Summary
Questo protocollo descrive il metodo, i materiali, le attrezzature e i passaggi per la preparazione bottom-up di RNA e proteine che producono cellule sintetiche. Il compartimento acquoso interno delle cellule sintetiche conteneva il lisato batterico S30 incapsulato all'interno di un bistrato lipidico (cioè liposomi stabili), utilizzando un metodo di trasferimento dell'emulsione dell'acqua-in-olio.
Abstract
L'approccio di assemblaggio bottom-up per la costruzione di cellule sintetiche è uno strumento efficace per isolare e studiare i processi cellulari in un ambiente di imitazione cellulare. Inoltre, lo sviluppo di sistemi di espressione senza cellule ha dimostrato la capacità di ricostituire i processi di produzione, trascrizione e traduzione delle proteine (DNA-RNA-proteina) in modo controllato, sfruttando la biologia sintetica. Qui descriviamo un protocollo per la preparazione di un sistema di espressione privo di cellule, compresa la produzione di un potente lisato batterico e incapsulando questo lisato all'interno di vescicle giganti di unilamellar a base di lipidi a base di colesterolo (GUV) (cioè liposomi stabili), per formare cellule sintetiche. Il protocollo descrive i metodi per preparare i componenti delle cellule sintetiche, compresa la produzione di lismi batterici attivi, seguiti da una preparazione dettagliata passo-passo delle cellule sintetiche sulla base di un metodo di trasferimento dell'emulsione acqua-in-olio. Questi facilitano la produzione di milioni di cellule sintetiche in modo semplice e conveniente con un'elevata versatilità per la produzione di diversi tipi di proteine. Le cellule sintetiche ottenute possono essere utilizzate per studiare la produzione e l'attività di proteine/RNA in un ambiente isolato, in evoluzione diretta, e anche come piattaforma di somministrazione controllata di farmaci per la produzione on demand di proteine terapeutiche all'interno del corpo.
Introduction
Le cellule sintetiche sono particelle artificiali simili a cellule, che imitano una o più funzioni di una cellula vivente, come la capacità di dividere, formare interazioni di membrana e sintetizzare proteine basate su un codice genetico1,2,3. Le cellule sintetiche che racchiudono sistemi di sintesi proteica priva di cellule (CFPS) possiedono un'elevata modularità grazie alla loro capacità di produrre varie proteine e sequenze di RNA dopo alterazioni nel modello di DNA. Presentando un'alternativa interessante agli attuali approcci di produzione di proteine, i sistemi CFPS si basano su lisa cellule, componenti purificati o componenti sintetici e comprendono tutti i meccanismi di trascrizione e traduzione necessari per la sintesi proteica come ribosomi, RNA polymerasi, aminoacidi e fonti energetiche (ad esempio, 3-fosforocifo e tripofosfato adenina)4,5,6,7,,8,. L'incapsulamento di un sistema CFPS all'interno di vescicoli lipidi consente la produzione semplice ed efficiente di proteine senza dipendere da una cellula vivente10. Inoltre, questa piattaforma permette la sintesi di peptidi che possono degradare all'interno delle cellule naturali, produzione di proteine tossiche per le cellule viventi, e modificare le proteine con aminoacidi non naturali11,12. Le cellule sintetiche sono state utilizzate come modello per scopi di ricerca studiando i componenti cellulari minimi necessari per consentire la vita cellulare da una prospettiva evolutiva1,13. Le cellule sintetiche sono state utilizzate anche per costruire e implementare circuiti genetici e come modelli per l'evoluzione diretta14,15,16. Altri studi si sono concentrati sulla capacità delle cellule sintetiche di imitare l'attività biologica delle cellule naturali, con l'obiettivo di sostituire le cellule naturali danneggiate, come le cellule beta in pazienti con diabete17. Inoltre, la capacità di questi CFPS che incapsulano le cellule sintetiche di produrre una varietà di proteine terapeutiche illustra il suo potenziale per essere incorporato nell'uso clinico18.
Qui descriviamo un protocollo di laboratorio-scala dal basso verso l'alto (Figura 1) per la produzione di RNA e cellule sintetiche che producono proteine sulla base di un sistema CFPS incapsulato in una vescicola lipidica. Questo dimostra il potenziale uso di piattaforme di cellule sintetiche come nuovi sistemi di somministrazione di farmaci per la produzione in loco di un farmaco terapeutico proteico in vivo19. Studi precedenti hanno studiato l'ottimizzazione della reazione CFPS e i processi di preparazione del lisato cellulare4,8,20. Inoltre, sono state applicate diverse tecniche per la preparazione del liposoma di dimensioni cellulari, come i metodi di stabilizzazione delle goccioline microfluidiche e polimeriche21,22,23, che differiscono anche nella composizione lipida dei liposomi24,25,26. Nel protocollo presentato, le cellule sintetiche vengono prodotte utilizzando un metodo di trasferimento dell'emulsione dell'acqua e dell'olio e il processo di incapsulamento viene eseguito a basse temperature (<4 ))5,10,24,27,28. Queste condizioni lievi sono state trovate per essere favorevoli per mantenere l'integrità bio-funzionale del macchinario molecolare, vale a dire ribosomi e proteine27,29,30. La composizione lipidica delle particelle è costituita sia da colesterolo che da 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (POPC). Il primo si trova in tutte le membrane cellulari dei mammiferi ed è essenziale per la stabilità, rigidità e riduzione della permeabilità della membrana, e quest'ultimo imita la composizione fosforlipide mammifera11,13. La trascrizione cellulare e la macchina molecolare di traslazione vengono estratte dal ceppo BL21 (DE3) Escherichia coli (E. coli), che viene trasformato con pAR1219 plasmide sovraesprimendo la polimerasi dell'RNA T7 per aumentare la potenza CFPS e la sintesi proteica. Questo sistema è stato utilizzato per produrre proteine diagnostiche e terapeutiche, con pesi molecolari fino a 66 kDa in vitro e in vivo19,31. Il seguente protocollo fornisce un metodo semplice ed efficace per la produzione del sistema di cellule sintetiche, che può affrontare una vasta gamma di questioni fondamentali associate alla sintesi proteica in natura e può essere utilizzato anche per applicazioni di somministrazione di farmaci.
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Protocol
NOTA: l'illustrazione del protocollo di produzione completo delle cellule sintetiche è illustrata nella Figura 1. In base alle esigenze dell'utente, l'espressione proteica (sezione 3.2) e le parti di formazione di cellule sintetiche (sezione 4) del protocollo possono anche essere eseguite in modo indipendente (con alcuni adattamenti).
1. Preparazione di LisaS30-T7
- Streak placcare i batteri E. coli BL21(DE3) trasformati con la polimerasi T7 RNA che esprime pAR1219 plasmide su una piastra LB-agar integrata con 50 ampicillina di 50 g/mL per ottenere colonie singole.
- Preparare una soluzione di avviamento: inoculare una singola colonia in 5 mL di LB-media integrata con 50 g/mL di ampicillina in un flaastre Erlenmeyer da 100 ml e crescere durante la notte con un frullato di incubazione del pavimento a 250 rpm e 37 . Preparare i duplicati.
