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Chemistry

L’extraction du génome guidée par spectrométrie de masse comme outil pour découvrir de nouveaux produits naturels

Published: March 12, 2020 doi: 10.3791/60825
Automatic Translation
1, 1, 2, 1
1Department of Organic Chemistry, Institute of Chemistry, University of Campinas (UNICAMP), 2Center for Natural and Human Sciences, Federal University of ABC (UFABC)

Summary

Un protocole d’extraction du génome guidé par spectrométrie de masse est établi et décrit ici. Il est basé sur l’information sur la séquence génomique et l’analyse LC-MS/MS et vise à faciliter l’identification des molécules à partir d’extraits microbiens et végétaux complexes.

Abstract

L’espace chimique couvert par les produits naturels est immense et largement méconnu. Par conséquent, des méthodologies pratiques pour effectuer une évaluation de grande envergure de leurs fonctions dans la nature et les avantages humains potentiels (p. ex., pour les applications de découverte de médicaments) sont souhaitées. Ce protocole décrit la combinaison de l’extraction du génome (GM) et du réseautage moléculaire (MN), deux approches contemporaines qui correspondent aux annotations codées par les grappes génétiques dans le séquençage du génome entier avec des signatures de structure chimique provenant d’extraits métaboliques bruts. C’est la première étape vers la découverte de nouvelles entités naturelles. Ces concepts, lorsqu’ils sont appliqués ensemble, sont définis ici comme l’exploitation du génome guidée par la SP. Dans cette méthode, les composants principaux sont auparavant désignés (à l’aide de MN), et les nouveaux candidats structurellement liés sont associés à des annotations de séquences génomiques (à l’aide de GM). La combinaison de GM et de MN est une stratégie rentable visant à cibler de nouvelles colonnes dorsales de molécules ou à récolter des profils métaboliques afin d’identifier les analogues des composés déjà connus.

Introduction

Les études sur le métabolisme secondaire consistent souvent à filtrer des extraits bruts pour des activités biologiques spécifiques suivies de la purification, de l’identification et de la caractérisation des constituants appartenant à des fractions actives. Ce processus s’est avéré efficace, favorisant l’isolement de plusieurs entités chimiques. Cependant, aujourd’hui, cela est considéré comme irréalisable, principalement en raison des taux élevés de redécouverte. Comme l’industrie pharmaceutique a révolutionné sans connaître les rôles et les fonctions des métabolites spécialisés, leur identification a été effectuée dans des conditions de laboratoire qui ne représentaient pas exactement la nature1. Aujourd’hui, il y a une meilleure compréhension des influences naturelles de signalisation, de la sécrétion, et de la présence de la plupart des cibles à des concentrations anormalement basses. De plus, la réglementation du processus aidera la communauté universitaire et l’industrie pharmaceutique à tirer parti de ces connaissances. Il bénéficiera également à la recherche impliquant l’isolement direct des métabolites liés aux grappes de gènes biosynthétiques silencieuses (BGC)2.

Dans ce contexte, les progrès du séquençage génomique ont renouvelé leur intérêt pour le dépistage des métabolites micro-organismes. C’est parce que l’analyse de l’information génomique des amas biosynthétiques non découverts peut révéler des gènes codant de nouveaux composés non observés ou produits dans des conditions de laboratoire. De nombreux projets ou projets de génome entier microbien sont disponibles aujourd’hui, et le nombre augmente chaque année, offrant des perspectives massives pour découvrir de nouvelles molécules bioactives grâce à l’exploitation minière du génome3,4.

L’Atlas of Biosynthetic Gene Clusters est la plus grande collection actuelle de grappes de gènes automatiquement extraites en tant que composant de la plate-forme intégrée des génomes microbiens de l’Institut mixte du génome (JGI IMG-ABC)2. Plus récemment, l’Initiative de normalisation des grappes de gènes biosynthétiques (MIBiG) a favorisé la reannotation manuelle des BGC, fournissant un ensemble de données de référence très organisé5. Aujourd’hui, de nombreux outils sont disponibles pour permettre l’extraction informatique des données génétiques et leur connexion aux métabolites secondaires connus. Différentes stratégies ont également été élaborées pour accéder à de nouveaux produits naturels bioactifs (c.-à-d. l’expression hétérogène, la suppression des gènes cibles, la reconstitution in vitro, la séquence génomique, le dépistage guidé par isotopes [approche génoto-américaine], la manipulation des régulateurs locaux et mondiaux, l’exploitation minière axée sur les cibles de résistance, l’exploitation minière indépendante de la culture et, plus récemment, les approches de ms-guided/code2,6,7,8,9, 10,11,12,13,14,15).

L’extraction du génome comme stratégie singulière nécessite des efforts pour annoter un seul ou un petit groupe de molécules; ainsi, des lacunes subsistent dans le processus dans lequel de nouveaux composés sont priorisés pour l’isolement et l’élucidation de la structure. En principe, ces approches ne ciblent qu’une seule voie biosynthétique par expérience, ce qui entraîne un faible taux de découverte. En ce sens, l’utilisation de GM avec une approche de réseautage moléculaire représente une avancée importante pour la recherche sur les produits naturels14,15.

La polyvalence, la précision et la sensibilité élevée de la spectrométrie de masse chromatographie liquide (LC-MS) en font une bonne méthode d’identification composée. Actuellement, plusieurs plates-formes ont investi des algorithmes et des suites logicielles pour métabolomiques non ciblés16,17,18,19,20. Le cœur de ces programmes comprend la détection des fonctionnalités (pic de sélection)21 et l’alignement de pointe, ce qui permet de faire correspondre des caractéristiques identiques à travers un lot d’échantillons et de rechercher des modèles. Les algorithmes basés sur les modèles de SP22,23 comparent les modèles caractéristiques de fragmentation et correspondent aux similitudes de MS2 générant des familles moléculaires partageant des caractéristiques structurelles. Ces caractéristiques peuvent ensuite être mises en évidence et regroupées, conférant la possibilité de découvrir rapidement des molécules connues et inconnues à partir d’un extrait biologique complexe par tandem MS2,24,25. Par conséquent, la SP tandem est une méthode polyvalente pour obtenir des informations structurelles de plusieurs chemotypes contenus dans une grande quantité de données simultanément.

L’algorithme Global Natural Products Social Molecular Networking (GNPS)26 utilise l’intensité normalisée des ions fragmentés pour construire des vecteurs multidimensionnels, dans lesquels les similitudes sont comparées à l’aide d’une fonction cosine. La relation entre les différents ions parentaux est tracée dans une représentation de diagramme, dans laquelle chaque fragmentation est visualisée comme un nœud (cercles), et la relation de chaque nœud est définie par un bord (lignes). La visualisation globale des molécules à partir d’une seule source est définie comme un réseau moléculaire. Des molécules structurellement divergentes qui se fragmentent de façon unique formeront leur propre amas ou constellation spécifique, tandis que les molécules apparentées s’assemblent. Les chemotypes de regroupement permettent la connexion hypothétique de caractéristiques structurelles similaires à leurs origines biosynthétiques.

La combinaison des approches chemotype-génotype et génotype-chemotype est puissante lors de la création de liens bioinformatiques entre les BGC et leurs produits à petites molécules27. Par conséquent, l’extraction du génome guidée par ms est une méthode rapide et une stratégie peu consommatrice de matériaux, et elle aide à combler les ions parentaux et les voies biosynthétiques révélées par WGS d’une ou plusieurs souches dans diverses conditions métaboliques et environnementales.

Le flux de travail de ce protocole (figure 1) consiste à alimenter les données WGS dans une plate-forme d’annotation de grappes génétiques biosynthétiques telles que l’antiSMASH28,29,30. Il permet d’estimer la variété des composés et la classe des composés codés par le génome. Une stratégie visant à cibler un groupe génétique biosynthétique codant une entité chimique d’intérêt doit être adoptée, et des extraits de culture d’une souche de type sauvage et/ou d’une souche hétérologue contenant le BGC peuvent être analysés pour générer des ions groupés basés sur des similitudes à l’aide duPNBS 26,31. Par conséquent, il est possible d’identifier de nouvelles molécules qui s’associent au BGC ciblé et ne sont pas disponibles dans la base de données (principalement des analogues inconnus, parfois produits en bas de la vie). Il est pertinent de considérer que les utilisateurs peuvent contribuer à ces plates-formes et que la disponibilité des données bioinformatiques et MS/MS augmente rapidement, conduisant à un développement constant et la mise à niveau d’outils et d’algorithmes informatiques efficaces pour guider les connexions efficaces d’extraits complexes avec des molécules.

Figure 1
Figure 1 : Aperçu de l’ensemble du flux de travail. On y voit une illustration des étapes bioinformatiques, clonage et de réseautage moléculaire impliquées dans l’approche décrite d’extraction du génome guidée par ms pour identifier de nouveaux métabolites. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Ce protocole décrit un flux de travail rapide et efficace pour combiner l’extraction du génome et le réseautage moléculaire comme point de départ pour le pipeline naturel de découverte de produits. Bien que de nombreuses applications soient capables de visualiser la composition et la dataabilité des molécules détectables par la SP dans un réseau, plusieurs sont adoptées ici pour visualiser des molécules groupées structurellement similaires. En utilisant cette stratégie, de nouveaux produits de cyclodepsipeptide observés dans les extraits métaboliques de Streptomyces sp. CBMAI 2042 sont identifiés avec succès. Guidé par l’extraction du génome, l’ensemble du codage de faisceau de gènes biosynthétique pour les valinomycines est reconnu et cloné dans la souche productrice Streptomyces coelicolor M1146. Enfin, à la suite d’un réseau moléculaire basé sur le modèle de SP, les molécules détectées par LAS sont corrélées avec les BGC responsables de leur biogenèse32.

