Summary
En este artículo, describimos un protocolo detallado para el modelado eficiente del músculo de la distrofia muscular de Duchenne usando células derivadas de orina convertidas MYOD1para evaluar la restauración de los niveles de ARNm de distrofina y proteína según el exon.
Abstract
La distrofia muscular de Duchenne (DMD), una enfermedad muscular progresiva y mortal, es causada por mutaciones en el gen DMD que resultan en la ausencia de proteína distrofina. Hasta la fecha, hemos completado un estudio iniciado por el investigador primero en el ser humano en el Centro Nacional de Neurología y Psiquiatría basado en la inyección sistémica de los oligonucleótidos morpholino que son propensos a exon-53 saltarse. Para el tratamiento eficaz de DMD, se cree que las pruebas in vitro con mioblastos derivadas de pacientes con DMD para examinar los medicamentos y evaluar la elegibilidad del paciente antes de realizar ensayos clínicos son esenciales. Recientemente, informamos de una nueva célula derivada de orina (UDC) convertida en MYOD1tratada con el inhibidor de la histona metiltransferasa (hidrocloruro de 3-deazaneplanocina A), como modelo celular de DMD. La nueva UDC autóloga podría mostrar fenocopia de los fenotipos específicos de la enfermedad de DMD, lo que conduce a la aplicación de la medicina de precisión en una variedad de enfermedades relacionadas con el músculo. En este artículo, describimos un protocolo detallado para el modelado eficiente de células musculares DMD utilizando UCO convertidamy MYOD1junto con la reacción en cadena de la polimerasa de transcriptasa inversa (RT-PCR), la hincha occidental y la inmunocitoquímica para evaluar la restauración del ARNm de distrofina y los niveles de proteína después de saltar el exón.
Introduction
La distrofia muscular de Duchenne (DMD), una enfermedad muscular progresiva y mortal, es causada por mutaciones de cambio de trama en el gen DMD que resultan en la ausencia de proteína de distrofina1. Se cree que la terapia de salto de exón basada en oligonucleótidos antisentido es prometedora para la DMD. Esta terapia se basa en la conversión del fenotipo DMD más grave al fenotipo similar a la distrofia muscular de Becker más leve alterando el empalme pre-mRNA para restaurar el marco de lectura DMD 2. Recientemente hemos completado un estudio primero en humanos basado en la administración intravenosa repetida del olitolarsen de morpholino (PMO) fosfotolarsen fosfotomiada (PMO), que puede inducir a exon 53 a saltarse en DMD, y ha demostrado un excelente perfil de seguridad, eficacia prometedora y parámetros farmacocinéticos aceptables (registrados como UMIN: 000010964 y ClinicalTrials.gov: NCT02081625)3.
Sin embargo, para desarrollar tratamientos rentables y eficientes para la enfermedad, las pruebas in vitro con células musculares primarias obtenidas de pacientes con DMD son esenciales para la detección de fármacos y la verificación de elegibilidad del paciente antes de llevar a cabo ensayos clínicos, así como biomarcadores que reflejan la eficacia de las terapias de salto de exón durante los ensayos en humanos4. Recientemente, informamos de una tecnología novedosa para desarrollar células derivadas de orina (UDC)5,6, confines para elpaciente,como modelo de mioblasto primario de DMD7. MYOD1 Por lo tanto, para generar los mioblastos, sólo se requiere la recolección de orina de los pacientes y no se necesita ningún procedimiento invasivo. En este artículo, describimos un protocolo detallado para el modelado eficiente del músculo DMD utilizando UDU MYOD1-convertidos tratados con clorhidrato 3-deazaneplanocina A para evaluar el arnm de distrofina restaurado y la proteína después de saltar el exón.
Protocol
El Comité de ética del Centro Nacional de Neurología y Psiquiatría aprobó este estudio (ID de aprobación: A2017-018, A2018-029). Todas las personas dieron su consentimiento informado antes de proporcionar orina. Todos los experimentos se llevaron a cabo bajo las directrices y reglamentos pertinentes.
1. Aislamiento y cultura primaria de las UDC
NOTA: Los UDC se aislaron de acuerdo con un protocolo publicado anteriormente8,9,10 con algunas modificaciones.
- Recoger muestras de orina durante la micción espontánea en botellas de plástico esterilizadas.
NOTA: No es necesaria la esterilización del orificio uretral externo. La orina midstream es deseable para reducir el riesgo de contaminación viral. Si el tiempo de stock antes del siguiente procedimiento es >1 h, las muestras de orina deben transferirse a 4 oC para preservar la viabilidad celular. Sin embargo, se debe evitar una temperatura de <4 oC porque pueden aparecer precipitados insolubles. - Centrifugar toda la muestra de orina a 400 x g durante 10 min a temperatura ambiente.