- Inoculare ogni antipasto da 5 mL separatamente in 500 mL di file multimediali di TB integrati con 50 g/mL di ampicillina in un pallone da 2 L Erlenmeyer con deflettori e coltivarlo con un frullatore da incubatore a 250 giri/m e 37 gradi centigradi fino a raggiungere OD600 di 0,8-1. Monitorare periodicamente utilizzando uno spettrofotometro.
- Aggiungere 2-3 mL di 100 mM di riserva IPTG (per raggiungere 0,4 - 0,6 mM) per l'induzione dell'espressione della polimerasi dell'RNA T7 e continuare a far crescere la coltura fino a raggiungere OD600.
- Trasferire la soluzione da ogni fiaschetta Erlenmeyer in due tubi di centrifuga sterilizzati da 250 mL.
- Centrifugare ciascuno a 7.000 x g per 10 min a 4 gradi centigradi. Scartare il super-attardato.
NOTA: In questa fase, il pellet batterico può essere conservato a -20 gradi centigradi per alcuni giorni prima di passare ai passi successivi. - Sospendere nuovamente ogni pellet in 250 mL di freddo (4 gradi centigradi) S30 lisato tampone e centrifugare a 7.000 x g per 10 min a 4 gradi centigradi.
NOTA: Il buffer lisato S30 viene utilizzato per mantenere la stabilità delle proteine dopo l'esecuzione della lisi cellulare utilizzando l'omogenizzatore nel passaggio 1.9. Da questo passo in avanti, tutte le fasi fino al 1.12 devono essere effettuate consecutivamente e rapidamente.
NOTA: Prima di procedere al passaggio successivo, pre-raffreddare le punte e le fiale da 1,5 millilitri che saranno necessarie per conservare il lisato - Eliminare il supernatante e sospendere nuovamente tutti i pellet insieme in 15 mL di freddo S30 lysate buffer. Filtrare la sospensione utilizzando il tampone di garza.
NOTA: 15ml di soluzione è dovuto al volume omogeneo min. Va notato che la concentrazione di batteri è anche importante. - Omogeneizzare a una pressione di lavoro di 15.000 psi, con una pressione dell'aria di 4 bar (due passaggi) per la rottura cellulare. Evitare la diluizione della soluzione per un lisato più concentrato e attivo.
- Aggiungere 100 L di 0,1 M DTT (CAUTION) per 10 mL della sospensione omogeneizzata.
- Centrifugare la sospensione a 24.700 x g per 30 min a 4 gradi centigradi.
- Eseguire rapidamente il seguente passaggio per preservare l'attività del lisa: dividere il supernatale uno ad uno in 200 aliquote in fiale preraffreddate da 1,5 mL e immediatamente bloccare congelarle con azoto liquido. Conservare a -80 gradi centigradi per un ulteriore utilizzo.
AVVISO: Il DTT è classificato come irritante e dannoso e deve quindi essere trattato con attenzione.
2. Preparazione dei lipidi in una soluzione di olio
- Sciogliere POPC e colesterolo nel cloroformio (CAUTION) separatamente, ciascuno ad una concentrazione finale di 100 mg/mL. Vorticare ogni fiala separatamente.
- Unire i componenti in una fiala di vetro da 2 mL: aggiungere 50 gradi di POPC in cloroformio, 50 -L di colesterolo nel cloroformio e 500 l'l di olio minerale. Per 100 ll l di cellule sintetiche, sono necessari 2 fiale di lipidi nell'olio.
- Vortice, e poi riscaldare per circa 1 h a 80 gradi centigradi in un cappuccio chimico per far evaporare il cloroformio. Assicurarsi che si sia verificata l'evaporazione completa seguendo il tempo/condizioni specificato e monitorando il volume della soluzione.
NOTA: la soluzione lipidi-in-olio risultante può essere conservata a temperatura ambiente per un massimo di due settimane. Per migliorare i risultati, si consiglia di utilizzare una preparazione fresca prima di ogni esperimento. I rapporti di lipidi e colesterolo possono essere alterati in base alla composizione della membrana desiderata. Un'alta concentrazione di colesterolo può portare alla formazione di aggregati nella soluzione finale delle cellule sintetiche.
AVVISO: il cloroformio è classificato come irritante e dannoso e deve quindi essere trattato con cura e in aree con estrazione dei fumi.
3. Preparativi di soluzioni esterne, pre-interne e di alimentazione
- Preparazione di soluzioni azionarie
- Preparare le soluzioni azionarie elencate nella tabella 2 utilizzando acqua ultrapura (UPW).
NOTA: Le soluzioni stock devono essere preparate in anticipo e conservate a -20 gradi centigradi fino a un ulteriore utilizzo. Il reagente 7 tende a formare aggregati. Il riscaldamento a 37 gradi centigradi ridurrà l'aggregazione. Una leggera aggregazione non influenzerà in modo significativo la reazione. Reagent 8 soluzione è lattiginoso e torbido.
- Preparare le soluzioni azionarie elencate nella tabella 2 utilizzando acqua ultrapura (UPW).
- Soluzione esterna
- Sciogliere il glucosio in DNase/RNase-free H2O ad una concentrazione finale di 200 mM.
- Per 100 l di soluzione interna, preparare 1,6 mL di soluzione esterna.
- Soluzione pre-interna
- Aggiungere i reagenti 1-14 in base agli importi e alla concentrazione elencati nella tabella 2. Ad esempio, per un volume finale di cellule sintetiche di 100 l, preparare 100 l di soluzione interna.
NOTA: UPW deve essere aggiunto per completare il volume finale richiesto. In questa fase, la miscela può essere conservata a 4 gradi centigradi per alcune ore.
- Aggiungere i reagenti 1-14 in base agli importi e alla concentrazione elencati nella tabella 2. Ad esempio, per un volume finale di cellule sintetiche di 100 l, preparare 100 l di soluzione interna.
- Soluzione di alimentazione
- Aggiungere tutti i reagenti in base agli importi e alla concentrazione elencati nella tabella 3.
NOTA: utilizzare il rapporto 1:1 della soluzione di alimentazione: soluzione interna. Per un volume finale di cellule sintetiche di 100 l, preparare 100 l di soluzione di alimentazione. Si raccomanda di preparare un piccolo volume in eccesso di soluzione esterna, interna e di alimentazione.
- Aggiungere tutti i reagenti in base agli importi e alla concentrazione elencati nella tabella 3.
4. Preparazione di cellule sintetiche
NOTA: I seguenti volumi sono regolati per la preparazione di 100 l di cellule sintetiche.
- Cellule sintetiche che producono proteine
- In un tubo da 15 mL, mettere 12 mL della soluzione esterna e aggiungere lentamente, sopra uno strato, di 500 l di lipidi in soluzione di olio. Incubare a temperatura ambiente per 20 min.
- Per finalizzare la preparazione interna della soluzione: mescolare gli ingredienti interni della soluzione sul ghiaccio tritato fino a un volume finale di 100 gradi l scongelando e aggiungendo S30-T7 Lysate (reagente 15) e plasmide di DNA (reagente 16) alla miscela immagazzinata.
- Alla seconda fiala di vetro da 2 mL con 500 litri di lipidi in soluzione ad olio, aggiungere 100 l della soluzione interna. Pipette su e giù vigorosamente per 1 minuto e vortice per un altro minuto al livello cinque.
- Incubare per 10 min di ghiaccio tritato e aggiungere lentamente l'emulsione risultante sopra la fase dell'olio nel tubo da 15 mL (da 4.1.1).
- Centrifuga per 10 min a 100 x g e 4 gradi centigradi e poi centrifuga per 10 min a 400 x g e 4 gradi centigradi. Alla fine della centrifuga, deve essere osservato un pellet nella parte inferiore del tubo.
NOTA: L'utilizzo di un rotore di centrifuga a benna oscillante è preferito qui per acquisire una migliore copertura di un secondo strato di lipidi durante il passaggio delle goccioline di acqua-in-olio attraverso l'interfase. Nel caso in cui non ci sia un pellet osservabile, la velocità di centrifugazione può essere aumentata a 1000 x g. In caso contrario, vedere la sezione Discussione che fa riferimento alla gravità specifica della soluzione esterna. - Estrarre il pellet.
- Rimuovere lo strato di olio in eccesso.
- Utilizzare una punta di pipetta tagliata con circa 400 ll di soluzione esterna per estrarre il pellet. Rilasciare la soluzione esterna passando attraverso la fase dell'olio per raccogliere solo il pellet nella fase acquosa.
- Pulire la punta dopo l'estrazione del pellet per evitare il trasferimento di resti di olio e trasferire il pellet in un tubo pulito da 1,5 mL.
- Centrifuga per 10 min a 1.000 x g e 4 gradi C, rimuovere il supernatante e sospendere nuovamente il pellet in 100 gradi di soluzione di alimentazione (1:1 rapporto di soluzioni interne:alimentazione).
NOTA: Anche qui può essere utilizzato un rotore di centrifuga ad angolo fisso. - Per l'espressione proteica, incubare per 2 ore a 37 gradi centigradi senza agitare.
NOTA: il tempo di incubazione ottimale varia tra le diverse proteine. - Valutare la quantità di proteine prodotta utilizzando un metodo adatto in base alle proprietà della proteina bersaglio.
- Gruppi di controllo consigliati
- Soluzione interna e conferma dell'attività lysate
- Preparare una soluzione interna completa (con DNA e lisato S30-T7).
- Immediatamente incubare la reazione di cui sopra utilizzando uno shaker incubatore pavimento a 250 rpm o un termomixer a 1200 rpm, ad una temperatura costante di 37 gradi centigradi per 2 h.
NOTA: Regolare il tempo di incubazione in modo che corrisponda al tempo di incubazione delle cellule sintetiche.
- Cellule sintetiche
- Gruppo di controllo negativo: Preparare il protocollo presentato in 4.1 con soluzione interna senza DNA.
- Controllo positivo: Preparare il protocollo presentato in 4.1 con soluzione interna contenente una codifica plasmid T7 per un gene reporter.
NOTA: aggiungere un gruppo di controllo positivo composto da un gene reporter, ad esempio sfGFP, accanto ai gruppi di test per garantire la fase di efficienza di incapsulamento.
- Soluzione interna e conferma dell'attività lysate
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Representative Results
Presentiamo un protocollo per la preparazione di cellule sintetiche incapsulando un sistema S30-T7 CFPS basato su BL21 E. coli all'interno di vescicle lipidiche. Nella figura 2viene presentata una descrizione schematica del processo di preparazione che include un'immagine di ogni fase. Il successo del processo di preparazione delle cellule sintetiche dipende dalle prestazioni appropriate di ogni fase ed eseguito da diversi parametri. Il protocollo deve essere regolato per accogliere la produzione di una proteina specifica.
Plasmids esprimendo la super-cartella proteica del modello Green Fluorescent Protein (sfGFP) e Renilla Luciferase sotto il promotore di T7 sono stati introdotti nelle reazioni sfuse CFPS e nelle cellule sintetiche, e la produzione di proteine è stata valutata utilizzando diversi metodi, tra cui macchia occidentale, citometria di flusso, microscopia e spettroscopia (Figura 3). Nella produzione di sfGFP-Suaproteina a 6 marcature ( 27 kDa32) viene presentata la produzione di macchie occidentali nella Figura 3A. Un campione di 30 celle sintetiche diluite 6 pieghe è stato mescolato con 10 -L di un comune buffer campione SDS-PAGE (contenente i detergenti solfato di sodio dodecyl (SDS) e z-mercaptoetanolo) e bollito per 10 min (95 oC). Abbiamo scoperto che la combinazione di calore e detergenti nel buffer del campione è sufficiente per smontare le vesciche e per consentire il funzionamento delle proteine nel gel SDS-PAGE. Il rilevamento delle proteine è stato effettuato utilizzando anticorpi primari policlonali anti-His (diluito 1:12.000). Come previsto, mentre la produzione di proteine viene rilevata in campioni contenenti modelli di DNA codificanti sfGFP ("DNA sfGFP"), nessuna proteina viene osservata nei campioni di controllo negativi in cui il modello di DNA è stato escluso ("-DNA"). I campioni di sfGFP purificato e sfGFP purificato incapsulati all'interno della membrana delle cellule sintetiche ('sfGFP (incapsulato)), sono utilizzati come controlli positivi per la produzione sfusa sfGFP CFPS e per la sua sintesi all'interno di cellule sintetiche, respectivley. Questo metodo può essere applicato a diversi tipi di proteine. Secondo Krinsky et al.19, la resa di produzione di sfGFP ottenuta nell'ambito del protocollo dettagliato è di 380 g/mL in soluzione CFPS e 5,3 g/mL, quando la soluzione CFPS è incapsulata all'interno di vescicche lipidiche.
Quando la proteina prodotta all'interno delle cellule sintetiche è fluorescente, la sua produzione può essere valutata utilizzando metodi basati su microscopia e citometria di flusso. Abbiamo analizzato le cellule sintetiche utilizzando un microscopio fluorescente con un filtro per la fluorescenza GFP (Figura 3B). Poiché i componenti CFPS hanno alcuni autofluorescenti, i parametri di acquisizione dell'immagine devono essere adattati secondo un campione di controllo negativo appropriato (cellule sintetiche senza modello di DNA, per esempio).
Inoltre, abbiamo usato la citometria di flusso per determinare l'intensità media della fluorescenza delle cellule sintetiche che producono sfGFP e la percentuale di cellule sintetiche attive, che possono produrre proteine al loro interno (Figura 3C I&II). Sono stati raccolti 10.000 eventi per ogni campione analizzato. La produzione di cellule sintetiche, che è descritto in questo protocollo, di solito produce una popolazione attiva del 21-25% all'interno di una soluzione con una concentrazione approssimativa di 107 cellule sintetiche /mL. La leggera intensità di fluorescenza presentata dai campioni "-DNA" nella figura 3C II è dovuta all'autofluorescenza di diversi componenti nella reazione CFPS come il lisato S30.
L'analisi rappresentativa delle dimensioni basata sul segnale GFP (diametro) delle cellule sintetiche preparate con il metodo sopra descritto mostra un valore medio di 2,4 0,5 m(Figura 3D II). Poiché la formazione di acqua nell'emulsione dell'olio in questo metodo è il risultato dell'applicazione di forze meccaniche, la distribuzione delle dimensioni delle particelle potrebbe essere influenzata da diversi fattori, come il metodo e la velocità di pipettaggio dell'emulsione su-e-giù, il modello della macchina miscelatrice vortice, ecc.
Per testare la versatilità della produzione proteica delle cellule sintetiche, è stata analizzata l'espressione della proteina reporter Renilla luciferate all'interno delle cellule sintetiche (Figura 3E). Il saggio ha quantificato l'attività di Renilla luciferasi misurando la luminescenza generata dalla reazione enzimatica di luciferate e del suo substrato, h-coelenterazina. Per indurre la reazione ezimatica, è stata aggiunta alle cellule sintetiche una concentrazione finale di 1 M di h-coelenterazina (volume del campione di 25 -L) poco prima della misurazione. Il campione "-DNA", che non contiene il modello di DNA che codifica la luciferasi, è stato utilizzato come controllo negativo per testare la luminescenza a causa dell'ossidazione non enzimatica del substrato. La luminescenza è stata misurata utilizzando un lettore di lamiere.
Figura 1: Illustrazione del processo per il tipico protocollo di preparazione delle cellule sintetiche. Il processo è suddiviso in due fasi. Fase 1: Preparazioni pre-sperimentazione, tra cui purificazione del plasmide del DNA, preparazione del lisato S30-T7, preparazione delle soluzioni di magazzino necessarie per le soluzioni interne e di alimentazione, preparazione della soluzione lipidica e preparazione della soluzione esterna. Fase 2: formazione di cellule sintetiche che include l'alimentazione e la preparazione di soluzioni interne, preparazione e analisi delle cellule sintetiche. Un esempio del volume richiesto di ogni ingrediente per la preparazione di 100 l di soluzioni di cellule sintetiche è presentato in blu tra parentesi. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Illustrazione schematica del protocollo di preparazione delle cellule sintetiche. Un'immagine di un processo ben eseguito illustra ogni fase del protocollo. Questa cifra è stata modificata da Krinsky et al.19. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Risultati rappresentativi della produzione di sfGFP e Renilla luciferate all'interno di cellule sintetiche. (A) Un'analisi western della produzione di sfGFP-His6 sia nelle reazioni sfuse di CFPS che all'interno delle cellule sintetiche. Il rilevamento delle proteine è stato effettuato utilizzando anticorpi primari anti-His policlonali (diluiti 1:12.000). purificato sfGFP-His6 è stato utilizzato come un controllo positivo (7,8 g). sfGFP (incapsulato) è il controllo positivo di sfGFP purificato incapsulato in cellule sintetiche. I campioni senza modelli di DNA sono stati usati come controllo negativo per l'analisi della produzione ("-DNA"). (B) Immagini rappresentative di sfGFP che producono cellule sintetiche scattate con un microscopio fluorescente con un campo luminoso e un filtro GFP. Barre di scala - 50 x (C) Analisi della citometria I&II Flow di sfGFP che produce attività di cellule sintetiche (dati raccolti utilizzando l'analizzatore digitale a 4 laser). I campioni sono stati misurati dopo 3 h di incubazione. Sono stati raccolti 10.000 eventi per ogni campione analizzato. I filtri FSC (500 V) e SSC (300 V) sono stati utilizzati per definire la popolazione totale di cellule sintetiche. Quindi, è stato utilizzato un filtro FITC (600 V) per rilevare la fluorescenza GFP.. (I) Il calcolo della popolazione di cellule sintetiche attive [%] si basava sulla soglia di intensità della fluorescenza GFP, definita dal campione "-DNA" (istogramma rosso), che consente un errore di 1 %. (II) Intensità media di fluorescenza di sfGFP che produce cellule sintetiche. Questo valore è stato calcolato dalla popolazione di cellule sintetiche attive e normalizzato al campione "-DNA" dividendo la fluorescenza media delle cellule sintetiche attive per la media delle cellule sintetiche senza sfGFP-DNA. (D) Analisi delle dimensioni delle cellule sintetiche I&II. Lo spettro delle emissioni è stato rilevato rispettivamente da 505-560 nm e 642-745 nm per gFP e segnali di campo luminoso. (I) Un'immagine rappresentativa delle cellule sintetiche analizzate. (II) Distribuzione delle dimensioni delle cellule sintetiche. È stata eseguita l'analisi e le distribuzioni del diametro delle cellule sintetiche attive sono state calcolate in base al segnale GFP. (E) Produzione di Renilla luciferasi attive all'interno di cellule sintetiche. L'attività di Luciferase è stata quantificata con misurazioni della luminescenza dopo l'aggiunta di 1 m h-coelenterazine utilizzando un lettore di lamierie e presentata come intensità di luce [RLU] x 106. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| Tabella 1: Preparazione di soluzioni di buffer e stock. | |
| Commenti | |
| Luria Bertani (LB) agar (1,5%) piatto: | Preparare e sterilizzare. Aggiungere l'ampicillina ad una concentrazione finale di 50 g/mL solo dopo il raffreddamento a temperatura ambiente. |
| 10 g/L Bacto-tryptone | |
| 10 g/L di cloruro di sodio (NaCl) | |
| 5 g/L di estratto di Bacto-Yeast | |
| 15 g/L Agar agar purificato | |
| Ampicillina da 50 g/mL | |
| Supporti LB (20 mL): | Supporti minimi. Preparare e sterilizzare in anticipo. Poco prima di inoculare i batteri, aggiungere l'ampicillina ad una concentrazione finale di 50 g/mL. |
| 10 g/L Bacto-tryptone | |
| 10 g/L di cloruro di sodio (NaCl) | |
| 5 g/L di estratto di Bacto-Yeast | |
| Ampicillina da 50 g/mL | |
| Terrific Broth (TB) media (1 L): | Rich media. Preparare e sterilizzare in anticipo. Poco prima di inoculare i batteri, aggiungere l'ampicillina ad una concentrazione finale di 50 g/mL. |
| 12 g/L Bacto-tryptone | |
| Estratto di Bacto-Lievito da 24 g/L | |
| 4% (v/v) Anhydrous glicerolo | |
| 2,32 g/L K2HPO4 | |
| 12,54 g/L KH2PO4 | |
| Ampicillina da 50 g/mL | |
| S30 lysate buffer (1.5 L): | Preparare e sterilizzare in anticipo (esclusi DTT e 2-mercaptoetanolo). Conservare a -4 gradi centigradi. |
| 10 mM Tris-acetato a pH 7,4 | Base di Trisma. Preparare e regolare il pH a 7,4 utilizzando l'acido Acetic. |
| Acetato di magnesio da 14 mM | |
| Acetato di potassio da 60 mM | |
| DTT da 1 mM | Aggiungi appena prima dell'uso |
| 0,5 mL/L 2-mercaptoetanolo | Aggiungi appena prima dell'uso |
| 1 M HEPES-KOH (pH - 8): | Sciogliere HEPES ad una concentrazione finale di 1 M. Regolare a pH 8 utilizzando la soluzione KOH. |
| HEPES | |
| Idrossido di potassio (KOH) | |
| Tabella 2: Composizione interna della soluzione. | ||||||||||
| Volume finale della soluzione interna richiesto | ||||||||||
| Numero | Reagente | Conc di magazzino. | Conc finale. | 25 ll | 50 ll | 100 ll | 200 l | 300 lL | 400 x L | |
| 1 | HEPES KOH pH 8 | 1 M | 55mm | 1.375 | 2.75 | 5.5 | 11 | 16.5 | 22 | Soluzione pre-interna |
| 2 | Acetato di magnesio | 1 M | 14 mM | 0.35 | 0.7 | 1.4 | 2.8 | 4.2 | 5.6 | |
| 3 | Acetato di potassio | 1 M | 50mm | 1.25 | 2.5 | 5 | 10 | 15 | 20 | |
| 4 | Acetato di ammonio | 5,2 M | 155 mM | 0.75 | 1.5 | 3 | 6 | 9 | 12 | |
| 5 | PIOLO 6000 | 50% | 3% | 1.5 | 3 | 6 | 12 | 18 | 24 | |
| 6 | 3-PGA | 0,5 M | 40 mM | 2 | 4 | 8 | 16 | 24 | 32 | |
| 7 | Aminoacidi - miscela I | 50m | 2,5 mM | 1.25 | 2.5 | 5 | 10 | 15 | 20 | |
| 8 | Aminoacidi - miscela II | 50m | 2,5 mM | 1.25 | 2.5 | 5 | 10 | 15 | 20 | |
| 9 | Atp | 100 mM | 1,2 mM | 0.3 | 0.6 | 1.2 | 2.4 | 3.6 | 4.8 | |
| 10 | Gtp | 50mm | 1 mM | 0.5 | 1 | 2 | 4 | 6 | 8 | |
| 11 | Utp | 100 mM | 0,8 mM | 0.2 | 0.4 | 0.8 | 1.6 | 2.4 | 3.2 | |
| 12 | IPTG (informazioni in stato IPTG) | 100 mM | 1 mM | 0.25 | 0.5 | 1 | 2 | 3 | 4 | |
| 13 | Saccarosio | 2 M | 200mm | 2.5 | 5 | 10 | 20 | 30 | 40 | |
| 14 ** | H2O UPW | ** | ** | ** | ** | ** | ** | |||
| 15 | S30-T7 Lysate | 34% | 8.5 | 17 | 34 | 68 | 102 | 136 | ||
| 16 * | Plasmide di DNA | 10 g/mL | * | * | * | * | * | * | ||
| Tabella 3: Composizione della soluzione di alimentazione. | |||||||||
| Volume finale della soluzione di alimentazione richiesta | |||||||||
| Numero | Reagente | stock conc. | conc finale. | 25 ll | 50 ll | 100 ll | 200 l | 300 lL | 400 lL |
| 1 | HEPES KOH pH 8 | 1 M | 83,3 mM | 2.08 | 4.17 | 8.33 | 16.67 | 25 | 33.33 |
| 2 | Acetato di magnesio | 1 M | 21,2 mM | 0.53 | 1.06 | 2.12 | 4.24 | 6.36 | 8.48 |
| 3 | Acetato di potassio | 1 M | 75,5 mM | 1.89 | 3.78 | 7.55 | 15.1 | 22.66 | 30.2 |
| 4 | Acetato di ammonio | 5,2 M | 236,4 mM | 1.14 | 2.27 | 4.55 | 9.09 | 13.64 | 18.18 |
| 5 | PEG - 6000 | 50% | 4.54% | 2.27 | 4.54 | 9.08 | 18.16 | 27.24 | 36.32 |
| 6 | 3-PGA | 0,5 M | 60,1 mM | 3 | 6.01 | 12.01 | 24.02 | 36.04 | 48.04 |
| 7 | Aminoacidi - miscela I | 50mm | 3,8 mM | 1.89 | 3.78 | 7.56 | 15.12 | 22.68 | 30.24 |
| 8 | Aminoacidi - miscela II | 50mm | 3,8 mM | 1.89 | 3.78 | 7.56 | 15.12 | 22.68 | 30.24 |
| 9 | Atp | 100 mM | 1,8 mM | 0.45 | 0.91 | 1.81 | 3.62 | 5.43 | 7.24 |
| 10 | Gtp | 50mm | 1,5 mM | 0.76 | 1.51 | 3.02 | 6.04 | 9.06 | 12.08 |
| 11 | Utp | 100 mM | 1,2 mM | 0.3 | 0.61 | 1.21 | 2.42 | 3.63 | 4.84 |
| 12 | IPTG (informazioni in stato IPTG) | 100 mM | 1,5 mM | 0.38 | 0.76 | 1.51 | 3.02 | 4.53 | 6.04 |
| 13 | Glucosio | 2 M | 200mm | 2.5 | 5 | 10 | 20 | 30 | 40 |
| 14 | H2O UPW | 5.92 | 11.83 | 23.7 | 47.38 | 71.06 | 94.76 | ||
| Tabella 4: Soluzioni necessarie per la preparazione delle celle sintetiche. | |
| Soluzione e materiali necessari | Commenti |
| Lipidi nell'olio | Conservare a temperatura ambiente fino all'uso. Preparato secondo la sezione 2 |
| Soluzione esterna | Preparato secondo la sezione 3.1 |
| Soluzione interna | Preparato secondo la sezione 3.2. |
| Preparare i test e controllare i campioni in base alla sezione 4.1. | |
| Mantenere il ghiaccio tritato fino all'uso. | |
| Soluzione di alimentazione | Preparato secondo la sezione 3.3. |
| Mantenere il ghiaccio tritato fino all'uso. | |
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Discussion
Questo protocollo introduce un metodo semplice e conveniente per la produzione di grandi quantità di cellule sintetiche che producono proteine. La resa delle cellule attive dipende da un'attenta e accurata esecuzione del protocollo con particolare attenzione a diversi passaggi critici. Nella sezione di preparazione del lisa di questo metodo, è essenziale raggiungere la densità di batteri appropriata prima della lisi cellulare per ottenere una quantità sufficiente di proteine nel lisato batterico. In secondo luogo, il processo di lisi deve essere eseguito a 4 gradi centigradi e il lisa congelato rapidamente con azoto liquido per mantenere l'attività proteica. Inoltre, in questo protocollo abbiamo usato cellule Di. coli BL21(DE3) trasformate con pAR1219 plasmide che esprime la polimerasi dell'RNA T7. Nei casi in cui viene utilizzato un ceppo diverso di batteri, possono essere necessarie modifiche alla concentrazione di lisato per raggiungere una quantità soddisfacente di polimerasi di RNA e ribosomi. Anche quando viene utilizzato lo stesso ceppo batterico, diverse produzioni di lisate possono avere una certa variabilità batch-to-batch.
La sezione di produzione vescicola include anche un paio di passaggi significativi. La solubilizzazione dei lipidi e la rimozione del cloroformio dall'olio minerale sono importanti per stabilire l'emulsione acqua-in-olio. La centrifugazione delle goccioline acqua-in-olio nel buffer acquoso esterno è anche un passo chiave nel protocollo per generare cellule sintetiche con un bistrato lipidico. Cambiamenti nella soluzione interna delle vesciche e la composizione lipidica potrebbe portare a uno strato di goccioline all'interfase olio-acqua senza alcun pellet osservabile. Per superare questo problema, una soluzione rapida consiste nell'aumentare la velocità di centrifugazione a 1.000 x g nella fase di trasferimento dell'emulsione. Nel caso in cui questo non risolva il problema, la gravità specifica della soluzione acquosa esterna può essere modificata assicurando che la soluzione interna avrà una gravità specifica superiore rispetto alla soluzione esterna. Inoltre, l'osmolalità della soluzione interna può anche variare tra diverse fonti di lisa e produzioni, che vanno tra 800-1100 mOsm /kg. La variabilità nell'osmolalità della soluzione interna è dovuta principalmente alle mutevoli concentrazioni del lisato durante il suo processo di produzione. Di solito questo non porta a cambiamenti significativi nella produzione di proteine, ma una grande diluizione potrebbe portare a una resa ridotta a causa delle basse concentrazioni della trascrizione e degli enzimi di traduzione nel lisato stesso. Misurare la concentrazione totale di proteine in ogni lotto di lisato può aiutare a regolare le concentrazioni di lisato nella soluzione interna per mantenere valori costanti (circa 22 mg/mL misurati da Bradford assay).
Tuttavia, questo metodo ha alcune limitazioni che dovrebbero essere menzionate. Non tutte le cellule sintetiche generate sono attive e in grado di produrre proteine a causa dell'incapsulamento incompleto di tutti i componenti richiesti. Abbiamo misurato circa il 21-25% delle cellule attive quando si produce sfGFP che esprimono cellule sintetiche utilizzando la citometria di flusso (non sono state osservate differenze significative tra cellule attive e inattive). I residui in eccesso di olio e lipidi occasionalmente rimangono nella membrana lipidica del bistrato dopo il trasferimento delle cellule sintetiche nella fase acquosa. Ottimizzare le concentrazioni di lipidi e colesterolo nella fase di olio può migliorare questo problema. È anche importante notare che la distribuzione delle dimensioni delle cellule sintetiche ottenute è abbastanza ampia rispetto ai metodi microfluidici alternativi, con vesciche che vanno da circa 1-50 m.
L'alto rendimento del metodo di trasferimento dell'emulsione lo rende particolarmente adatto per le cellule sintetiche che incapsulano sistemi di sintesi proteica priva di cellule per la produzione terapeutica di proteine. Diverse variazioni del metodo di trasferimento dell'emulsione sono state utilizzate negli studi sulle cellule sintetiche e hanno incluso cambiamenti5nella procedura di preparazione dell'olio, composizione della membrana, volume del campione, soluzione interna al rapporto olio e velocità di centrifuga5,24,28.28 Metodi di stabilizzazione delle goccioline microfluidiche e polimerici sono stati utilizzati anche per la preparazione di cellule sintetiche, tuttavia, l'incapsulamento dell'intero sistema CFPS non è stato ancora eseguito con questi metodi21,22,23.
Le cellule sintetiche ottenute con questo metodo sono state mostrate in vivo per produrre proteine e trattare il cancro nei modelli murini19. Le capacità di queste cellule possono essere ulteriormente ampliate in futuro al di là dell'espressione proteica. L'integrazione di altri processi cellulari come la comunicazione cellulare, la modifica del citoscheletro e la divisione cellulare nelle cellule sintetiche sono state recentemente descritte33,34,35,36. La sostituzione del lisato batterico con il lisato delle cellule eucariotiche consentirà l'espressione di proteine con maggiore complessità e modifiche post-traduzionali, e sarà forse meno immunogenica anche senza una procedura di pulizia, aprendo quindi più frontiere terapeutiche37.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato supportato da ERC-STG-2015-680242.
Gli autori riconoscono anche il sostegno del Technion Integrated Cancer Center (TICC); il Russell Berrie Nanotechnology Institute; il Lorry I. Lokey Interdisciplinary Center for Life Sciences & Engineering; il Ministero dell'Economia di Israele per una borsa di studio Kamin (52752); Il Ministero israeliano della tecnologia scientifica e dello spazio – Ufficio del Capo Scienziato (3-1878); la Israel Science Foundation (1778/13, 1421/17); l'Associazione europea contro il cancro (2015-0116); la Fondazione tedesco-israeliana per la ricerca scientifica e lo sviluppo di una borsa di studio GIF Young (I-2328-1139.10/2012); il programma IRG FP-7 dell'Unione europea per una sovvenzione per l'integrazione di carriera (908049); il Phospholipid Research Center Grant; una Rosenblatt Foundation for cancer research, una Sovvenzione della Mallat Family Foundation; e la Fondazione unger Family. A. Schroeder riconosce alon e alle borse di studio Taub. O. Adir riconosce le borse di studio Sherman e Gutwirth. G. Chen riconosce la Compagnia Sherman. N. Krinsky riconosce la baronessa Ariane de Rothschild Women Doctoral Program dalla Fondazione Rothschild Caesarea.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| A. Reagents required for step 1 (S30-T7 lysate preparation) | |||
| E.coli BL21 (DE3) | NEB | C2527 | E.coli BL21 (DE3). |
| pAR1219 | Sigma | T2076 | TargeTron vector for transformation. |
| Stock solution of 50 mg/mL Ampicillin | Sigma | A9518 | Stored at -20 °C. |
| 10 g/L Bacto-tryptone | BD Bioscience | 211705 | For preparation of Luria Bertani (LB) agar (1.5%) plate. |
| 10 g/L Sodium chloride (NaCl) | Bio-Lab | 19030591 | |
| 5 g/L Bacto-Yeast extract | BD Bioscience | 212750 | |
| 15 g/L Agar agar purified | Merck | 1.01614.5007 | |
| 50 µg/mL Ampicillin | Sigma | A9518 | |