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Protocol

1. Extraction du génome pour les grappes de gènes biosynthétiques

  1. Effectuer le séquençage du génome entier (WGS) comme première étape vers l’élection d’un groupe génétique biosynthétique (BCG) pour l’extraction du génome guidé par la SP. L’ébauche du génome entier de la souche d’intérêt (bactéries) peut être obtenue par la technologie Illumina MiSeq en utilisant ce qui suit avec l’ADN génomique de haute qualité: fusil de chasse TruSeq PCR-Free bibliothèque de préparation et Nextera Mate Paire Library Preparation Kit33.
    REMARQUE : Après séquençage, la bibliothèque de fusils de chasse Illumina et la bibliothèque de paires Illumina mate peuvent être assemblées à l’aide du Newbler v3.0 (Roche, 454) programme assembleur (trouvé à 'lt;https://ngs.csr.uky.edu/Newbler’gt;) et annoté à l’aide d’un pipeline basé sur FgeneSB (trouvé à 'lt;http://www.softberry.com/berry.phtml?topic-fgenesb_annotator ''help’amp; subgroup’pipelines’gt;), tel que décrit précédemment333. Microbiology Resource Announcements (MRA) est une revue en plein accès avec des articles publiant la disponibilité de toute ressource microbiologique déposée dans un référentiel disponible (trouvé à lt;https://mra.asm.org-gt;). Les gènes candidats de codage protéique sont identifiés à l’aide de l’annotation du serveur RAST34, et le projet Whole Genome Shotgun (WGS) est déposé dans la DDBJ/ENA/GenBank (trouvé à la base de données de séquences de la séquence de la séquence de lt;https://gold.jgi.gov.gov.gt;) et Gold (trouvé à la base de données de base de données de la séquence de lt;https://gold.jgi.gov.gov.gt;)
  2. Pour obtenir des informations silico sur les annotations de faisceaux de gènes du métabolisme secondaire à partir d’un génome séquenti complet, soumettez le fichier séquence (format GenBank/EMBL ou FASTA) à une plate-forme antiSMASH (trouvée à lt;https://antismash.secondarymetabolites.org/-gt;).
  3. Sélectionnez le groupe génétique d’intérêt à partir des données de sortie(figure 2) en fonction du cluster le plus similaire connu.
    REMARQUE : Tout d’abord, il est courant d’explorer le gène par gène et d’effectuer des recherches individuelles (blastp) pour évaluer quelles fonctions sont associées aux groupes de gènes biosynthétiques souhaités. Cette procédure peut également aider à déterminer quel BGC est probablement associé à la production d’un composé désiré, même s’il s’agit d’un faible pourcentage. Une prédiction antiSMASH considère tous les gènes d’un cluster pour faire une couverture en pourcentage, ce qui peut représenter un faible pourcentage global de similitude pour le BGC visé. Cependant, lors de l’analyse de gène par gène, il est possible d’obtenir des informations plus précises à l’aide de l’amas connu le plus similaire. Deuxièmement, l’antiSMASH dispose de deux options pour affiner une recherche : 1) la rigueur de détection : le degré de rigueur auquel le faisceau de gènes biosynthétique doit être considéré comme un coup. Pour cette option, l’utilisateur doit utiliser les paramètres suivants : a) strict : détecte des clusters exclusivement bien définis contenant toutes les régions requises, insusceptibles aux erreurs sur l’information génétique ; b) détendu : détecte les amas partiels manquant une ou plusieurs régions fonctionnelles, qui fonctionne également pour détecter la fonction stricte ; c) lâche: détecte les clusters et les clusters mal définis qui correspondent probablement aux métabolites primaires, ce qui peut conduire à l’apparition de faux positifs ou BGC mal définis. L’autre option est 2) fonctionnalités supplémentaires: le type d’informations que la plate-forme doit rechercher et afficher dans la sortie. En général, ces deux options peuvent gagner du temps après la prédiction. Cependant, le travail antiSMASH nécessite une période plus longue.

Figure 2
Figure 2 : Sortie de la plate-forme antiSMASH. Métabolisme secondaire dans l’analyse de silico de l’annotation entière de séquence de génome. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

  1. Sur la base des informations sur la séquence d’ADN du BGC, les amorces de conception (20-25 nt) flanquant le faisceau de gènes pour le dépistage de la bibliothèque ESAC(E. coli/Streptomyces Artificial Chromosome).
    REMARQUE : Différentes méthodes35,36 peuvent être utilisées pour capturer l’ensemble du groupe génétique biosynthétique de l’ADN. Ici, la méthode utilisée est la construction d’une bibliothèque représentative ESAC37,38 de Streptomyces sp. CBMAI 2042 contenant des clones avec des fragments de taille moyenne de 95 kb.

2. Expression hétérogène d’un groupe génétique biosynthétique entier de la bibliothèque ESAC

  1. Déplacer le vecteur ESAC de E. coli DH10B à E. coli ET12567 par conjugaison triparentale32.
    1. Inoculer E. coli ET12567 (CamR), TOPO10/pR9604 (CarbR), DH10B/ESAC4H (AprR) en 5 mL de Luria-Bertani (LB) moyen contenant du chloramphenicol (25 g/mL), de la carbenicilline (100 g/mL), et de l’apramycin (50 ans/mL).
    2. Incuber la culture pendant la nuit à 37 oC et 250 tr/min.
    3. Inoculer 500 l de la culture de nuit dans 10 ml de milieu LB contenant une demi-concentration d’antibiotiques.
    4. Incuber la culture à 37 et 250 tr/min jusqu’à atteindre un A600 de 0,4 à 0,6.
    5. Récoltez les cellules par centrifugation à 2 200 x g pendant 5 min.
    6. Laver les cellules deux fois avec 20 ml de milieu LB.
    7. Résuspendez les cellules dans 500 L de milieu LB.
    8. Mélanger 20 L de chaque souche dans un tube de microcentrifuge et égoutter dans une plaque d’agar avec un milieu LB sans antibiotiques.
    9. Incuber les plaques à 37 oC pendant la nuit.
    10. Stries les cellules cultivées sur une plaque fraîche d’agar LB contenant des antibiotiques et incuber à 37 oC pendant la nuit.

