade of miR-140-3p prevents functional deterioration in afterload-enhanced engineered heart tissue. Scientific Reports. 9 (1), 11494 (2019).
  23. Leonard, A., et al. Afterload promotes maturation of human induced pluripotent stem cell derived cardiomyocytes in engineered heart tissues. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 118, 147-158 (2018).
  24. Rodriguez, M. L., Werner, T. R., Becker, B., Eschenhagen, T., Hirt, M. N. Magnetics-Based Approach for Fine-Tuning Afterload in Engineered Heart Tissues. ACS Biomaterials Science & Engineering. 5 (7), 3663-3675 (2019).
  25. Mannhardt, I., et al. Automated Contraction Analysis of Human Engineered Heart Tissue for Cardiac Drug Safety Screening. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (122), e55461 (2017).

Tags

علم الأحياء التنموي، العدد 159، هندسة الأنسجة، أنسجة القلب المهندسة، تضخم القلب، المغناطيسية، بعد الحمل، الانكماش
التكيف المغناطيسي للحمولة اللاحقة في أنسجة القلب المهندسة
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Becker, B., Rodriguez, M. L.,… More

Becker, B., Rodriguez, M. L., Werner, T. R., Stenzig, J., Eschenhagen, T., Hirt, M. N. Magnetic Adjustment of Afterload in Engineered Heart Tissues. J. Vis. Exp. (159), e60811, doi:10.3791/60811 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter