Summary
Este protocolo descreve o método, materiais, equipamentos e etapas para a preparação de baixo para cima de RNA e proteína susceptíveis de produzir células sintéticas. O compartimento aquoso interno das células sintéticas continha o lisato bacteriano S30 encapsulado dentro de uma bicamada lipídica (ou seja, lipossomos estáveis), utilizando um método de transferência de emulsão de água no óleo.
Abstract
A abordagem de montagem de baixo para cima para a construção de células sintéticas é uma ferramenta eficaz para isolar e investigar processos celulares em um ambiente de imitação celular. Além disso, o desenvolvimento de sistemas de expressão livre de células demonstrou a capacidade de reconstituir os processos de produção, transcrição e tradução de proteínas (DNA→RNA→protein) de forma controlada, aproveitando a biologia sintética. Aqui descrevemos um protocolo para preparar um sistema de expressão livre de células, incluindo a produção de um potente lisato bacteriano e encapsulamento deste lisato dentro de vesículas unilamelares gigantes (GUVs) ricas em colesterol( ou seja, lipossomos estáveis), para formar células sintéticas. O protocolo descreve os métodos para a preparação dos componentes das células sintéticas, incluindo a produção de lisatos bacterianos ativos, seguido de uma preparação detalhada passo a passo das células sintéticas com base em um método de transferência de emulsão de água em óleo. Estes facilitam a produção de milhões de células sintéticas de forma simples e acessível, com alta versatilidade para a produção de diferentes tipos de proteínas. As células sintéticas obtidas podem ser utilizadas para investigar a produção e a atividade de proteína/RNA em um ambiente isolado, em evolução direcionada, e também como uma plataforma controlada de entrega de medicamentos para produção sob demanda de proteínas terapêuticas dentro do corpo.
Introduction
As células sintéticas são partículas artificiais semelhantes a células, imitando uma ou múltiplas funções de uma célula viva, como a capacidade de se dividir, formar interações de membrana e sintetizar proteínas com base em um código genético1,2,3. Células sintéticas que encerram sistemas de síntese proteica livre de células (CFPS) possuem alta modularidade devido à sua capacidade de produzir várias proteínas e seqüências de RNA após alterações no modelo de DNA. Apresentando uma alternativa atraente às abordagens atuais da produção de proteínas, os sistemas CFPS baseiam-se em lisato celular, componentes purificados ou componentes sintéticos e incluem todas as máquinas de transcrição e tradução necessárias para a síntese de proteínas como ribossomos, Polimerase de RNA, aminoácidos e fontes de energia (por exemplo, 3-fosfoliglicerato e adenina,tripofatos)4,5,6,7, 8,8.9 O encapsulamento de um sistema CFPS dentro de vesículas lipídicas permite a produção simples e eficiente de proteínas sem depender de uma célula viva10. Além disso, esta plataforma permite a síntese de peptídeos que podem se degradar dentro das células naturais, a produção de proteínas tóxicas para as células vivas e a modificação de proteínas com aminoácidos não naturais11,12. As células sintéticas têm sido utilizadas como modelo para fins de pesquisa investigando os componentes celulares mínimos necessários para permitir a vida celular a partir de uma perspectiva evolutiva1,13. As células sintéticas também têm sido utilizadas para construir e implementar circuitogenético e como modelos para evolução dirigida14,,15,,16. Outros estudos têm focado na capacidade das células sintéticas de imitar a atividade biológica das células naturais, visando substituir células naturais danificadas, como células beta em pacientes com diabetes17. Além disso, a capacidade dessas células sintéticas encapsuladas cfps de produzir uma variedade de proteínas terapêuticas ilustra seu potencial para serem incorporadas ao uso clínico18.
Aqui descrevemos um protocolo de escala de laboratório de baixo para cima (Figura 1) para a produção de RNA e células sintéticas produtoras de proteínas com base em um sistema CFPS encapsulado em uma vesícula lipídica. Isso mostra o potencial uso de plataformas de células sintéticas como novos sistemas de entrega de medicamentos para a produção in loco de uma droga de proteína terapêutica in vivo19. Estudos anteriores têm investigado a otimização da reação cfps e os processos de preparação de lésa celular4,8,20. Além disso, várias técnicas têm sido aplicadas para a preparação do liposome do tamanho celular, tais como os métodos de estabilização de gotículas microfluidas e baseadas em polímeros21,,22,23, que também diferem na composição lipídica dos liposóis24,,25,26. No protocolo apresentado, as células sintéticas são produzidas utilizando-se um método de transferência de emulsão de água-no-óleo e o processo de encapsulamento é realizado a baixas temperaturas (<4 °C)5,10,24,27,28. Estas condições leves têm sido favoráveis para a manutenção da integridade biofuncional das máquinas moleculares, ou seja, ribossomos e proteínas27,29,30. A composição lipídica das partículas consiste tanto no colesterol quanto no 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glicero-3-fosfocholine (POPC). A primeira é encontrada em todas as membranas celulares dos mamíferos e é essencial para a estabilidade, rigidez e redução da permeabilidade da membrana, e esta última imita a composição fosfolipídea dos mamíferos11,13. A transcrição celular e a maquinaria molecular de tradução são extraídas da cepa BL21 (DE3) Escherichia coli (E. coli), que é transformada com pAR1219 plasmídeo superexpressor t7 rna polimerase para aumentar a potência cfps e a síntese de proteínas. Este sistema tem sido utilizado para produzir proteínas diagnósticas e terapêuticas, com pesos moleculares de até 66 kDa in vitro e in vivo19,31. O protocolo a seguir fornece um método simples e eficaz para a produção do sistema celular sintético, que pode abordar uma ampla gama de questões fundamentais associadas à síntese proteica na natureza e também pode ser utilizado para aplicações de entrega de medicamentos.
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Protocol
NOTA: A ilustração do protocolo completo de produção das células sintéticas é apresentada na Figura 1. De acordo com as necessidades do usuário, a expressão proteica (seção 3.2) e a formação de células sintéticas (seção 4) do protocolo também podem ser realizadas independentemente (com algumas adaptações).
1. Preparação do lysate S30-T7
- Placa de raia a bactéria E. coli BL21(DE3) transformada com a polimerase T7 RNA expressando pAR1219 plasmídeo em uma placa LB-ágar suplementada com ampicillina de 50 μg/mL para obter colônias únicas.
- Prepare uma solução de partida: Inocule uma única colônia em 5 mL de LB-media suplementada com ampicillina de 50 μg/mL em um frasco erlenmeyer de 100 mL e cresça durante a noite usando um agitador de incubadora de piso a 250 rpm e 37 °C. Prepare as duplicatas.
- Inocule cada partida de 5 mL separadamente em 500 mL de mídia tb suplementada com ampicillina de 50 μg/mL em um frasco erlenmeyer de 2 L com defletores e cresça-o usando um agitador de incubadora de piso a 250 rpm e 37 °C até atingirOD 600 de 0,8-1. Monitore periodicamente usando um espectrofotômetro.
- Adicione 2-3 mL de 100 mM de estoque de IPTG (para atingir 0,4 - 0,6 mM) para indução de expressão de polimerase T7 RNA e continue crescendo a cultura até atingir OD600¥4.
- Transfira a solução de cada frasco de Erlenmeyer para dois tubos de centrífuga esterilizados de 250 mL.
- Centrífuga cada um a 7.000 x g por 10 min a 4 °C. Descarte o sobrenadante.
NOTA: Nesta fase, a pelota bacteriana pode ser armazenada a -20 °C por alguns dias antes de passar para os próximos passos. - Suspenda novamente cada pelota em 250 mL de tampão de lysate frio (4 °C) S30 e centrífuga a 7.000 x g por 10 min a 4 °C.
NOTA: O tampão de lysato S30 é usado para manter a estabilidade proteica após a realização da lse celular utilizando o homogeneizador na etapa 1.9. A partir deste passo em diante, todas as etapas até 1.12 devem ser realizadas consecutivamente e rapidamente.
NOTA: Antes de seguir para o próximo passo, pré-resfrie as pontas e frascos de 1,5 mililitro que serão necessários para armazenar o lysato - Descarte o sobrenadante e suspenda novamente todas as pelotas em 15 mL de tampão de lysato S30 frio. Filtrar a suspensão usando gaze pad.
NOTA: 15ml de solução é devido ao volume de homogeneizador min. Deve-se notar que a concentração de bactérias também é importante. - Homogeneizar a uma pressão de trabalho de 15.000 psi, com uma pressão de ar de 4 bar (duas passagens) para quebra celular. Evite a diluição da solução para um lysate mais concentrado e ativo.
- Adicione 100 μL de 0,1 M DTT (CUIDADO) por 10 mL da suspensão homogeneizada.
- Centrifugar a suspensão a 24.700 x g por 30 min a 4 °C.
- Realize rapidamente o seguinte passo para preservar a atividade lisato: divida o sobrenadante um por um em alicotas de 200 μL em frascos pré-refrigerados de 1,5 mL e imediatamente estale congelá-los com nitrogênio líquido. Armazene a -80 °C para uso adicional.
ATENÇÃO: O DTT é classificado como irritante e prejudicial e, portanto, deve ser tratado com cuidado.
2. Preparação de lipídios na solução de óleo
- Dissolva POPC e colesterol em clorofórmio (CUIDADO) separadamente, cada um com uma concentração final de 100 mg/mL. Vórtice cada frasco separadamente.
- Combine os componentes em um frasco de vidro de 2mL: adicione 50 μL de POPC no clorofórmio, 50 μL de colesterol no clorofórmio e 500 μL de óleo mineral. Para 100 μL de células sintéticas, são necessários 2 frascos de lipídios em óleo.
- Vórtice, e depois aquecer por cerca de 1 h a 80 °C em uma capa química para evaporar o clorofórmio. Certifique-se de que a evaporação completa ocorreu seguindo o tempo/condições especificado e monitorando o volume da solução.
NOTA: A solução lipídica resultante do óleo pode ser armazenada à temperatura ambiente por até duas semanas. Para melhores resultados, recomenda-se usar uma nova preparação antes de cada experimento. As proporções de lipídios e colesterol podem ser alteradas de acordo com a composição da membrana desejada. Uma alta concentração de colesterol pode levar à formação de agregados na solução final de células sintéticas.
ATENÇÃO: O clorofórmio é classificado como irritante e prejudicial e, portanto, deve ser tratado com cuidado e em áreas com extração de fumaça.
3. Preparações de soluções externas, pré-internas e de alimentação
- Elaboração de soluções de estoque
- Prepare as soluções de estoque listadas na Tabela 2 utilizando água ultrapura (UPW).
NOTA: As soluções de estoque devem ser preparadas com antecedência e armazenadas a -20 °C até o uso posterior. O reagente 7 tende a formar agregados. O aquecimento para 37 °C reduzirá a agregação. Uma ligeira agregação não afetará significativamente a reação. A solução do reagente 8 é leitosa e turva.
- Prepare as soluções de estoque listadas na Tabela 2 utilizando água ultrapura (UPW).
- Solução externa
- Dissolver a glicose em H2O sem DNase/RNase para uma concentração final de 200 mM.
- Para 100 μL de solução interna, prepare 1,6 mL de solução externa.
- Solução pré-interna
- Adicionar reagentes 1-14 de acordo com as quantidades e concentração listadas na Tabela 2. Por exemplo, para um volume final de célula sintética de 100 μL, prepare 100 μL de solução interna.
NOTA: UpW deve ser adicionado para completar o volume final necessário. Nesta fase, a mistura pode ser armazenada a 4 °C por algumas horas.
- Adicionar reagentes 1-14 de acordo com as quantidades e concentração listadas na Tabela 2. Por exemplo, para um volume final de célula sintética de 100 μL, prepare 100 μL de solução interna.
- Solução de alimentação
- Adicione todos os reagentes de acordo com os valores e concentração listados na Tabela 3.
NOTA: Use a razão 1:1 da solução de alimentação:solução interna. Para um volume final de célula sintética de 100 μL, prepare 100 μL de solução de alimentação. Recomenda-se preparar um pequeno volume excedente de solução externa, interna e alimentar.
- Adicione todos os reagentes de acordo com os valores e concentração listados na Tabela 3.
4. Preparação de células sintéticas
NOTA: Os seguintes volumes são ajustados para a preparação de 100 μL de células sintéticas.
- Células sintéticas que produzem proteína
- Em um tubo de 15 mL, coloque 12 mL da solução externa e adicione lentamente, em cima de uma camada, de 500 μL de lipídios na solução de óleo. Incubar em temperatura ambiente por 20 min.
- Para finalizar a preparação da solução interna: misture os ingredientes da solução interna no gelo triturado a um volume final de 100 μL descongelando e adicionando S30-T7 Lysate (reagente 15) e plasmídeo de DNA (reagente 16) à mistura armazenada.
- Para o segundo frasco de vidro de 2 mL com 500 μL de lipídios na solução de óleo, adicione 100 μL da solução interna. Pipeta para cima e para baixo vigorosamente por 1 minuto e vórtice por mais um minuto no nível cinco.
- Incubar por 10 min em gelo esmagado e adicionar lentamente a emulsão resultante em cima da fase do óleo no tubo de 15 mL (a partir de 4.1.1).
- Centrifugação por 10 min a 100 x g e 4 °C e, em seguida, centrífuga por 10 min a 400 x g e 4 °C. Ao final da centrifugação, deve-se observar uma pelota na parte inferior do tubo.
NOTA: O uso de um rotor de centrífuga de balde balançando é preferido aqui para adquirir uma melhor cobertura de uma segunda camada de lipídios durante a passagem das gotículas de água em óleo através da interfase. Caso não haja pelota observável, a velocidade de centrifugação pode ser aumentada para 1000 x g. Caso contrário, consulte a seção Discussão referente à gravidade específica da solução externa. - Extrair a pelota.
- Remova o excesso de camada de óleo.
- Use uma ponta de pipeta aparada carregada com aproximadamente 400 μL de solução externa para extrair a pelota. Solte a solução externa durante a fase de óleo, a fim de coletar apenas a pelota na fase aquosa.
- Limpe a ponta após a extração da pelota para evitar a transferência de restos de óleo e transfira a pelota para um tubo limpo de 1,5 mL.
- Centrifugação por 10 min a 1.000 x g e 4 °C, remova o sobrenadante e suspenda novamente a pelota em 100 μL de solução de alimentação (proporção de 1:1 de soluções internas:alimentação).
NOTA: Um rotor de centrífuga de ângulo fixo também pode ser usado aqui. - Para expressão proteica, incubar por 2 horas a 37 °C sem tremer.
NOTA: O tempo ideal de incubação varia entre diferentes proteínas. - Avalie a quantidade de proteína produzida utilizando um método adequado de acordo com as propriedades da proteína alvo.
- Grupos de controle recomendados
- Solução interna e confirmação de atividade de lysate
- Prepare uma solução interna completa (com DNA e S30-T7 lysate).
- Incubar imediatamente a reação acima usando um agitador de incubadora a 250 rpm ou uma termomixer a 1200 rpm, a uma temperatura constante de 37 °C por 2 h.
NOTA: Ajuste o tempo de incubação para corresponder ao tempo de incubação das células sintéticas.
- Células sintéticas
- Grupo de controle negativo: Prepare o protocolo apresentado em 4.1 com solução interna sem DNA.
- Controle positivo: Prepare o protocolo apresentado em 4.1 com solução interna contendo uma codificação plasmídea T7 para um gene de repórter.
NOTA: Adicione um grupo de controle positivo composto por um gene de repórter, como o sfGFP, ao lado dos grupos de teste para garantir a etapa de eficiência de encapsulamento.
- Solução interna e confirmação de atividade de lysate
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Representative Results
Apresentamos um protocolo para a preparação de células sintéticas encapsulando um sistema CFPS S30-T7 baseado em BL21 E. coli dentro de vesículas lipídicas. Uma descrição esquemmática do processo de preparação que inclui uma imagem de cada etapa é apresentada na Figura 2. O sucesso do processo de preparação de células sintéticas depende do desempenho adequado de cada etapa e efetuado por diferentes parâmetros. O protocolo deve ser ajustado para acomodar a produção de uma proteína específica.