- Aspirar el sobrenadante, dejando 1 ml en el tubo.
- Resuspenda los gránulos individualmente en el 1 ml restante de orina y luego córtelos en un solo tubo de 50 ml.
- Añadir 10 ml de tampón de lavado que consta de 99 ml de PBS sin calcio y magnesio, 1% penicilina/estreptomicina (P/S), 0,5 g/ml de anfotericina B, y centrifugar las muestras a 200 x g durante 10 min a temperatura ambiente.
- Aspirar el sobrenadante, dejando 0,2 ml en el tubo.
- Resuspender los gránulos celulares en 4,5 ml de medio primario compuesto por una mezcla 1:1 de medio águila modificado (DMEM) de alto nivel de glucosa sin piruvato sódico y mezcla de nutrientes F-12 de Ham complementado con factor de crecimiento epidérmico humano recombinante (EGF), insulina, hidrocortisona, epinefrina, T3, transferrina, 10% suero bovino fetal libre de tetraciclina (FBS), 1% P/S y 0,5 g/ml de anfotericina B.
- Semilla de las células en tres pocillos de seis placas de pozos recubiertos con gelatina (volumen total de cada pozo, 1,5 ml). Cultivo humidificado a 37oC y 5%CO2 durante 24 h.
- Añadir 1,5 ml del medio primario diariamente durante los próximos 3 días.
- En el día 4, sustituya el medio por 1,5 ml de medio de crecimiento complementado con EGF humano recombinante, insulina, hidrocortisona, epinefrina, T3, transferrina, 15% FBS libre de tetraciclina, 0,5% L-alanina-L-glutamina, 0,5% aminoácidos no esenciales, y 2,5 ng/mL factor de crecimiento fibroblasto básico (bFGF), factor de crecimiento derivado de plaquetas humana recombinante (PDGF), EGF, y 1% P/S.
- Cambie el medio de crecimiento cada dos días.
NOTA: Las colonias udC aparecen en una semana. - Cuando el cultivo de LA UDC se convierte en un confluente del 80 al 90 %, retire las células medianas y lave con PBS, divida todas las células usando 0.25% trypsin-EDTA y la semilla a 3.000-5.000 células/cm2 en una nueva placa de 60 mm recubierta de gelatina (pasaje 1).
NOTA: Los UDC se pueden almacenar en nitrógeno líquido. Los UDC se dividen generalmente en 60-70% de confluencia en el plato de cultivo de 60 mm en tres tubos de almacenamiento.
2. Construcción retroviral
- Amplificar la región de codificación de MYOD1 (NM_002478.4) plásmido por reacción en cadena de la polimerasa (PCR).
NOTA: La mezcla para la amplificación MYOD1 y las condiciones para el ciclor térmico se muestran en la Tabla 1 y la Tabla 2,respectivamente. - Detecte una sola banda de aproximadamente 1.000 bp de tamaño por 0.7% de electroforesis de gel de agarosa usando 1 l del producto PCR amplificado para confirmar que la secuencia MYOD1 se amplifica con éxito.
- Limpie el producto PCR utilizando el kit de limpieza y determine su concentración con un espectrofotómetro.
- Incubar la mezcla como se muestra en la Tabla 3 a 37 oC durante la noche para digerir el vector retroviral con un sistema Tet-on y un gen resistente a la puromicina en regiones orientadas a enzimas de restricción en el sitio de clonación múltiple.
- Detectar una sola banda en un 0,7% de electroforesis de gel de agarosa utilizando 1 l del producto digerido para confirmar que el vector retroviral se digerió con éxito.
- Limpie el producto digerido utilizando un kit de limpieza y determine su concentración por espectrofotómetro.
- Para clonar el fragmento amplificado myOD1 (producido por los pasos 2.1 a 2.3) en el vector retroviral digerido (producido por los pasos 2.4-2.6), realice una reacción de clonación en fusión. Configure la reacción como se muestra en la Tabla 4,incubar la reacción durante 15 minutos a 50 oC y, a continuación, colocar la reacción sobre hielo.
- Realizar la transformación utilizando células competentes de E. coli de acuerdo con las instrucciones del fabricante(Tabla de materiales).
- Seleccione las células competentes transformadas mediante el cultivo en una placa de cultivo LB que consta de 10 g/L de bacto trytoone, 5 g/L de extracto de levadura de bacto, 5 g/L NaCl, agar de bacto de 15 g/L y ampicilina de 50 mg/L.
- Recoger la colonia seleccionada y el cultivo en el medio de cultivo LB sin agar bacto a 200 rpm a 37 oC durante la noche.
- Purificar los vectores retrovirales insertados MYOD1utilizando un kit de purificación de plásmido(Tabla de Materiales)y cuantifique utilizando un espectrofotómetro.
- Confirme que MYOD1 se inserta correctamente en el vector retroviral mediante la secuenciación directa del producto PCR amplificado por las imprimaciones delanteras e inversas dirigidas respectivamente en ambos lados a través de la secuencia MYOD1 insertada.
NOTA: La secuencia MYOD1 se puede detectar intercalada entre secuencias vectoriales retrovirales cuando la clonación en fusión es correcta. - Para la producción retroviral, siembre las células de envasado a 50.000 células/cm2 en placas recubiertas de colágeno de 10 cm y cultivo en DMEM con 10% FBS humidificado a 37oC y 5% CO2 durante 24 h.
- Cuando las células de envasado proliferen al 80% de confluencia, mezcle 30 g de vectores retrovirales insertados myOD1,30 g de vectores de envasado y reactivo de transfección que contenga péptido de penetración celular(Tabla de materiales)por vórtice e incubarlos durante 10 minutos.
- Añadir la mezcla incubada al medio de las células de envasado y el cultivo humidificado a 37oC y 5%co2.
NOTA: El recubrimiento de colágeno es necesario. La transfección puede ser mejor a 24 horas o más después de la sembrada porque las células de embalaje se separan fácilmente de la placa de cultivo. - Después de 4 h o durante la noche, cambiar el medio a nuevo medio de crecimiento.
- Recoger el sobrenadante viral y reemplazar con medio fresco a 24 y 48 h después de la cotransfección y combinar el sobrenadante.
- Para concentrar el sobrenadante viral, mezcle con el reactivo concentrador e incubar a 37 oC durante la noche, luego centrífuga a 1.500 x g durante 45 min a 4 oC.
- Filtrar el sobrenadante del retrovirus a través de un filtro PVDF con poros de 0,45 m.
- Compruebe el mosaico del vector retroviral utilizando un kit de PCR cuantitativo y un sistema de ciclor térmico de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
- Divida el sobrenadante viral en pequeñas alícuotas y amediarlo a -80 oC.
3. Infección por MYOD1-vector retroviral en LAS UDC
- Sembrar los UDC a 3.000-5.000 células/cm2 en un plato de 60 mm recubierto de gelatina.
- Después de 24 h de sembrado, infectar el retrovirus desaliñado (paso 2.21) en una multiplicidad de infección de 200 mediante la adición de bromuro de hexadimetrina a una concentración de 8 g/ml.
- Después de una incubación de 24 h humidificada a 37oC y 5%co2,sustituya el medio de cultivo por un medio de crecimiento fresco que contenga 1 g/ml de puromicina para seleccionar las células transducidas por MYOD1. Cambia el medio cada dos días.
NOTA: Al seleccionar para células MYOD1-positivas, se suele utilizar 1 g/ml de puromicina para la selección. Se debe determinar la dosis adecuada. Utilice una placa que contenga células no transinfectadas y elija la dosis que mata todas las células en 3 o 5 días. MYOD1-las células positivas deben seleccionarse dentro de los 7 a 10 días después de agregar puromicina. Los UDC transducidos por MYOD1se pueden almacenar en nitrógeno líquido.
4. Diferenciación miogénica de LAS UDC transducidas MYOD1tratadas con clorhidrato 3-deazaneplanocina A (DZNep)
NOTA: Recientemente, se ha informado que DZNep, un inhibidor de la histona metiltransferasa, podría promover significativamente la expresión de MYOGENIN,uno de los factores reguladores musculares tardíos, y también conducir a la diferenciación de miotubos7.
- Placa MYOD1-UDCs transducidos en los pozos recubiertos de colágeno a una densidad de 3,5 x 104 células/cm2. Cultivo humidificado a 37oC y 5% CO2.
- Después de 24 h, cambiar el medio de crecimiento a un medio de diferenciación compuesto de DMEM de alta glucosa con L-alanina-L-glutamina, 5% de suero de caballo, suplemento ITS, 1 g/ml de doxiciclina y 5 M de DZNep.
NOTA: La solución DZNep de 10 mM se puede almacenar a -80 oC durante 3 meses. Utilice un congelador de descongelación y evite ciclos repetidos de congelación.congelación. Tanto MYOD1 activado por doxiciclina y DZNep suprimen la proliferación y promueven la diferenciación miogénica de las UDC. Por lo tanto, se recomienda añadir doxiciclina y DZNep después de la inducción de la diferenciación miogénica. DZNep promueve la diferenciación miogénica de los MYOD1-UDC de una manera dependiente de la dosis. Por otro lado, muestra citotoxicidad a una alta concentración. Por lo tanto, determinar la concentración adecuada de DZNep, que oscila entre 1 y 10 m dependiendo de sus efectos sobre la diferenciación miogénica y la biodisponibilidad celular. - Después de 3 días, cambie el medio de diferenciación a medio de diferenciación fresco sin DZNep. A continuación, cambie el medio cada 3 días.
NOTA: Los UDC se fusionan entre sí y forman miotubos dentro de las 1 a 2 semanas después de la diferenciación.
5. Exon saltando en MYOD1-UDCs convertidos
NOTA: Aquí, se describen tres protocolos para evaluar la omisión de exón en células derivadas del paciente: 1) reacción en cadena de la transcriptasa polimerasa inversa (RT-PCR) de mRNA de distrofina; 2) semicuantificación de la señal de proteína distrofina restaurada por la mancha occidental; y 3) semicuantificación de la señal de fluorescencia distrofina restaurada por inmunocitoquímica. Todos los métodos pueden detectar saltos de exón de una manera dependiente de la dosis.
- Evaluación de exon saltando eficiencia por RT-PCR
- Para transfectar oligonucleótido antisentido (ASO) en UCC myOD1-convertidas de dMM en el día 7 después de la diferenciación, mezclar ASO, reactivo de transfección(Tabla de materiales),y medio de diferenciación a una concentración final de 1-10 m. Cultivo humidificado a 37 oC y 5% de CO2.
- Después de 72 h de incubación con ASO, cambie el medio a nuevo medio de diferenciación sin ASO.
- A partir de 3 a 7 días después de la transfección de ASO, eliminar el medio de diferenciación y lavar 1x con PBS. Agregue el tampón de lisis celular, lise los UDC y cosecha el ARN total usando un kit de extracción de ARN.
- Mida la concentración de ARN con un espectrofotómetro.
- Combine los reactivos necesarios para la reacción RT-PCR de un solo paso en tubos PCR según la Tabla 5.
- Coloque los tubos PCR con la mezcla en un termociclador. Ejecute el termociclador, según la Tabla 6.
- Realice la electroforesis de microchip y calcule la eficiencia de salto del exón utilizando la concentración molar como se indica a continuación.
Exon saltando eficiencia (%) - banda omitida / (banda omitida + banda no omitida) x 100
NOTA: Almacene el producto PCR en un refrigerador a 4 oC para almacenamiento a corto plazo o a -20 oC para almacenamiento a largo plazo.
- Detección de distrofina después de exon saltar por la hincha occidental
- Transfect ASO y cultivo MYOD1-UDCs según los pasos 5.1.1 y 5.1.2.
- Cambie el medio cada 3 días.
- Después de 2 semanas de diferenciación, extraiga la proteína total de las células cultivadas utilizando el ensayo de radioinmunoprecipitación (RIPA) tampón que contiene inhibidores de la proteasa.
- Sonicar los lysates sobre hielo y centrifugar a 14.000 x g durante 15 min a 4oC.
- Recoger el sobrenadante y determinar las concentraciones de proteínas utilizando un kit de ensayo de proteína BCA.
- Añadir 15 g de proteína total en un tubo de 0,5 ml y diluir añadiendo el tampón ripales que contiene inhibidores de la proteasa a un volumen total de 10 l. Ejecutar 15 g de proteína total por carril.
- Agregue el tampón de muestra, el agente reductor y el agua desionizada como se muestra en la Tabla 7. Desnaturaliza la célula se lisa a 70oC durante 10 min.
- Preparar el tampón de carrera de tris-acetato que contiene 8,95 g/L de tricina, 6,06 g/L tris base, 1,0 g/L de dodecilo sódico (SDS).
- Cargue la muestra (20 l) en un gel de tris-acetato de 3 x 8% y realice la electroforesis a 150 V durante 75 min.
- Prepare el tampón de hincha sin metanol.
- Remoje la membrana PVDF durante 20 s en metanol y luego en el tampón de hinchazón hasta su uso (al menos 10 min). Cortar la membrana PVDF a un tamaño de 6 x 8 cm utilizando mini geles y 8 x 12 cm usando geles midi.
- Corte los papeles de hinchazón al mismo tamaño que el de la membrana PVDF y remoje los que están en el tampón de hinchazón hasta su uso.
- Después de la electroforesis, corte el gel al mismo tamaño que el de la membrana PVDF y remoje el gel en agua destilada.
- Coloque los papeles de hinchazón, la membrana PVDF y el gel en el aparato de transferencia semiseca(Figura 1). Traslado a 4 mA/cm2 durante 30 min.
- Enjuague la membrana 2x con agua destilada.
- Preparar anticuerpos antidistrofina (1:500) y anti-tubulina (1:1,200) como anticuerpos primarios.
- Preparar anticuerpos antiratón conjugados con HRP (1:100) como anticuerpo secundario.
- Incubar las membranas con los anticuerpos primarios, lavar con tampón de lavado, luego incubar con el anticuerpo secundario utilizando un dispositivo automatizado de procesamiento occidental(Tabla de materiales)a temperatura ambiente.
NOTA: El anticuerpo anti-tubulina se utiliza generalmente como control de carga. Las soluciones mixtas de anticuerpos primarios, incluyendo 1:500 anti-distrofina y anticuerpos anti-1.200 anti-a-tubulina funcionan bien cuando la reacción de anticuerpos se realiza simultáneamente. - Enjuague la membrana en agua destilada.
- Detecte las proteínas utilizando un reactivo de detección quimioluminiscente y un imager basado en cámara de dispositivo acoplado a carga (CCD).
- Analice los datos utilizando el software adecuado.
- Detección de distrofina después de saltar sesalten exon por inmunocitoquímica
- Reprogramar directamente los UDC en los miotubos en placa de 96 pocillos recubiertos de colágeno de acuerdo con los pasos 4.1 a 4.3.
- Transfect el ASO y la cultura MYOD1-UDCs según los pasos 5.1.2 y 5.1.3.
- Después de 2 semanas de diferenciación, lave las células con PBS y repárelas en un 4% de paraformaldehído durante 10 min a 4oC.
- Permeabilizar MYOD1-UDCs en 0,1% detergente no iónico durante 10 min a temperatura ambiente y bloquear aquellos con 10% de suero de cabra durante 15 min a 37 oC.
- Incubar las células con un anticuerpo primario durante la noche a 4oC.
- Lavar las células con PBS e incubar aquellas con el anticuerpo secundario durante 30 minutos a temperatura ambiente.
NOTA: Aquí, el ratón anti-distrofina (1:30) se utiliza como anticuerpo primario, el IgG antiratón se utiliza como anticuerpo secundario, y Hoechst (1:10,000) se utiliza para la tinción de núcleos. - Imagen de las placas utilizando un microscopio fluorescente y utilice un analizador para semicuantificar la señal de fluorescencia automáticamente en cada pozo bajo la misma condición.
Representative Results
Podríamos recoger las UDC de manera fácil y no invasiva. Los UDC formaron colonias una semana después de comenzar el cultivo celular primario, observamos una marcada capacidad proliferativa. El cultivo de las UDC era sencillo, y la contaminación bacteriana o fúngica era poco frecuente cuando el procedimiento se realizaba correctamente.
La Figura 2 muestra imágenes representativas de contraste de fase de la colonia UDC una semana después del cultivo primario(Figura 2A)y MYOD1-UDC sa una semana después de la diferenciación (Figura 2B). La Figura 3 muestra la detección exitosa de exon saltando en UDCs obtenidos de pacientes DMD por RT-PCR. La Figura 3A muestra el análisis RT-PCR de la distrofina después del tratamiento con oligonucleótidos antisentido en MYOD1-UDCs tratados con DZNep derivados de un macho de 6 años con una deleción de 45-54 exón en el gen DMD. El marco de lectura abierto fue restaurado por exón 44 saltando. El día 14 después de la diferenciación, confirmamos la inducción del exón saltando de una manera dependiente de la dosis(Figura 3B). Las bandas superiores denotan productos nativos, y las bandas inferiores denotan productos exon 44-skipped que restauraron el marco de lectura abierto.
La Figura 4 muestra la detección exitosa de distrofina después de saltar exon en los UDC obtenidos de pacientes con DMD por la hincha occidental de una manera dependiente de la dosis. También detectamos la expresión de distrofina restaurada utilizando inmunocitoquímica(Figura 5). Medimos las intensidades de la distrofina con un microscopio fluorescente 1 semana después de la transfección de oligonucleótido antisentido (ASO) en una placa de 96 pocillos(Figura 5A). Se observaron señales fluorescentes notablemente más altas en MYOD1-UDCs tratados con ASO que en MYOD1-UDCtratados con ASO de control(Figura 5B).
Estos resultados sugieren que nuestro nuevo ensayo puede evaluar la omisión de exón de manera eficiente en MYOD1-UDCs obtenidos de pacientes con DMD a nivel de ARNm y proteína.
Figura 1: Representación esquemática de la pila de transferencia para la mancha occidental semiseca. Dos papeles empapados en el tampón de hinchas fueron colocados en la terminal negativa, y dos papeles empapados en el buffer fueron apilados encima de esto. El gel, que ha sido empapado en el tampón, se colocó suavemente sobre la membrana PVDF. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Imágenes representativas de las UDC. (A) Imagen de contraste de fase de los UDC una semana después del cultivo primario. Barra de escala a 200 m. Inset: Una imagen ampliada del área en el rectángulo blanco. (B) Imagen de contraste de fase de MYOD1-UDCs una semana después de la diferenciación. Barra de escala a 50 m. Esta cifra ha sido modificada de Takizawa et al.7. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Evaluación exitosa de exons omitiendo en células derivadas de orina (UDC) obtenidas de pacientes con DMD por RT-PCR. (A) Análisis RT-PCR de distrofina después del tratamiento con oligonucleótidos antisentido en clorhidrato de 3-deazaneplanocina A (DZNep) TRATADO con MYOD1-UDCs derivados del paciente con distrofia muscular de Duchenne (DMD) con una deleción de exón 45-54. Los MYOD1-UDC tratados con DZNep también se trataron con el antisentido de control a una concentración de 1-10 M como controles. Las bandas superiores eran productos sin esquiar (ex eliminación de 45-54) que permanecían fuera del marco de lectura. Las bandas inferiores eran los productos exon 44-skipped (Ex 44-54 deletion y Ex 44 omitido) que restauraban el marco de lectura abierto. (B) La eficiencia de omisión se calculó como (exon 44-skipped transcript molarity)/(native + exon 44-skipped transcript molarity [marcado con flechas]) x 100% utilizando un sistema de electroforesis de microchip. Se utilizó a ANOVA unidireccional seguido de la prueba post hoc de Bonferroni para comparar las eficiencias de omisión (n .3 para cada grupo, ****P < 0.0001). Los datos se expresan como la media de SEM. Esta cifra ha sido modificada de Takizawa et al.7. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Evaluación exitosa de exons omitiendo en células derivadas de orina (UDC) de pacientes con DMD por western blot. (A) Mancha occidental representativa para la distrofina en MYOD1 -UDCstratados con DZNep del paciente con DMD con una deleción del exón 45-54 después de saltar al exón 44. Para la detección de distrofina, se utilizó anti-distrofina (contra C-terminal). (B) Las intensidades relativas de las bandas normalizadas a la expresión de la tubulina se compararon en células derivadas del paciente con y sin tratamiento de oligonucleótidos antisentido mediante la realización de ANOVA unidireccional seguido de la prueba post hoc de Bonferroni (n x 3 para cada grupo, **P < 0,01, ***P < 0,001, HI - individuo sano). Esta cifra ha sido modificada de Takizawa et al.7. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Mapas térmicos de inmunocitoquímica para distrofina después del tratamiento con oligonucleótidos antisentido en MYOD1tratado con DZNep obtenidos del paciente con DMD con deleción de exón 45-54. (A) La eliminación del exón 45-54 restauró el marco de lectura abierto basado en la omisión exón del exón 44. (B) La intensidad de la señal se cuantificó utilizando un microscopio fluorescente después de 1 semana de transfección de oligonucleótidos antisentido en una placa de 96 pocillos. Para la comparación se utilizó aaNOVA unidireccional, seguida de la prueba post hoc de Bonferroni (n .3-4 para cada grupo, ****P < 0.0001). Esta cifra ha sido modificada de Takizawa et al.7. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Reactivo | Volumen | Concentración final |
| 2x premezcla de PCR | 12,5 l | 1x |
| Imprimación delantera | 5 pmol | 0,2 M |
| Imprimación inversa | 5 pmol | 0,2 M |
| Plantilla | 80 ng | |
| Agua destilada esterilizada | hasta 25 l | |
| Volumen total por reacción | 25 l |
Tabla 1: Mezcla para amplificación MYOD1 por RT-PCR.
| 98 oC | 10 s | |
| 55 oC | 10 s | • 35 ciclos |
| 72 oC | 10 s |
Tabla 2: Condiciones para el ciclor térmico para amplificación MYOD1.
| Reactivo | Volumen |
| 10x K buffer | 2 l |
| Vector retroviral (500 ng/L) | 2 l |
| Enzima de restricción 1 (2-15 U) | 1 L |
| Enzima de restricción 2 (2-15 U) | 1 L |
| Agua destilada esterilizada | 14 l |
| Volumen total | 20 l |
Tabla 3: Mezcla de un tubo para digerir el vector retroviral.
| Reactivo | Volumen |
| Fragmento MYOD1 purificado | 100 ng |
| Vector retroviral digerido | 100 ng |
| 5x Premezcla de enzimas | 4 l |
| Agua destilada esterilizada | hasta 20 l |
| Volumen total | 20 l |
Tabla 4: Mezcla para la reacción de clonación en fusión.
| Solución | Volumen/Reacción (L) | Concentración final |
| Agua libre de RNase | Variable | - |
| Búfer RT-PCR de un solo paso | 4 | 1x |
| mezcla dNTP (que contiene 10 mM de cada dNTP) | 0.8 | 400 mM de cada dNTP |
| Imprimación delantera (10 mM) | 1.2 | 0,6 mM |
| Imprimación inversa (10 mM) | 1.2 | 0,6 mM |
| Mezcla de enzimas RT-PCR de un solo paso | 0.8 | - |
| Inhibidor de la RNase (opcional) | Variable | 5 x 10 unidades/reacción |
| ARN de plantilla | 50-400 ng | |
| Volumen total | 20 |
Tabla 5: Compuestos necesarios para una reacción del RT-PCR de un solo paso.
| 1 ciclo | Transcripción inversa | 30 min | 50 oC |
| 1 ciclo | Paso inicial de activación de PCR | 15 min | 95 oC |
| 1 ciclo | Desnaturalización | 1 min | 94 oC |
| Recocido | 1 min | 60 oC | |
| Extensión | 1 min | 72 oC | |
| 1 ciclo | Extensión final | 7 min | 72 oC |
| Mantener | ∞ | 4 oC |
Tabla 6: Condición del ciclor térmico para RT-PCR de un solo paso.
| Reactivo | Volumen |
| Proteína (15 g) | 10 l |
| Búfer de muestra (4x) | 5 l |
| Agente reductor (10x) | 2 l |
| Agua desionizada | 3 L |
| Volumen total | 20 l |
Tabla 7: Preparación de muestras para electroforesis de gel de poliacrilamida de dodecilo sulfato sódico (SDS-PAGE).
Discussion
Aquí, describimos un protocolo detallado de exon saltando en MYOD1-UDCs convertidos obtenidos de pacientes con DMD. Usando el sistema de ensayo, analizamos las secuencias óptimas antisentido de manera eficiente. Suponemos que las UDC convertidas MYOD1pueden ser útiles para la investigación de la fisiopatología de la enfermedad.
La evaluación de exons omitiendo el uso de células derivadas del paciente a nivel de ARNm es indispensable para la detección de nuevos fármacos y la evaluación de la elegibilidad del paciente antes de realizar ensayos clínicos. El cálculo de la eficiencia de salto de exón sólo se puede evaluar a nivel de ARNm.
La evaluación de la omisión de exón a nivel proteico también es importante porque la restauración de la distrofina es importante como biomarcador sustituto para predecir los beneficios de saltar exon. Hasta la fecha, el cribado de secuencias de oligonucleótidos antisentido a menudo se realiza utilizando líneas celulares musculares primarias o líneas celulares de mioblasto inmortalizadas incluyendo células humanas de rabdomiosarcoma (RD), pero no podemos medir la recuperación de los niveles de distrofina utilizando líneas celulares musculares o líneas celulares RD porque expresan esta proteína endógenamente. Podemos detectar claramente la restauración de la distrofina en MYOD1-UDCs derivados del paciente DMD de una manera dependiente de la dosis. En nuestro nuevo ensayo, consideramos que la evaluación de la proteína restaurada por la hincha occidental es superior en cuantificabilidad. Por otro lado, la evaluación por inmunocitoquímica utilizando 96 placas de pozo es ideal para la detección de muchos compuestos candidatos simultáneamente.
En este artículo, describimos un protocolo detallado para un músculo DMD de modelado eficiente usando UDU convertida MYOD1junto con RT-PCR, blotting occidental e inmunocitoquímica para evaluar la distrofina restaurada en los niveles de ARNm y proteínas después de saltar exon. Los UDC se pueden recolectar de forma no invasiva y fácil. Por lo tanto, suponemos que el nuevo ensayo in vitro se puede aplicar a una amplia gama de estudios básicos y traslacionales independientemente del tipo de trastornos musculares.
Disclosures
El Centro Nacional de Neurología y Psiquiatría está desarrollando NS-065/NCNP-01, un exón 53 saltando la droga para DMD, con Nippon Shinyaku Co., Ltd.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por la Sociedad Japonesa para la Promoción de la Ciencia En Ayuda para la Investigación Científica (C) [concesión no 18K07544 a Y.A.], Subvenciones para la investigación sobre trastornos nerviosos y mentales [concesión No. 28-6 a Y.A.], y la Agencia Japonesa de Investigación y Desarrollo Médico [conceder nos. 18ek0109239h0002, 18lm0203066h0001, y 18lm0203069h0001 a Y.A.].