| 10 g/L Bacto-tryptone | BD Bioscience | 211705 | For preparation of Luria Bertani (LB) media (20 mL). |
| 10 g/L Sodium chloride (NaCl) | Bio-Lab | 19030591 | |
| 5 g/L Bacto-Yeast extract | BD Bioscience | 212750 | |
| 50 µg/mL Ampicillin | Sigma | A9518 | |
| 12 g/L Bacto-tryptone | BD Bioscience | 211705 | For preparation of Terrific Broth (TB) media (1 L). |
| 24 g/L Bacto-Yeast extract | BD Bioscience | 212750 | |
| 4% (v/v) Glycerol anhydrous | Bio-Lab | 7120501 | |
| 2.32 g/L K2HPO4 | Spectrum chemical | P1383 | |
| 12.54 g/L KH2PO4 | Spectrum chemical | P1380 | |
| 50 µg/mL Ampicillin | Sigma | A9518 | |
| Stock solution of 100 mM Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) | INALCO | INA-1758-1400 | Filtered using 0.2 µm hydrophilic PVDF syringe filter. |
| Stock solution of 0.1 M dithiothreitol (DTT) | TCI | D1071 | Filtered using 0.2 µm hydrophilic PVDF syringe filter. |
| 10 mM Tris-acetate at pH = 7.4 | Sigma | T1503 | S30 lysate buffer (1.5 L) |
| 14 mM magnesium acetate | Merck | 1.05819.0250 | |
| 60 mM potassium acetate | Carlo Erba | 470147 | |
| 1 mM DTT | TCI | D1071 | |
| 0.5 mL/L 2-mercaptoethanol | Sigma | M6250 | |
| Equipment required for step 1 | |||
| 100 mL sterilized Erlenmeyer flasks | Thermo Scientific | 50-154-2846 | 2 flasks |
| 2 L sterilized Erlenmeyer flasks with baffles | KIMAX-KIMBLE | 25630 | 2 flasks |
| Floor incubator shaker | MRC | TOU-120-2 | Laboratory shaker incubator 450x450mm, 400rpm, 70 °C |
| Centrifuge | Thermo Scientific | 75004270 | (75003340) - Fiberlite F10-6 x 100 LEX Fixed-Angle Rotor. Should enable at least 13,000 x g. * Pre-cooled to 4 °C. |
| High pressure homogenizer | AVESTIN | EmulsiFlex-C3 | Pre-cooled to 4 °C. |
| -80oC freezer | SO-LOW | U85-18 | |
| Sterilized 1.5 mL plastic tubes | Eppendorf | 30120086 | Preferably pre-cooled to -20 °C. |
| Spectrophotometer | TECAN | IN-MNANO | Infinite M200 pro |
| 96-well transparent plate | Thermo Scientific | 167008 | |
| Sterilized graduated cylinder | Corning | ||
| Sterilized centrifuge tubes | Eppendorf | 30120086 | Preferably pre-cooled to -20 °C. |
| Sterilized pipette tips | Corning | Preferably pre-cooled to -20 °C. | |
| Crushed ice bucket | Bel-Art | M18848-4001 | |
| Small liquid nitrogen tank | NALGENE | 4150-4000 | |
| B. Reagents required for step 3 (lipids in oil solution preparation): | |||
| 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (POPC) | Lipoid | 556400 | Powder |
| Cholesterol | Sigma | C8667 | Powder |
| Chloroform | Bio-Lab | 3082301 | |
| Mineral oil | Sigma | M5904 | Light oil |
| Equipment required for step 2 | |||
| Vortex mixer | Scientific industries | SI-0256 | |
| Heating block | TECHNE | FDB03AD | Pre-heated to 80 °C. Should enable controlled temperature. |
| 2 mL screw neck glass vials | CSI Analytical Innovations | VT009M-1232 | For a larger scale, use 50 mL falcons and evaporate the chloroform using rotary evaporator. |
| 9mm Screw Cap | CSI Analytical Innovations | C395R-09LC | |
| C. Reagents required for step 3 (inner and feeding reaction mixtures): | |||
| HEPES | Spectrum | H1089 | 1 M HEPES-KOH (pH = 8) - pH buffer |
| Potassium hydroxide (KOH) | Frutarom | 55290 | |
| 1 M Magnesium acetate | Merck | 1.05819.0250 | Co-factor and negative charge stabilizor. |
| 1 M Potassium acetate | Carlo Erba | 470147 | Negative charge stabilizor. |
| 5.2 M Ammonium acetate | Merck | 1.01116.1000 | Stabilizes negative charge. |
| 50% (w/v) Polyethylene glycol 6000 (PEG) | Merck | 8.07491.1000 | Increases the concentration of the macromolecules. |
| 0.5 M 3-phosphoglycerate (3-PGA) | Sigma | P8877 | Secondary energy source. |
| 50 mM Amino acids mixture I | Sigma | LAA21-1KT | Amino acids additive. Contains: 50 mM of each of the following 17 natural amino acids - alanine, arginine, asparagine, aspartic acid, cysteine, glutamine, glutamic acid, glycine, histidine, isoleucine, leucine, lysine, methionine, proline, serine, threonine, and valine. |
| 50 mM Amino acids mixture II | Sigma | LAA21-1KT | Amino acids additive. Contains: 50 mM of each of the following 3 natural amino acids - tryptophan, phenylalanine, and tyrosine. |
| 100 mM Adenine triphosphate (ATP) | Sigma | A3377 | Nucleotides & energy source. |
| 50 mM Guanidine triphosphate (GTP) | Sigma | G8877 | Nucleotides & energy source. |
| 100 mM Uridine triphosphate (UTP) | ACROS ORGANICS | 226310010 | Nucleotides additive. |
| 100 mM Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) | INALCO | INA-1758-1400 | Genes expression induction. |
| 2 M Sucrose | J.T. Baker | 1933078 | Generating a density gradient. |
| 2 M Glucose | Sigma | 16301 | Generating a density gradient. |
| H2O UltraPure Water (UPW) | Bio-Lab | 2321777500 | DNase & RNase free |
| S30-T7 lysate | _ | _ | Prepared at step 1. Source of transcription & translation components. Store at -80 °c, thaw on crashed ice just before usage. |
| Stock of DNA plasmid of choice | _ | _ | Contains the sequence for the requested protein. Under T7 promotor |
| D. Equipment required for step 4 (synthetic cells preparation) | |||
| Floor incubator shaker or Thermomixer | MRC | TOU-120-2 | Laboratory shaker incubator 450x450mm, 400rpm, 70 °C |
| PHMT Grant Bio | PSC18 | Thermomixer | |
| Centrifuge | Thermo Scientific | 75004270 | (75003629) - TX-400 4 x 400mL Swinging Bucket Rotor. Suited for 15 mL sized tubes. Preferably swinging buckets. Should enable at least 1000 x g. Pre-cooled to 4 °C. |
| Table centrifuge | Thermo Scientific | 75002420 | (75003424) - 24 x 1.5/2.0mL rotor with ClickSeal. Suited for Eppendorf vials. Pre-cooled to 4 °C. |
| Vortex mixer | Scientific industries | SI-0256 | |
| Crushed ice bucket | Bel-Art | M18848-4001 | |
| 2 mL screw neck glass vials | CSI Analytical Innovations | VT009M-1232 | |
| Sterile 15 mL plastic tubes | Thermo Scientific | 339651 | |
| Sterilized 1.5 mL plastic tubes | Eppendorf | 30120086 | |
| Sterilized pipette tips | Corning | Sterilized by autoclave. |
References
- Blain, J. C., Szostak, J. W. Progress toward synthetic cells. Annual review of biochemistry. 83, 615-640 (2014).