3. Streptomyces/Conjugaison E. coli

  1. Pour obtenir l’organisme hétérologue recombinant, effectuer la conjugaison32 entre E. coli ET12567 contenant le vecteur ESAC, aide plasmide pR9604, et Streptomyces coelicolor M1146 ou une autre souche hôte sélectionnée39.
  2. Jour 1 : Inoculer des colonies isolées de S. coelicolor M1146 dans 25 ml de médium TSBY dans un flacon Erlenmeyer de 250 ml équipé d’un ressort inox à 30 oC et 200 tr/min pour 48 h.
  3. Jour 2/3: Inoculation ET12567/ESAC/pR9604 en 5 mL de milieu LB contenant du chloramphenicol (25 g/mL), carbenicillin (100 g/mL) et apramycine (50 g/mL) pendant la nuit à 37 oC et 250 tr/min.
  4. Jour 3/4 : Inoculer 500 lil de la culture de nuit dans 10 ml de 2TY (dans un tube conique de 50 ml) contenant des concentrations d’antibiotiques à demi-travail. Incuber à 37 et 250 tr/min jusqu’à atteindre un A600 de 0,4 à 0,6.
  5. Centrifuge des cultures (ET12567/ESAC/pR9604 et M1146) à 2200 x g pour 10 min.
  6. Laver les granulés 2x dans 20 ml de milieu 2TY et la résuspendance en 500 L de 2TY.
  7. Aliquot 200 L de la suspension S. coelicolor M1146 et diluer dans 500 L de 2TY (suspension A).
  8. Aliquot 200 L de suspension A et diluer dans 500 L de 2TY (suspension B).
  9. Aliquot 200 L de suspension B et diluer dans 500 L de 2TY (suspension C).
  10. Aliquot 200 L de la suspension ET12567/ESAC/pR9604 et mélanger avec 200 L de suspension C.
  11. Plaque 150 L du mélange de conjugaison sur une plaque d’agar SFM dépourvue d’antibiotiques.
  12. Incuber à 30 oC pour 16 h.
  13. Couvrir les plaques avec 1 ml de solution antibiotique (selon la résistance aux plasmides). Après le séchage, incuber à 30 oC pendant 4 à 7 jours.
    REMARQUE : Ici, une solution contenant 1.0 mg/mL thiostrepton et 0.5 mg/mL acide nalidixique a été préparée.
  14. Exconjugants putatifs de streak sur des plaques d’agar de SFM contenant du thiostrepton (50 mg/mL) et de l’acide nalidixique (25 mg/mL). Incubate à 30 oC.
  15. Exconjugants de streak sur un agar SFM contenant seulement de l’acide nalidixique.
  16. Effectuez l’analyse de PCR avec des colonies isolées pour confirmer que l’ensemble de l’amas de gènes a été transféré à l’hôte S. coelicolor M1146.

4. Culture de la souche

  1. Pour obtenir le profil métabolique, inoculer 1/100 de la pré-culture de la souche dans un support de fermentation approprié et dans les conditions de culture appropriées.
  2. Cultures de centrifugeuses à 2200 x g pour 10 min.
  3. Effectuer l’extraction en fonction de la classe de l’enceinte de l’intérêt40.

5. Acquérir des spectres de masse et la préparation à l’analyse du PNBS

  1. Pour acquérir des données MS/MS, programmez des méthodes HPLC et spectrométrie de masse appropriées à l’aide du logiciel de contrôle. L’analyse de spectrométrie de masse dépendante des données à haute et basse résolution peut être analysée.
    REMARQUE : En général, une solution de 1 mg/mL d’échantillons complexes d’extrait brut est idéale. Des dilutions sont nécessaires pour des extraits moins complexes. Il convient de noter que le réseauMENT MS/MS est le réseau moléculaire détectable dans les conditions spectrométriques de masse données.
  2. Convertir les spectres de masse en format .mzXML en utilisant MSConvert de Proteowizard (trouvé à 'lt;http://proteowizard.sourceforge.net/ 'gt;). Les paramètres d’entrée de la conversion sont illustrés dans la figure 3. Les données provenant de logiciels de presque toutes les entreprises sont compatibles.

Figure 3
Figure 3 : Utilisation de MsConvert pour convertir les fichiers MS en extension mzXML. Le paramètre correct pour l’analyse du PNBS est affiché. Les instructions sont les suivantes: ajouter tous les fichiers MS dans la boîte 1 et ajouter le filtre Peak Picking dans la boîte 2; pour ce filtre, utilisez le fournisseur d’algorithmes; début de la presse et les processus de conversion suivront. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

  1. Téléchargez les fichiers LC-MS/MS convertis dans la base de données du PNBS. Deux options sont disponibles : l’utilisation d’un protocole de transfert de fichiers (FTP) ou directement dans un navigateur via la plate-forme en ligne.
    REMARQUE : Des informations détaillées sur la façon d’installer et de transférer des données au PNBS sont disponibles à l’adresse suivante : https://ccms-ucsd.github.io/GNPSDocumentation/fileupload/.gt;.

6. Analyse du PNB

  1. Après avoir créé un compte dans GNPS (trouvé à 'lt;https://gnps.ucsd.edu/'gt;), connectez-vous au compte créé sélectionnez Create Molecular Network. Ajoutez un titre d’emploi.
  2. Options de base : sélectionnez les fichiers mzXML pour effectuer le réseau moléculaire. Ils peuvent être organisés en jusqu’à six groupes. Sélectionnez les bibliothèques pour la routine de déplocation(figure 4).
    REMARQUE : Ces groupes n’interfèrent pas avec la construction du réseau moléculaire. Ces informations ne seront utilisées que pour la représentation graphique.

Figure 4
Figure 4 : Utilisation de la plate-forme PNBS en ligne pour effectuer l’analyse moléculaire du réseau. La sélection des fichiers mzXML se fait en cliquant dans la case 1. Dans la boîte de dialogue ouverte, les fichiers peuvent être sélectionnés à partir d’un dossier personnel (encadré 2) ou être téléchargés dans le deuxième onglet à l’aide du téléchargeur de fichiers drag-and-drop (moins de 20 Mo). Les fichiers peuvent être regroupés en jusqu’à six groupes. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

  1. Sélectionnez la tolérance de masse d’ion précurseur et la tolérance de masse d’ion de fragment de 0.02 Da et 0.05 Da, respectivement.
    REMARQUE : Le PNBS a différents types de rigueur disponibles en fonction de 1) l’exactitude des données SUR la SP/MS et 2) l’exactitude de l’association. Options de base: dans ce dossier, il est possible de définir Precursor Ion Mass Tolerance et Fragment Ion Mass Tolerance. Ces paramètres sont utilisés comme guide pour déterminer la précision de l’ion précurseur et de l’ion fragment. Les tolérances de masse sélectionnées dépendent de la résolution et de la précision du spectromètre de masse utilisé.
  2. Options réseau avancées : sélectionnez les paramètres selon la figure 5. Ces paramètres influencent directement la taille et la forme du cluster réseau. Un autre paramètre dans la section des onglets restants est pour les utilisateurs avancés; ainsi, laissez les valeurs par défaut.
    REMARQUE : Les paramètres avancés peuvent être lus dans la documentation du PNBS (trouvé à lt;https://ccms-ucsd.github.io/GNPSDocumentation/-gt;).

Figure 5
Figure 5 : Utilisation du PNB pour effectuer l’analyse moléculaire du réseau (options avancées). Min Pair Cos influencera directement la taille des grappes, car des valeurs élevées se traduiront par la combinaison de composés étroitement liés et de faibles valeurs dans la combinaison de composés éloignés. Il faut éviter d’utiliser des valeurs trop basses. Les ions fragmentés assortis minimaux représentent le nombre de fragments partagés entre deux spectres de fragmentation à l’autre pour être reliés dans le réseau. Ensemble, les deux paramètres guident le format réseau; les valeurs inférieures se regrouperont des composés plus éloignés et vice-versa. L’utilisation des valeurs appropriées aidera grandement l’élucidation composée. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

  1. Choisissez une adresse e-mail pour recevoir une alerte lorsque le travail est terminé, et soumettez le travail.

7. Analyse des résultats du PNBS

  1. Connectez-vous au GNPS. Sélectionnez Emplois -gt; Travail publié -gt; Fait pour ouvrir le travail. Une page Web sera ouverte comme l’illustre la figure 6. Tous les résultats obtenus à partir du réseautage moléculaire seront affichés.
  2. Sélectionnez Voir les familles spectrales (In Browser Network Visualizer) pour voir tous les clusters réseau (boîte rouge, figure 6).

Figure 6
Figure 6 : Utilisation du PNB pour visualiser les résultats du réseau moléculaire. Tous les groupes composés apparentés peuvent être vus en vue des familles spectrales (boîte rouge). Pour visualiser uniquement les visites de la bibliothèque, « voir tous les hits de la bibliothèque » (boîte bleue) doit être sélectionné. Pour une meilleure représentation graphique des résultats du réseau moléculaire, "Direct Cytoscape Preview" (boîte jaune) doit être téléchargé, et la dernière version de Cytoscape doit être utilisée. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

  1. Une liste sera affichée avec tous les clusters de réseautage moléculaires générés. Si une recherche de bibliothèque a été sélectionnée pour générer les résultats, l’identification provisoire des molécules sera affichée dans AllIDs. Sélectionnez Afficher pour les visualiser.
    REMARQUE : Les analyses de données peuvent être motivées pour d’autres résultats (c.-à-d. l’exploitation du génome, les essais biologiques, les molécules de déreplication des bibliothèques, etc.).
  2. Pour analyser le cluster réseau moléculaire, sélectionnez Visualize Network.
    REMARQUE : Chaque amas est composé de nœuds (cercles) et de bords, ce qui représente les molécules et la similitude moléculaire, respectivement. Les molécules démopliquées seront mises en évidence comme un nœud bleu dans le visualiseur réseau de navigateur en ligne.
  3. Dans la boîte d’étiquettes de nœud, sélectionnez la masse des parents (boîte rouge, figure 7).
  4. Dans la boîte d’étiquettes de bord, sélectionnez Cosine ou DeltaMZ pour observer la similitude des nœuds ou la différence de masse entre les nœuds, respectivement (boîte jaune, figure 7).
  5. Dans le cas des analyses multigroupes, cliquez sur Les tartes Draw dans la boîte à colorier des nœuds pour observer la fréquence à laquelle chaque nœud apparaît dans chaque groupe (boîte bleue, figure 7).
    REMARQUE : D’autres choix sont possibles, mais ceux suggérés ci-dessus sont optimaux pour annoter les nœuds de cluster et démêler leurs structures.

Figure 7
Figure 7 : Utilisation du PNB pour visualiser les résultats des grappes moléculaires. Après l’ouverture des clusters moléculaires pour une meilleure visualisation des données, ce qui suit doit être choisi: «Masse des parents» comme étiquettes de nœuds (boîte rouge); "DeltaMZ" comme étiquettes de bord (boîte jaune); et "Draw pies" comme colorant de nœud (boîte bleue). Naviguez à travers le cluster moléculaire et essayez d’annoter tous les nœuds. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

  1. Pour voir tous les succès de la bibliothèque, sélectionnez Voir tous les hits de la bibliothèque (boîte bleue, figure 7).
    REMARQUE: En outre, le MNW peut être téléchargé dans "Direct Cytoscape Preview/Download" (boîte jaune, figure 7), et le fichier peut être ouvert dans la plate-forme Cytoscape (trouvé à 'lt;https://cytoscape.org/ 'gt;) pour plus d’options dans la structure graphique.
  2. La confirmation manuelle des composés démorés et l’élucidation de structure des composés connexes sont nécessaires. Ouvrez les spectres de fragmentations directement dans la plate-forme GNPS ou dans les fichiers bruts d’origine.

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Representative Results

Le protocole a été illustré avec succès à l’aide d’une combinaison d’extraction du génome, d’expression hétérogène et d’approches guidées par le MS/code pour accéder à de nouvelles molécules spécialisées d’analogues de la valinomycine. Le flux de travail génome-molécule pour la cible, la valinomycine (VLM), est représenté dans la figure 8. Streptomyces sp. CBMAI 2042 projet génome a été analysé dans silico, et le faisceau de gène VLM a ensuite été identifié et transféré à un hôte hétérologue. Des souches hétérologues et sauvages de type ont été cultivées en triplicate en utilisant des conditions de fermentation appropriées, cloisonnées avec de l’acétate d’éthyle, et concentrées pour générer l’extrait brut. À partir du produit, les données MS/MS ont été acquises pour générer un profil de métabolite de SP tandem pour le réseautage moléculaire. La figure 9 représente les ions groupés obtenus à partir des données sur la SP/MS provenant de Streptomyces sp. CBMAI 2042 extrait brut, dans lequel les modèles de fragmentation caractéristiques et les similitudes correspondantes de SP suggèrent l’apparition d’une famille moléculaire partageant des caractéristiques structurelles2. Suivant la logique biosynthétique connue et les aperçus bioinformatiques, et soutenu par des spectres MS/MS basés sur les motifs, la structure de quatre cyclodepsipéptides initialement rapportés ont été élucidées, et leurs origines ont été corrélées avec les mêmes faisceaux de gènes biosynthétiques responsables de l’assemblageVLM 32.

Les données de réseautage moléculaire (trouvées à lt;https://gnps.ucsd.edu/ProteoSAFe/status.jsp?task-6f97aa4addfa4d20b505fdb4328b088c-gt;) ont été traitées dans une plate-forme du PNBS et déposées dans un dépôt MASSIVE (MSV00083709). Pour la dépolication, deux stratégies ont été choisies pour remplir le réseau avec des composés précédemment décrits: 1) Déposificateur (trouvé à 'lt;https://gnps.ucsd.edu/ProteoSAFe/status.jsp?task'1a55e768d02649aaa09d78d4778ef3-gt;) et 2) un outil d’identification de produit naturel peptide appelé VarQuest (trouvé à notre publication précédente fournit plus de détails32.

Figure 8
Figure 8 : Flux de travail de l’analyse de séquence du génome silico à l’acquisition de données de SP. (A) Un projet de Stabilisateur sp. CBMAI 2042 est obtenu par le séquençage Illumina MiSeq. (B) Valinomycin BGC identification et annotation. (C) Après avoir transféré l’ensemble du groupe génétique à un hôte approprié, la souche est cultivée. L’extrait d’acétate d’éthyle de la culture est analysé par LC pour obtenir un profil des métabolites secondaires produits. Le chromatogramme montre que la valinomycine, la montanastatine et cinq analogues sont produites par l’expression VLM BGC dans un hôte hétérogène. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 9
Figure 9 : Résultats du réseautage moléculaire. (A) Réseau moléculaire de Streptomyces sp. CBMAI 2042 extrait. Les ions de réseautage moléculaire correspondant à la valinomycine, un composé déjà connu avec le BGC correspondant annoté dans Streptomyces sp. CBMAI 2042 génome, sont regroupés avec des ions liés aux analogues d’abord décrits pour VLM BGC. (B) les spectres de MS et les structures chimiques pour la valinomycine et les analogues connexes sont montrés. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

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Discussion

L’avantage le plus fort de ce protocole est sa capacité à déposifier rapidement les profils métaboliques et à combler l’information génomique avec les données de la SP afin d’élucider les structures de nouvelles molécules, en particulier les analogues structurels2. Sur la base d’informations génomiques, différents produits naturels chemotypes peuvent être étudiés, tels que les polyketides (PK), peptides nonribosomal (NRP), et les produits naturels glycosylés (PNB), ainsi que les BGCs cryptiques. Le dépistage métabolomique donne des preuves de profils BGC activés et de diversité chimique produite par une souche spécifique dans des conditions de laboratoire. Ainsi, un BGC peut être cloné pour diriger la production d’un nouveau composé ou d’analogues inconnus liés à un BGC déjà connu, facilité par des similitudes découvertes par le réseautage moléculaire. Par conséquent, cette procédure aide à distinguer les composés précieux produits par des sources naturelles et peut être utilisé comme guide pour les futures étapes d’isolement, qui sont communes dans les pipelines de produits naturels.

L’extraction du génome à guidage MS a d’abord été décrite dans les domaines de la peptidogenomics41 et de la glycogénomique42. Pour estimer l’étendue de la diversité chimique des produits naturels peptide, Dorrestein et ses collègues ont mis au point une méthode automatisée utilisant la SP et la génomique pour visualiser le lien entre les produits naturels exprimés (chemotype) et leurs grappes génétiques (génotype). Le concept d’extraction du génome guidé par MS a ensuite été décrit alors qu’il utilisait des métabolites spécialisés en peptide. Ici, une méthode pour l’identification des produits naturels glycosylés microbiens (PNB) en utilisant une approche GM et la SP tandem a été appliquée comme outil pour connecter rapidement les chemotypes du PNB (des métabolomes microbiens) avec leurs génotypes biosynthétiques correspondants suivant l’empreinte du sucre.

Le concept de peptidogenomics a été appliqué pour révéler les grappes de gènes de la sténothricine dans Streptomyces roseosporus, fournissant les premiers aperçus de l’utilité large du PNBS comme une plate-forme43. L’extraction du génome basée sur les motifs et le réseautage moléculaire ont finalement été combinés avec la plate-forme26 du PNBS pour faciliter la démolication de nouveaux composés, composés connus, détection de nouveaux analogues et l’élucidation de structure de 35 souches de Salinispora. Cela a conduit à l’isolement et la caractérisation de la retimycine A, un depsipéptide de type quinomycine44. Après l’introduction du PNBS, les approches intégrées de métabolomique et d’extraction du génome sont devenues l’avenue la plus polyvalente pour connecter les réseaux moléculaires aux capacités biosynthétiques45,46,47,48,49,50.

Ce protocole renforce la faisabilité d’utiliser des analyses génomiques et métabolomiques pour étudier la production de composés chimiquement analogues connus et inconnus en quelques étapes tout en consommant de faibles niveaux de matériaux. Le modèle présenté ici est lié à l’identification analogique de valinomycine à partir d’extraits bruts par la dépolication moléculaire de réseautage. La structure des analogues est déduite par la fragmentation de LA SP/MS et suit la logique biosynthétique des BGC VLM clonés.

Différents logiciels sont disponibles pour l’extraction secondaire métabolite clusters gènes biosynthétiques51 et pour l’élucidation métabolite, mais les options open source ont les avantages en raison de mises à jour constantes, et ils sont ouverts à la communauté scientifique. En ce sens, l’antiSMASH et la plate-forme GNPS sont les choix les plus populaires.

Cette procédure générale peut être modifiée pour d’autres méthodologies d’extraction basées sur la source naturelle explorée. Plus d’une méthode d’extraction peut également être combinée selon les propriétés des métabolites (c.-à-d., la polarité, l’hydrophobicité, la capacité de former des micelles), et même des propriétés similaires, différents solvants, ou résine peut obtenir des résultats améliorés. Habituellement, les extraits sont préparés à partir de la culture moyenne liquide, mais il existe une pléthore de méthodes d’extraction disponibles pour isoler les extraits enrichis et dépister tout échantillon biologique d’intérêt.

Lors de l’acquisition des données de SP, l’analyse d’acquisition dépendante des données (DDA) doit être utilisée. Cette question est importante lorsqu’un plus grand nombre de composés sont évalués en une seule injection. Pendant l’exécution du PDD, le nombre maximal de spectres MS/MS de chaque ion précurseur et le nombre maximal d’ions précurseurs différents devraient être compensés. Lors de l’utilisation d’équipements de taux d’analyse rapide, cela peut être réalisé avec des taux d’analyse plus élevés (6 à 10 scans MS/MS par cycle). Cependant, dans l’équipement de taux d’analyse inférieur, les performances de MN ne peuvent être augmentées qu’avec une meilleure résolution chromatographique. Les données les plus complètes pour peupler le réseautage moléculaire devraient être obtenues. Pour l’acquisition de données DE SP, l’énergie de collision fixe est possible, mais les énergies de rampe sont appropriées pour produire des résultats améliorés. Il n’y a pas de conditions optimales qui fonctionneront parfaitement pour tous les échantillons. La réalisation d’une analyse suffisante de la SP est cruciale pour les étapes suivantes. Désormais, les clusters de réseau moléculaire doivent être générés et démorésités selon la procédure.