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1% P/S Solution Stabilized | Thermo Fisher | 15070-063 | Cell culture |
| Amphotericin B | Sigma Aldrich | A2942 | |
| Anti-dystrophin | Abcam | ab15277 | Western blot (WB) |
| Anti-dystrophin | Leica | NCL-DYS1 | Immunocytochemistry(ICC) |
| Anti-mouse IgG, Dylight 488 | Vector Laboratories | DK-2488 | ICC |
| Anti-α-tubulin | Sigma | T6199 | Western bot and ICC |
| BZ-X800 | KEYENCE | BZ-800 | Fluorescent microscope |
| CELLBANKER | ZENOAQ | CB011 | Cell stock in liquid nitrogen |
| ChemiDoc MP Imaging System | Bio-Rad | 170-8280J1 | WB |
| CloneAmp HiFi PCR premix | Clontech | 639298 | Retroviral production |
| cOmplete Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 4693116001 | Protein extraction for WB |
| E.coli DH5 α Competent Cells | TAKARA | 9057 | |
| ECL Prime Western Blotting Detection Reagent | GE healthcare | RPN2232 | WB |
| EGF | Peprotech | AF-100-15 | Cell culture |
| Endo-Porter | GeneTools | 2922498000 | ASO transfection |
| Extra Thick Blot Filter Paper | Bio-Rad | 1703965 | WB |
| EzFastBlot HMW | Atto | AE-1460 | WB |
| fibroblast growth factor-basic | Sigma-Aldrich | F0291 | Cell culture |
| Glutamax | Thermo Fisher Scientific | 35050-061 | Cell culture |
| GP2-293 packaging cells | Clontech | 631458 | Retroviral production |
| Ham's F-12 Nutrient Mix | Thermo Fisher Scientific | 11765-054 | Cell culture |
| High glucose DMEM with GlutaMAX-I | Thermo Fisher Scientific | 10569-010 | Cell culture |
| High glucose DMEM without sodium pyruvate | GE Healthcare | SH30022.01 | Cell culture |
| HiSpeed Plasmid Purification Kit | QIAGEN | 12643 | Retroviral production |
| Histofine Simple Stain MAX PO | NICHIREI BIOSCIENCE INC. | 424151 | WB |
| Hoechst 33342 | Thermo Fisher Scientific | H3570 | ICC |
| Human PDGF-AB | Peprotech | 100-00AB-10UG | Cell culture |
| iBind Flex Solution | Thermo Fisher Scientific | SLF2020 | WB |
| iBind Flex Western Device | Thermo Fisher Scientific | SLF2000 | WB (Automated mestern-processing device) |
| Immobilon-P Transfer Membrane (PVDF) | MERCK | IPVH304F0 | WB |
| In-Fusion HD cloning Kit | Clontech | 639648 | Retroviral production |
| ITS Liquid Media Supplement | Sigma-Aldrich | I3146 | Cell culture |
| MILTEX HV 0.45 μm filter | MERCK | SLHV033RS | Retroviral production |
| MultiNA | SHIMADZU | MCE-202 | Microchip electrophoresis |
| MYOD1 (GFP-tagged) | ORIGENE | RG209108 | Retroviral production |
| NanoDrop | Thermo Fisher | ND-ONE-W | Spectrophotometer |
| Nonessential amino acids | Thermo Fisher | 11140-050 | Cell culture |
| NucleoSpin Gel and PCR Clean-Up Kit | Clontech | 740986.20 | PCR clean up |
| NuPAGE 3-8% Tris-Acetate Protein Gels | Invitrogen | EA03785BOX | WB |
| NuPAGE Antioxidant | Invitrogen | NP0005 | WB |
| NuPAGE LDS Sample Buffer | Invitrogen | NP0007 | WB |
| NuPAGE Sample Reducing Agent | Invitrogen | NP0009 | WB |
| NuPAGE Tris-Acetate SDS Running Buffer | Invitrogen | LA0041 | WB |
| One Step TB Green PrimeScript RT-PCR Kit | TAKARA | RR066A | Titer check of retroviral vector |
| PBS | Thermo Fisher Scientific | 14190-250 | Cell culture |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23227 | WB |
| Polybrene Infection / Transfection Reagent | Sigma-Aldrich | TR-1003 | Retroviral infection |
| pRetroX-TetOne-Puro Vector | Clontech | 634307 | Retroviral vecor |
| Puromycin | Clontech | 631305 | Cell culture |
| QIAGEN OneStep RT-PCR Kit | Qiagen | 210212 | PCR |
| REGM Bullet Kit | Lonza | CC-3190 | Material for growth medium of UDCs |
| REGM SingleQuots | Lonza | CC-4127 | Material for primary medium of UDCs |
| Retrovirus Titer Set | TAKARA | 6166 | Titer check of retroviral vector |
| Retro-X Concentrator | Clontech | 631455 | Retroviral production |
| RIPA buffer | Thermo Fisher Scientific | 89901 | WB |
| RNeasy kit | Qiagen | 74104 | RNA extraction for PCR |
| Tetracycline-free foetal bovine serum | Clontech | 631106 | Cell culture |
| Triton-X | MP Biomedicals | 9002-93-1 | ICC |
| Trypsin-EDTA (0.05%) | Gibco | 25300054 | Cell culture |
| XCell SureLock Mini-Cell | Invitrogen | EI0001 | WB |
| Xfect transfection reagent | Clontech | 631317 | Transfection of plasmids into packaging cells |
References
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