- Richmond, D. L., et al. Forming giant vesicles with controlled membrane composition, asymmetry, and contents. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (23), 9431-9436 (2011).
- Deshpande, S., Spoelstra, W. K., van Doorn, M., Kerssemakers, J., Dekker, C. Mechanical division of cell-sized liposomes. ACS Nano. 12 (3), 2560-2568 (2018).
- Liu, D. V., Zawada, J. F., Swartz, J. R. Streamlining Escherichia coli S30 extract preparation for economical cell-free protein synthesis. Biotechnology Progress. 21 (2), 460-465 (2005).
- Stano, P. Gene Expression Inside Liposomes: From Early Studies to Current Protocols. Chemistry-A European Journal. , (2019).
- Lewandowski, B., et al. Sequence-specific peptide synthesis by an artificial small-molecule machine. Science. 339 (6116), 189-193 (2013).
- Li, J., et al. Cogenerating synthetic parts toward a self-replicating system. ACS Synthetic Biology. 6 (7), 1327-1336 (2017).
- Kim, T. W., et al. An economical and highly productive cell-free protein synthesis system utilizing fructose-1,6-bisphosphate as an energy source. Journal of Biotechnology. 130 (4), 389-393 (2007).
- Kim, T. W., et al. Simple procedures for the construction of a robust and cost-effective cell-free protein synthesis system. Journal of Biotechnology. 126 (4), 554-561 (2006).
- Noireaux, V., Libchaber, A. A vesicle bioreactor as a step toward an artificial cell assembly. Proceedings of the National Academy of Sciences. 101 (51), 17669-17674 (2004).
- He, M., He, Y., Luo, Q., Wang, M. From DNA to protein: No living cells required. Process Biochemistry. 46 (3), 615-620 (2011).
- Casteleijn, M. G., Urtti, A., Sarkhel, S. Expression without boundaries: cell-free protein synthesis in pharmaceutical research. International Journal of Pharmaceutics. 440 (1), 39-47 (2013).
- Luisi, P. L., Ferri, F., Stano, P. Approaches to semi-synthetic minimal cells: a review. Naturwissenschaften. 93 (1), 1-13 (2006).
- Adamala, K. P., Martin-Alarcon, D. A., Guthrie-Honea, K. R., Boyden, E. S. Engineering genetic circuit interactions within and between synthetic minimal cells. Nature Chemistry. 9 (5), 431-439 (2017).
- Ding, Y., Contreras-Llano, L. E., Morris, E., Mao, M., Tan, C. Minimizing Context Dependency of Gene Networks Using Artificial Cells. ACS Applied Materials & Interfaces. 10 (36), 30137-30146 (2018).
- Arnold, F. H. Design by directed evolution. Accounts of Chemical Research. 31 (3), 125-131 (1998).
- Chen, Z., et al. Synthetic beta cells for fusion-mediated dynamic insulin secretion. Nature Chemical Biology. 14 (1), 86-93 (2018).
- Mohr, B. P., Retterer, S. T., Doktycz, M. J. While-you-wait proteins? Producing biomolecules at the point of need. Expert Review of Proteomics. 13 (8), 707-709 (2016).
- Krinsky, N., et al. Synthetic Cells Synthesize Therapeutic Proteins inside Tumors. Advanced Healthcare Materials. 7 (9), 1701163 (2018).
- Kim, T. W., Kim, D. M., Choi, C. Y. Rapid production of milligram quantities of proteins in a batch cell-free protein synthesis system. Journal of Biotechnology. 124 (2), 373-380 (2006).
- Deng, N. N., Yelleswarapu, M., Zheng, L., Huck, W. T. Microfluidic assembly of monodisperse vesosomes as artificial cell models. Journal of the American Chemical Society. 139 (2), 587-590 (2016).
- Deshpande, S., Caspi, Y., Meijering, A. E., Dekker, C. Octanol-assisted liposome assembly on chip. Nature Communications. 7, 10447 (2016).
- Göpfrich, K., et al. One-Pot Assembly of Complex Giant Unilamellar Vesicle-Based Synthetic Cells. ACS synthetic biology. , (2019).
- Fujii, S., et al. Liposome display for in vitro selection and evolution of membrane proteins. Nature Protocols. 9 (7), 1578 (2014).
- Periasamy, A., et al. Cell-free protein synthesis of membrane (1,3)-beta-d-glucan (curdlan) synthase: co-translational insertion in liposomes and reconstitution in nanodiscs. Biochim Biophys Acta. 1828 (2), 743-757 (2013).
- Kalmbach, R., et al. Functional cell-free synthesis of a seven helix membrane protein: in situ insertion of bacteriorhodopsin into liposomes. Journal of Molecular Biology. 371 (3), 639-648 (2007).
- Nishimura, K., et al. Cell-free protein synthesis inside giant unilamellar vesicles analyzed by flow cytometry. Langmuir. 28 (22), 8426-8432 (2012).
- Rampioni, G., et al. Synthetic cells produce a quorum sensing chemical signal perceived by Pseudomonas aeruginosa. Chemical Communications. 54 (17), 2090-2093 (2018).
- Stano, P., Kuruma, Y., de Souza, T. P., Luisi, P. L. Biosynthesis of proteins inside liposomes. , Humana Press. 127-145 (2010).
- Pautot, S., Frisken, B. J., Weitz, D. A. Production of unilamellar vesicles using an inverted emulsion. Langmuir. 19 (7), 2870-2879 (2003).
- Krinsky, N., et al. A Simple and Rapid Method for Preparing a Cell-Free Bacterial Lysate for Protein Synthesis. PLoS One. 11 (10), 0165137 (2016).
- Pédelacq, J. D., Cabantous, S., Tran, T., Terwilliger, T. C., Waldo, G. S. Engineering and characterization of a superfolder green fluorescent protein. Nature Biotechnology. 24 (1), 79 (2006).
- Osawa, M., Erickson, H. P. Liposome division by a simple bacterial division machinery. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (27), 11000-11004 (2013).
- Merkle, D., Kahya, N., Schwille, P. Reconstitution and anchoring of cytoskeleton inside giant unilamellar vesicles. ChemBioChem. 9 (16), 2673-2681 (2008).
- Vleugel, M., Roth, S., Groenendijk, C. F., Dogterom, M. Reconstitution of basic mitotic spindles in spherical emulsion droplets. Journal of Visualized Experiments. , e54278 (2016).
- Bayoumi, M., Bayley, H., Maglia, G., Sapra, K. T. Multi-compartment encapsulation of communicating droplets and droplet networks in hydrogel as a model for artificial cells. Scientific Reports. 7, 45167 (2017).
- Carlson, E. D., Gan, R., Hodgman, C. E., Jewett, M. C. Cell-free protein synthesis: applications come of age. Biotechnology Advances. 30 (5), 1185-1194 (2012).