Plasmids expressando a proteína modelo proteína verde proteína fluorescente (sfGFP) e Renilla Luciferase sob o promotor T7 foram introduzidos em reações em massa CFPS e células sintéticas, e a produção de proteínas foi avaliada usando diferentes métodos, incluindo mancha ocidental, citometria de fluxo, microscopia e espectroscopia(Figura 3). Uma verificação da produção de sfGFP-His6 tagged protein (~27 kDa32) por análise de manchas ocidentais é apresentada na Figura 3A. Uma amostra de 30 μL de células sintéticas diluídas 6 dobras foi misturada com 10 μL de um tampão de amostra SDS-PAGE comum (contendo os detergentes sulfato de dodofílico de sódio (SDS) e β-mercaptoetanol) e fervido por 10 min (95 oC). Descobrimos que a combinação de calor e detergentes no tampão da amostra é suficiente para desmontar as vesículas e para permitir o funcionamento de proteínas no gel SDS-PAGE. A detecção de proteínas foi realizada utilizando-se anticorpo primário policlonal (diluído 1:12.000). Como esperado, enquanto a produção de proteínas é detectada em amostras contendo modelos de DNA codificadores de sfGFP ("+sfGFP DNA"), nenhuma proteína é observada em amostras de controle negativo em que o modelo de DNA foi excluído ("-DNA"). Amostras de sfGFP purificado e sfGFP purificado encapsulados dentro da membrana de células sintéticas (sfGFP (encapsulado)), são usados como controles positivos para a produção em massa sfGFP CFPS e para sua síntese dentro de células sintéticas, respectivley. Este método pode ser aplicado a diferentes tipos de proteínas. De acordo com Krinsky et al.19, o rendimento de produção de sfGFP obtido sob o protocolo detalhado é de 380 μg/mL na solução CFPS e de 5,3 μg/mL, quando a solução CFPS estiver encapsulada dentro de vesículas lipídicas.
Quando a proteína produzida dentro das células sintéticas é fluorescente, sua produção pode ser avaliada usando métodos baseados em microscopia e citometria de fluxo. Analisamos as células sintéticas utilizando um microscópio fluorescente com filtro para fluorescência GFP (Figura 3B). Como os componentes CFPS possuem alguns autofluorescentes, os parâmetros de aquisição de imagem devem ser adaptados de acordo com uma amostra de controle negativa apropriada (células sintéticas sem modelo de DNA, por exemplo).
Além disso, utilizou-se a citometria de fluxo para determinar a intensidade média de fluorescência das células sintéticas produtoras de sfGFP, e a porcentagem de células sintéticas ativas, que podem produzir proteínas dentro delas (Figura 3C I&II). Foram coletados 10.000 eventos para cada amostra analisada. A produção de células sintéticas, descrita neste protocolo, geralmente produz uma população ativa de 21-25% dentro de uma solução com uma concentração aproximada de 107 células sintéticas/mL. A leve intensidade de fluorescência apresentada pelas amostras de "-DNA" na Figura 3C II deve-se à autofluorescência de diferentes componentes na reação do CFPS, como o lysate S30.
A análise de tamanho representativo com base no sinal GFP (em diâmetro) de células sintéticas preparadas pelo método descrito acima mostra um valor médio de 2,4±0,5 μm(Figura 3D II). Como a formação de água na emulsão de óleo neste método é um resultado da aplicação de forças mecânicas, a distribuição de tamanho das partículas pode ser afetada por diferentes fatores, como o método e a velocidade de pipetação da emulsão para cima e para baixo, o modelo da máquina misturadora de vórtice, etc.
Para testar a versatilidade da produção de proteínas das células sintéticas, analisou-se a expressão da proteína repórter Renilla luciferase dentro de células sintéticas (Figura 3E). O ensaio quantificou a atividade da luciferase de Renilla medindo a luminescência gerada a partir da reação enzimática da luciferase e seu substrato, h-coelenterazina. Para induzir a reação enzimática, foi adicionada uma concentração final de 1 μM de h-coelenterazina às células sintéticas (volume amostral de 25 μL) pouco antes da medição. A amostra de "-DNA", não contendo o modelo de DNA codificador de luciferase, foi utilizada como controle negativo para o teste de luminescência devido à oxidação não enzimática do substrato. A luminescência foi medida usando um leitor de placas.
Figura 1: Uma ilustração do processo para o protocolo típico de preparação de células sintéticas. O processo é dividido em duas etapas. Passo 1: Preparações pré-experimento, incluindo purificação de plasmídeos de DNA, preparação de lisato S30-T7, preparação de soluções de estoque necessárias para as soluções internas e de alimentação, preparação de soluções lipídicas em óleo e preparação de soluções externas. Passo 2: Formação de células sintéticas que inclui alimentação e preparação de soluções internas, preparação e análise de células sintéticas. Um exemplo do volume necessário de cada ingrediente para o preparo de 100 μL de solução de células sintéticas é apresentado em azul entre parênteses. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Ilustração esquemática do protocolo de preparação de células sintéticas. Uma imagem de um processo bem executado ilustra cada etapa do protocolo. Esta figura foi modificada a partir de Krinsky et al.19. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Resultados representativos da produção de fgfp e luciferase renilla dentro de células sintéticas. (A) Uma análise de manchas ocidentais da produção de sfGFP-His6 em ambas as reações em massa cfps e dentro de células sintéticas. A detecção de proteínas foi realizada utilizando-se anticorpo primário policlonal anti-His (diluído 1:12.000). O sfGFP-His6 purificado foi utilizado como controle positivo (7,8 μg). sfGFP (encapsulado) é o controle positivo do sfGFP purificado encapsulado em células sintéticas. Amostras sem modelos de DNA foram utilizadas como controle negativo para a análise de produção ("-DNA"). (B) Imagens representativas de sfGFP produzindo células sintéticas tiradas usando um microscópio fluorescente com um campo brilhante e um filtro GFP. Barras de escala = 50 μm.(C) I&II Análise de citometria de fluxo de sfGFP produzindo atividade de células sintéticas (Dados coletados utilizando analisador digital, 4 laser). As amostras foram medidas após 3h de incubação. Foram coletados 10.000 eventos para cada amostra analisada. Os filtros FSC (500 V) e SSC (300 V) foram utilizados para definir a população total de células sintéticas. Em seguida, um filtro FITC (600 V) foi usado para detectar fluorescência GFP.. (I) O cálculo da população de células sintéticas ativas [%] baseou-se no limiar de intensidade de fluorescência gfp, definido pela amostra "-DNA" (histograma vermelho), permitindo um erro de ~1%. (II) Intensidade média de fluorescência de células sintéticas sfGFP. Esse valor foi calculado a partir da população de células sintéticas ativas e normalizado para a amostra "-DNA", dividindo-se a fluorescência média das células sintéticas ativas pela média das células sintéticas sem sfGFP-DNA. (D) I&II Análise do tamanho das células sintéticas. O espectro de emissões foi detectado por 505-560 nm e 642-745 nm para sinais de GFP e campo brilhante, respectivamente. (I) Uma imagem representativa das células sintéticas analisadas. (II) Distribuição do tamanho das células sintéticas. A análise foi realizada e as distribuições de diâmetro das células sintéticas ativas foram calculadas com base no sinal gfp. (E) Produção de luciferase de Renilla ativa dentro de células sintéticas. A atividade da luciferase foi quantificada com medidas de luminescência após a adição de 1 μM h-coelenterazine utilizando um leitor de placas e apresentada como intensidade de luz [RLU] x 106. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Tabela 1: Preparação de soluções de tampão e estoque. | |
| Comentários | |
| Ágar Luria Bertani (LB) (1,5%) Placa: | Preparar e esterilizar. Adicione ampicillin a uma concentração final de 50 μg/mL somente após o resfriamento à temperatura ambiente. |
| 10 g/L Bacto-tripptone | |
| Cloreto de sódio de 10 g/L (NaCl) | |
| Extrato de 5 g/L Bacto-Levedura | |
| 15 g/L Ágar ágar purificado | |
| 50 μg/mL Ampicillin | |
| Mídia LB (20 mL): | Mídia mínima. Prepare e esterilize com antecedência. Pouco antes de inocular as bactérias, adicione ampicillina a uma concentração final de 50 μg/mL. |
| 10 g/L Bacto-tripptone | |
| Cloreto de sódio de 10 g/L (NaCl) | |
| Extrato de 5 g/L Bacto-Levedura | |
| 50 μg/mL Ampicillin | |
| Mídia de caldo fantástico (TB) (1 L): | Mídia rica. Prepare e esterilize com antecedência. Pouco antes de inocular as bactérias, adicione ampicillina a uma concentração final de 50 μg/mL. |
| 12 g/L Bacto-tripptone | |
| Extrato de 24 g/L Bacto-Levedura | |
| 4% (v/v) Glicerol anidro | |
| 2,32 g/L K2HPO4 | |
| 12,54 g/L KH2PO4 | |
| 50 μg/mL Ampicillin | |
| Tampão de lysate S30 (1,5 L): | Preparar e esterilizar com antecedência (*excluindo DTT e 2-mercaptoetanol). Armazenar a -4 °C. |
| Tris-acetato de 10 mM em pH = 7,4 | Trisma-base. Preparar e ajustar o pH para 7,4 usando ácido acético. |
| Acetato de magnésio de 14 mM | |
| Acetato de potássio de 60 mM | |
| *1 mM DTT | Adicione pouco antes de usar |
| *0,5 mL/L 2-mercaptoetanol | Adicione pouco antes de usar |
| 1 M HEPES-KOH (pH = 8): | Dissolver hepes a uma concentração final de 1 M. Ajuste para pH 8 usando a solução KOH. |
| HEPES | |
| Hidróxido de potássio (KOH) | |
| Tabela 2: Composição da solução interna. | ||||||||||
| Volume final solicitado de solução interna | ||||||||||
| Número | Reagente | Stock conc. | Conc final. | 25 μL | 50 μL | 100 μL | 200 μL | 300 μL | 400 μ L | |
| 1 | HEPES KOH pH=8 | 1 M | 55 mM | 1.375 | 2.75 | 5.5 | 11 | 16.5 | 22 | Solução pré-interior |
| 2 | Acetato de magnésio | 1 M | 14 mM | 0.35 | 0.7 | 1.4 | 2.8 | 4.2 | 5.6 | |
| 3 | Acetato de potássio | 1 M | 50 mM | 1.25 | 2.5 | 5 | 10 | 15 | 20 | |
| 4 | Acetato de amônio | 5,2 M | 155 mM | 0.75 | 1.5 | 3 | 6 | 9 | 12 | |
| 5 | PEG 6000 | 50% | 3% | 1.5 | 3 | 6 | 12 | 18 | 24 | |
| 6 | 3-PGA | 0,5 M | 40 mM | 2 | 4 | 8 | 16 | 24 | 32 | |
| 7 | Aminoácidos - mistura I | 50 M | 2,5 mM | 1.25 | 2.5 | 5 | 10 | 15 | 20 | |
| 8 | Aminoácidos - mistura II | 50 M | 2,5 mM | 1.25 | 2.5 | 5 | 10 | 15 | 20 | |
| 9 | Atp | 100 mM | 1,2 mM | 0.3 | 0.6 | 1.2 | 2.4 | 3.6 | 4.8 | |
| 10 | Gtp | 50 mM | 1 mM | 0.5 | 1 | 2 | 4 | 6 | 8 | |
| 11 | Utp | 100 mM | 0,8 mM | 0.2 | 0.4 | 0.8 | 1.6 | 2.4 | 3.2 | |
| 12 | IPTG | 100 mM | 1 mM | 0.25 | 0.5 | 1 | 2 | 3 | 4 | |
| 13 | Sacarose | 2 M | 200 mM | 2.5 | 5 | 10 | 20 | 30 | 40 | |
| 14 ** | H2O UPW | ** | ** | ** | ** | ** | ** | |||
| 15 | S30-T7 Lysate | 34% | 8.5 | 17 | 34 | 68 | 102 | 136 | ||
| 16 * | Plasmídeo de DNA | 10 μg/mL | * | * | * | * | * | * | ||
| Tabela 3: Composição da solução de alimentação. | |||||||||
| Volume final da solução de alimentação solicitada | |||||||||
| Número | Reagente | estoque conc. | conc final. | 25 μL | 50 μL | 100 μL | 200 μL | 300 μL | 400 μL |
| 1 | HEPES KOH pH=8 | 1 M | 83,3 mM | 2.08 | 4.17 | 8.33 | 16.67 | 25 | 33.33 |
| 2 | Acetato de magnésio | 1 M | 21,2 mM | 0.53 | 1.06 | 2.12 | 4.24 | 6.36 | 8.48 |
| 3 | Acetato de potássio | 1 M | 75,5 mM | 1.89 | 3.78 | 7.55 | 15.1 | 22.66 | 30.2 |
| 4 | Acetato de amônio | 5,2 M | 236,4 mM | 1.14 | 2.27 | 4.55 | 9.09 | 13.64 | 18.18 |
| 5 | PEG - 6000 | 50% | 4.54% | 2.27 | 4.54 | 9.08 | 18.16 | 27.24 | 36.32 |
| 6 | 3-PGA | 0,5 M | 60,1 mM | 3 | 6.01 | 12.01 | 24.02 | 36.04 | 48.04 |
| 7 | Aminoácidos - mistura I | 50 mM | 3,8 mM | 1.89 | 3.78 | 7.56 | 15.12 | 22.68 | 30.24 |
| 8 | Aminoácidos - mistura II | 50 mM | 3,8 mM | 1.89 | 3.78 | 7.56 | 15.12 | 22.68 | 30.24 |
| 9 | Atp | 100 mM | 1,8 mM | 0.45 | 0.91 | 1.81 | 3.62 | 5.43 | 7.24 |
| 10 | Gtp | 50 mM | 1,5 mM | 0.76 | 1.51 | 3.02 | 6.04 | 9.06 | 12.08 |
| 11 | Utp | 100 mM | 1,2 mM | 0.3 | 0.61 | 1.21 | 2.42 | 3.63 | 4.84 |
| 12 | IPTG | 100 mM | 1,5 mM | 0.38 | 0.76 | 1.51 | 3.02 | 4.53 | 6.04 |
| 13 | Glicose | 2 M | 200 mM | 2.5 | 5 | 10 | 20 | 30 | 40 |
| 14 | H2O UPW | 5.92 | 11.83 | 23.7 | 47.38 | 71.06 | 94.76 | ||
| Tabela 4: Soluções necessárias para a preparação de células sintéticas. | |
| Solução e materiais necessários | Comentários |
| Lipídios em óleo | Guarde em temperatura ambiente até o uso. Preparado de acordo com a seção 2 |
| Solução externa | Preparado de acordo com a seção 3.1 |
| Solução interna | Preparado de acordo com a seção 3.2. |
| Preparar testes + controlar amostras de acordo com a seção 4.1. | |
| Mantenha o gelo esmagado até o uso. | |
| Solução de alimentação | Preparado de acordo com a seção 3.3. |
| Mantenha o gelo esmagado até o uso. | |
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Discussion
Este protocolo introduz um método simples e acessível para a produção de grandes quantidades de células sintéticas produtoras de proteínas. O rendimento das células ativas depende da execução cuidadosa e precisa do protocolo com ênfase em várias etapas críticas. Na seção de preparação de lisato deste método, é essencial alcançar a densidade de bactérias apropriada antes da lse celular para alcançar uma quantidade suficiente de proteínas no lisato bacteriano. Em segundo lugar, o processo de lyse deve ser realizado a 4 °C e o lysato congelado rapidamente com nitrogênio líquido para manter a atividade proteica. Além disso, neste protocolo foram utilizadas células E. coli BL21(DE3) transformadas com plasmídeos pAR1219 expressando polimerase T7 RNA. Nos casos em que uma variedade diferente de bactérias é usada, alterações na concentração de lysate podem ser necessárias para atingir uma quantidade satisfatória de RNA polimerase e ribossomos. Mesmo quando a mesma cepa bacteriana é usada, diferentes produções de lysate podem ter alguma variabilidade lote-a-lote.
A seção de produção de vesículas também inclui alguns passos significativos. A solubilização dos lipídios e a remoção do clorofórmio do óleo mineral é importante para estabelecer a emulsão água-no-óleo. A centrifugação das gotículas de água no óleo no tampão aquoso externo também é um passo fundamental no protocolo para gerar células sintéticas com uma bicamada lipídica. Alterações na solução interna das vesículas e da composição lipídica podem levar a uma camada de gotículas na interfase óleo-água sem qualquer pelota observável. Para superar isso, uma solução rápida é aumentar a velocidade de centrifugação para 1.000 x g na etapa de transferência de emulsão. Caso isso não resolva o problema, a gravidade específica da solução aquosa externa pode ser alterada garantindo que a solução interna tenha uma gravidade específica maior do que a solução externa. Além disso, a osmolalidade da solução interna também pode variar entre diferentes fontes e produções, variando entre 800-1100 mOsm/kg. A variabilidade na osmolalidade da solução interna deve-se principalmente à mudança das concentrações do lysate durante seu processo de produção. Normalmente isso não leva a mudanças significativas na produção de proteínas, mas uma grande diluição pode levar a um rendimento reduzido devido às baixas concentrações da transcrição e enzimas de tradução no próprio lysate. Medir a concentração total de proteínas em cada lote de lisato pode auxiliar na ajuste das concentrações de lisato na solução interna para manter valores constantes (aproximadamente 22 mg/mL medidos pelo ensaio de Bradford).
No entanto, este método tem algumas limitações que devem ser mencionadas. Nem todas as células sintéticas geradas são ativas e capazes de produzir proteínas devido ao encapsulamento incompleto de todos os componentes necessários. Medimos aproximadamente 21-25% das células ativas ao produzir sfGFP expressando células sintéticas usando citometria de fluxo (não foram observadas diferenças significativas de tamanho entre células ativas e inativas). Resíduos de óleo e excesso de lipídios ocasionalmente permanecem na membrana lipídica bicamada após a transferência das células sintéticas para a fase aquosa. Otimizar as concentrações de lipídios e colesterol na fase do óleo pode melhorar essa questão. Também é importante notar que a distribuição de tamanho das células sintéticas obtidas é bastante ampla em comparação com métodos microfluidos alternativos, com vesículas variando de aproximadamente 1-50 μm.
O alto rendimento do método de transferência de emulsão torna-o especialmente adequado para células sintéticas encapsulando sistemas de síntese de proteínas livres de células para a produção de proteínas terapêuticas. Diferentes variações do método de transferência de emulsão têm sido utilizadas em estudos de células sintéticas e incluíram alterações no procedimento de preparação do óleo, composição da membrana, volume da amostra, solução interna para razão de óleo e velocidades de centrifugação5,24,28. Métodos de estabilização de gotículas microfluidas e baseadas em polímeros também têm sido utilizados para a preparação de células sintéticas, no entanto, o encapsulamento de todo o sistema CFPS ainda não foi realizado com estes métodos21,22,23.
As células sintéticas obtidas por este método foram mostradas in vivo para produzir proteínas e tratar o câncer nos modelos murina19. As capacidades dessas células podem ser expandidas no futuro além da expressão proteica. A integração de outros processos celulares como comunicação celular, modificação de citoesqueleto e divisão celular em células sintéticas foram recentemente descritas33,,34,35,36. A substituição do lysato bacteriano por lsato uniofiótico permitirá a expressão de proteínas com maior complexidade e modificações pós-translacionais, e talvez seja menos imunogênica mesmo sem um procedimento de limpeza, abrindo assim mais fronteiras terapêuticas37.
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Disclosures
Os autores não têm nada para revelar.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado pelo ERC-STG-2015-680242.
Os autores também reconhecem o apoio do Centro Integrado de Câncer Technion (TICC); o Russell Berrie Nanotechnology Institute; o Centro Interdisciplinar de Ciências e Engenharia de Vida Lorry I. Lokey; o Ministério da Economia de Israel para um Kamin Grant (52752); o Ministério da Ciência de Israel Tecnologia e Espaço – Escritório do Cientista Chefe (3-11878); a Fundação de Ciência de Israel (1778/13, 1421/17); a Associação israelense de câncer (2015-0116); a Fundação German-Israelense de Pesquisa e Desenvolvimento Científico para uma bolsa GIF Young (I-2328-1139.10/2012); o Programa FP-7 IRG da União Europeia para uma Bolsa de Integração de Carreira (908049); o Subsídio do Centro de Pesquisa Fosfolipídeo; uma Fundação Rosenblatt para pesquisa de câncer, uma Bolsa da Fundação Da Família Mallat; e a Unger Family Foundation. A. Schroeder reconhece as Bolsas Alon e Taub. O. Adir reconhece as bolsas Sherman e Gutwirth. G. Chen reconhece a Bolsa Sherman. N. Krinsky reconhece o Programa de Doutorado feminino da Baronesa Ariane de Rothschild da Fundação Rothschild Caesarea.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| A. Reagents required for step 1 (S30-T7 lysate preparation) | |||
| E.coli BL21 (DE3) | NEB | C2527 | E.coli BL21 (DE3). |
| pAR1219 | Sigma | T2076 | TargeTron vector for transformation. |
| Stock solution of 50 mg/mL Ampicillin | Sigma | A9518 | Stored at -20 °C. |
| 10 g/L Bacto-tryptone | BD Bioscience | 211705 | For preparation of Luria Bertani (LB) agar (1.5%) plate. |
| 10 g/L Sodium chloride (NaCl) | Bio-Lab | 19030591 | |
| 5 g/L Bacto-Yeast extract | BD Bioscience | 212750 | |
| 15 g/L Agar agar purified | Merck | 1.01614.5007 | |
| 50 µg/mL Ampicillin | Sigma | A9518 | |
| 10 g/L Bacto-tryptone | BD Bioscience | 211705 | For preparation of Luria Bertani (LB) media (20 mL). |
| 10 g/L Sodium chloride (NaCl) | Bio-Lab | 19030591 | |
| 5 g/L Bacto-Yeast extract | BD Bioscience | 212750 | |
| 50 µg/mL Ampicillin | Sigma | A9518 | |
| 12 g/L Bacto-tryptone | BD Bioscience | 211705 | For preparation of Terrific Broth (TB) media (1 L). |
| 24 g/L Bacto-Yeast extract | BD Bioscience | 212750 | |
| 4% (v/v) Glycerol anhydrous | Bio-Lab | 7120501 | |
| 2.32 g/L K2HPO4 | Spectrum chemical | P1383 | |
| 12.54 g/L KH2PO4 | Spectrum chemical | P1380 | |
| 50 µg/mL Ampicillin | Sigma | A9518 | |
| Stock solution of 100 mM Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) | INALCO | INA-1758-1400 | Filtered using 0.2 µm hydrophilic PVDF syringe filter. |
| Stock solution of 0.1 M dithiothreitol (DTT) | TCI | D1071 | Filtered using 0.2 µm hydrophilic PVDF syringe filter. |
| 10 mM Tris-acetate at pH = 7.4 | Sigma | T1503 | S30 lysate buffer (1.5 L) |
| 14 mM magnesium acetate | Merck | 1.05819.0250 | |
| 60 mM potassium acetate | Carlo Erba | 470147 | |
| 1 mM DTT | TCI | D1071 | |
| 0.5 mL/L 2-mercaptoethanol | Sigma | M6250 | |
| Equipment required for step 1 | |||
| 100 mL sterilized Erlenmeyer flasks | Thermo Scientific | 50-154-2846 | 2 flasks |
| 2 L sterilized Erlenmeyer flasks with baffles | KIMAX-KIMBLE | 25630 | 2 flasks |
| Floor incubator shaker | MRC | TOU-120-2 | Laboratory shaker incubator 450x450mm, 400rpm, 70 °C |
| Centrifuge | Thermo Scientific | 75004270 | (75003340) - Fiberlite F10-6 x 100 LEX Fixed-Angle Rotor. Should enable at least 13,000 x g. * Pre-cooled to 4 °C. |
| High pressure homogenizer | AVESTIN | EmulsiFlex-C3 | Pre-cooled to 4 °C. |
| -80oC freezer | SO-LOW | U85-18 | |
| Sterilized 1.5 mL plastic tubes | Eppendorf | 30120086 | Preferably pre-cooled to -20 °C. |
| Spectrophotometer | TECAN | IN-MNANO | Infinite M200 pro |
| 96-well transparent plate | Thermo Scientific | 167008 | |
| Sterilized graduated cylinder | Corning | ||
| Sterilized centrifuge tubes | Eppendorf | 30120086 | Preferably pre-cooled to -20 °C. |
| Sterilized pipette tips | Corning | Preferably pre-cooled to -20 °C. | |
| Crushed ice bucket | Bel-Art | M18848-4001 | |
| Small liquid nitrogen tank | NALGENE | 4150-4000 | |
| B. Reagents required for step 3 (lipids in oil solution preparation): | |||
| 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (POPC) | Lipoid | 556400 | Powder |
| Cholesterol | Sigma | C8667 | Powder |
| Chloroform | Bio-Lab | 3082301 | |
| Mineral oil | Sigma | M5904 | Light oil |
| Equipment required for step 2 | |||
| Vortex mixer | Scientific industries | SI-0256 | |
| Heating block | TECHNE | FDB03AD | Pre-heated to 80 °C. Should enable controlled temperature. |
| 2 mL screw neck glass vials | CSI Analytical Innovations | VT009M-1232 | For a larger scale, use 50 mL falcons and evaporate the chloroform using rotary evaporator. |
| 9mm Screw Cap | CSI Analytical Innovations | C395R-09LC | |
| C. Reagents required for step 3 (inner and feeding reaction mixtures): | |||
| HEPES | Spectrum | H1089 | 1 M HEPES-KOH (pH = 8) - pH buffer |
| Potassium hydroxide (KOH) | Frutarom | 55290 | |
| 1 M Magnesium acetate | Merck | 1.05819.0250 | Co-factor and negative charge stabilizor. |
| 1 M Potassium acetate | Carlo Erba | 470147 | Negative charge stabilizor. |
| 5.2 M Ammonium acetate | Merck | 1.01116.1000 | Stabilizes negative charge. |
| 50% (w/v) Polyethylene glycol 6000 (PEG) | Merck | 8.07491.1000 | Increases the concentration of the macromolecules. |
| 0.5 M 3-phosphoglycerate (3-PGA) | Sigma | P8877 | Secondary energy source. |
| 50 mM Amino acids mixture I | Sigma | LAA21-1KT | Amino acids additive. Contains: 50 mM of each of the following 17 natural amino acids - alanine, arginine, asparagine, aspartic acid, cysteine, glutamine, glutamic acid, glycine, histidine, isoleucine, leucine, lysine, methionine, proline, serine, threonine, and valine. |
| 50 mM Amino acids mixture II | Sigma | LAA21-1KT | Amino acids additive. Contains: 50 mM of each of the following 3 natural amino acids - tryptophan, phenylalanine, and tyrosine. |
| 100 mM Adenine triphosphate (ATP) | Sigma | A3377 | Nucleotides & energy source. |
| 50 mM Guanidine triphosphate (GTP) | Sigma | G8877 | Nucleotides & energy source. |
| 100 mM Uridine triphosphate (UTP) | ACROS ORGANICS | 226310010 | Nucleotides additive. |
| 100 mM Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) | INALCO | INA-1758-1400 | Genes expression induction. |
| 2 M Sucrose | J.T. Baker | 1933078 | Generating a density gradient. |
| 2 M Glucose | Sigma | 16301 | Generating a density gradient. |
| H2O UltraPure Water (UPW) | Bio-Lab | 2321777500 | DNase & RNase free |
| S30-T7 lysate | _ | _ | Prepared at step 1. Source of transcription & translation components. Store at -80 °c, thaw on crashed ice just before usage. |
| Stock of DNA plasmid of choice | _ | _ | Contains the sequence for the requested protein. Under T7 promotor |
| D. Equipment required for step 4 (synthetic cells preparation) | |||
| Floor incubator shaker or Thermomixer | MRC | TOU-120-2 | Laboratory shaker incubator 450x450mm, 400rpm, 70 °C |
| PHMT Grant Bio | PSC18 | Thermomixer | |
| Centrifuge | Thermo Scientific | 75004270 | (75003629) - TX-400 4 x 400mL Swinging Bucket Rotor. Suited for 15 mL sized tubes. Preferably swinging buckets. Should enable at least 1000 x g. Pre-cooled to 4 °C. |
| Table centrifuge | Thermo Scientific | 75002420 | (75003424) - 24 x 1.5/2.0mL rotor with ClickSeal. Suited for Eppendorf vials. Pre-cooled to 4 °C. |
| Vortex mixer | Scientific industries | SI-0256 | |
| Crushed ice bucket | Bel-Art | M18848-4001 | |
| 2 mL screw neck glass vials | CSI Analytical Innovations | VT009M-1232 | |
| Sterile 15 mL plastic tubes | Thermo Scientific | 339651 | |
| Sterilized 1.5 mL plastic tubes | Eppendorf | 30120086 | |
| Sterilized pipette tips | Corning | Sterilized by autoclave. |
References
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