Une erreur fréquente de dépannage manque des intensités pour les masses. Normalement, cela peut être résolu en introduisant une énergie de collision plus élevée lors de l’analyse. Parfois, aucune corrélation n’est observée entre les spectres et la bibliothèque du PNB, ce qui est très rare. Dans ce cas, assurez-vous que le dossier s’ouvre correctement dans le logiciel DE prévisualisation MS que les erreurs peuvent parfois être créées au cours de l’étape de conversion en fichiers .mzXML.

En ce qui concerne l’extraction du génome, la production la plus précise des plates-formes d’annotation des grappes génétiques sera fournie pour un séquençage du génome entier de meilleure qualité pour les deux, une souche unique ou une exploitation minière indépendante de la culture. Le séquençage de haute qualité générera des informations bioinformatiques de haute qualité pour la déposification des voies biosynthétiques. En revanche, bien que le logiciel de bioinformatique de prédiction de BGC ait été rapidement développé, les prédictions exactes de la fonction génique et des produits putatifs sont encore difficiles, particulièrement en examinant de nouvelles voies et dispositifs biosynthétiques qui ne peuvent pas être prédits dans silico. En outre, certaines machines biosynthétiques sont remarquablement conservées, tandis que l’enzymologie qui est impliquée dans les systèmes hybrides, trans-ATPKs modulaires, et NRPSs sont reconnus comme des exceptions de la règle de colinearity. En ce sens, l’expression hétérologue et les raffinements dans les logiciels de sortie bioinformatique peuvent aider à élucider les fonctions imprévisibles enzymatiques et la biochimie inhabituelle52,53,54. L’enrichissement des bases de données publiques conduira à des prédictions plus précises et la découverte de nouveaux métabolites spécialisés, car le coût pour WGS ne représente pas le handicap pour l’exploitation du génome.

Enfin, les avantages les plus forts des approches intégrées d’extraction de métaabolomic et de génome sont liés à leur faisabilité d’effectuer la décélélication du génotype et du chemotype par l’intermédiaire d’analyses automatisées et à haut débit reliant la génomique, la données métabolomiques pour connecter efficacement les gènes avec les molécules.

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Disclosures

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Acknowledgments

Le soutien financier apporté à cette étude a été fourni par la Fondation de recherche de Sao Paulo - FAPESP (2019/10564-5, 2014/12727-5 et 2014/50249-8 à L.G.O; 2013/12598-8 et 2015/01013-4 à R.S.; et 2019/08853-9 à C.F.F.A). B.S.P, C.F.F.A., et L.G.O. ont reçu des bourses du Conseil national pour le développement scientifique et technologique - CNPq (205729/2018-5, 162191/2015-4, et 313492/2017-4). L.G.O. est également reconnaissant pour le soutien de subvention fourni par le programme Pour les femmes en sciences (2008, Édition brésilienne). Tous les auteurs reconnaissent capeS (Coordination pour l’amélioration du personnel de l’enseignement supérieur) pour soutenir les programmes post-diplôme au Brésil.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acetonitrile Tedia AA1120-048 HPLC grade
Agar Oxoid LP0011 NA
Apramycin Sigma Aldrich A2024 NA
Carbenicillin Sigma Aldrich C9231 NA
Centrifuge Eppendorf NA 5804
Chloramphenicol Sigma Aldrich C3175 NA
Column C18 Agilent Technologies NA ZORBAX RRHD Extend-C18, 80Å, 2.1 x 50 mm, 1.8 µm, 1200 bar pressure limit P/N 757700-902
Kanamycin Sigma Aldrich K1377 NA
Manitol P.A.- A.C.S. Synth NA NA
Microcentrifuge Eppendorf NA 5418
Nalidixic acid Sigma Aldrich N4382 NA
Phusion Flash High-Fidelity PCR Master Mix ThermoFisher Scientific F548S NA
Q-TOF mass spectrometer Agilent technologies NA 6550 iFunnel Q-TOF LC/MS
Sacarose P.A.- A.C.S. Synth NA NA
Shaker/Incubator Marconi MA420 NA
Sodium Chloride Synth NA P. A. - ACS
Soy extract NA NA NA
Sucrose Synth NA P. A. - ACS
Thermal Cycles Eppendorf NA Mastercycler Nexus Gradient
Thiostrepton Sigma Aldrich T8902 NA
Tryptone Oxoid LP0042 NA
Tryptone Soy Broth Oxoid CM0129 NA
UPLC Agilent Technologies NA 1290 Infinity LC System
Yeast extract Oxoid LP0021 NA

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L’extraction du génome guidée par spectrométrie de masse comme outil pour découvrir de nouveaux produits naturels
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